游动放线菌合成阿卡波糖突变体及重组菌构建方法与应用

本发明涉及生物代谢工程领域，具体为游动放线菌合成阿卡波糖突变体及重组菌构建方法与应用。

背景技术：

1、阿卡波糖是一种由游动放线菌生产的假四糖类次级代谢产物，用于ⅱ型糖尿病的临床治疗，其通过可逆性地抑制肠道α-葡萄糖苷酶活性，延缓碳水化合物的消化和吸收，从而降低餐后血糖。随着对阿卡波糖需求量的增长，利用游动放线菌特别是原始菌株

actinoplanes sp.se50及其衍生菌株进行工业化发酵生产成为了主要途径。阿卡波糖的生物合成涉及复杂的代谢前体供应和调控网络，需要多种酶的协同参与以完成目标产物的合成与积累。

2、针对游动放线菌这种代谢途径复杂的生产菌株，诱变育种和基因工程改造是获得高产突变菌株的常用手段。大气压室温等离子体诱变技术因其操作特点被应用于微生物育种中。同时，阿卡波糖的生物合成基因簇已经被解析，利用基因重组技术对相关酶的表达基因进行操作也是育种的常规方向。在后续的发酵生产阶段，本领域通常采用常规的培养基和基础发酵参数来维持菌株的生长，以期获得目标代谢产物。

3、但是，现有的阿卡波糖发酵生产过程存在一些缺陷。游动放线菌在发酵过程中易积累副产物，增加了后续产物提取的难度，并且合成途径中相关酶的催化连接反应效率有限，影响了阿卡波糖的最终纯度与产量。此外，常规的大气压室温等离子体诱变面临着筛选正向突变株效率较低的情况，获得的突变株以及经过质粒重组改造后的菌株在连续培养中容易出现基因结构不稳定的现象。同时，常规的发酵工艺难以结合菌株内部的基因改造特征在发酵周期的中途提供合适的碳源补充，限制了阿卡波糖的合成进程。因此，构建一株遗传结构稳定、发酵副产物少、阿卡波糖纯度与产量高的重组菌，并提供相匹配的发酵工艺，是本领域需要解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了游动放线菌合成阿卡波糖突变体及重组菌构建方法与应用，解决了现有游动放线菌在发酵生产阿卡波糖的过程中存在的副产物易积累导致提取困难、合成途径催化效率不足导致产量与纯度偏低，以及菌株遗传性状不稳定和发酵补料工艺不匹配的问题。

2、为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

3、本发明第一方面提供游动放线菌合成阿卡波糖重组菌，采用如下的技术方案：

4、游动放线菌合成阿卡波糖重组菌，所述游动放线菌合成阿卡波糖重组菌采用高产阿卡波糖突变株作为受体细胞、内部敲除了

trey基因且过表达了

acbs基因；其中，所述高产阿卡波糖突变株为原始菌株

actinoplanes sp.se50/110经诱变处理及筛选获得的突变株。

5、通过采用上述技术方案，由于采用所述高产阿卡波糖突变株作为受体细胞，为所述阿卡波糖的合成提供了较多的前体物质；进一步地，通过敲除所述

trey基因，阻断了发酵过程中竞争性副产物的合成路径，消除了副产物的积累，明显降低了下游产物分离纯化的难度；同时，通过过表达所述

acbs基因，提高了胞内4-氨基-4,6-双脱氧葡萄糖与ndp-缬氨醇发生连接反应的催化能力。因此，获得明显提升产物纯度和产量的所述游动放线菌合成阿卡波糖重组菌。

6、优选的，所述

trey基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述

acbs基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

7、通过采用上述技术方案，由于限定了所述

trey基因和所述

acbs基因的具体序列，保证了基因同源重组敲除以及外源基因克隆过表达操作的精准性，避免了非特异性靶点的错配或脱靶效应，提高了所述游动放线菌合成阿卡波糖重组菌遗传改造的稳定性。

8、优选的，所述游动放线菌合成阿卡波糖重组菌内部含有驱动所述

acbs基因过表达的强启动子，所述强启动子选自p

ermf*、p

kasop*或p

stnyp*。

9、通过采用上述技术方案，由于采用所述强启动子驱动所述

acbs基因，能够在所述游动放线菌细胞内持续启动所述

acbs基因的转录过程，弥补了天然自身启动子转录活性的不足，明显提高细胞内连接酶的含量，从而提升碳源向所述阿卡波糖转化的代谢通量。

10、优选的，所述高产阿卡波糖突变株为所述原始菌株

actinoplanes sp.se50/110经大气压室温等离子体诱变和链霉素抗性筛选获得的具有遗传稳定性的突变株。

11、通过采用上述技术方案，结合了大气压室温等离子体诱变的处理方式，并联合特定浓度的链霉素施加筛选压力，利用抗性基因突变伴随次级代谢产物合成途径被激活的生物学机制，实现了对所述原始菌株胞内代谢网络的优化，筛选出的所述高产阿卡波糖突变株的产素能力明显提升且遗传性状稳定。

12、本发明第二方面提供游动放线菌合成阿卡波糖重组菌的构建方法，采用如下的技术方案：

13、包括以下步骤：将原始菌株

actinoplanes sp.se50/110进行诱变处理及筛选，获得高产阿卡波糖突变株；采用所述高产阿卡波糖突变株作为受体细胞，利用

trey基因敲除载体进行同源重组敲除

trey基因，得到敲除了

trey基因的重组菌；将编码

acbs基因的核苷酸序列连接至表达载体获得

acbs过表达载体，并将所述

acbs过表达载体导入所述敲除了

trey基因的重组菌中，得到游动放线菌合成阿卡波糖重组菌。

14、通过采用上述技术方案，由于提供了包含受体细胞筛选、副产物合成通路阻断和目标产物合成通路强化的构建方法，规范了所述重组菌改造的先后顺序，能够叠加各项操作的有益效果，稳定地构建出所述游动放线菌合成阿卡波糖重组菌。

15、优选的，所述将原始菌株

actinoplanes sp.se50/110进行诱变处理及筛选的具体过程为：取所述原始菌株

actinoplanes sp.se50/110的孢子悬液涂布于无菌金属载片上，在入射功率为120w、氦气流量为10l/min、辐照距离为2mm、等离子体温度低于40℃的条件下，利用大气压室温等离子体处理120s，得到经过诱变处理的孢子悬液；将所述经过诱变处理的孢子悬液洗脱并涂布在含有链霉素的培养基上进行培养，初筛出含有链霉素的培养基上生长的菌落，其中，所述含有链霉素的培养基中链霉素的浓度为0.10μg/ml。

16、通过采用上述技术方案，限定了诱变过程的各项处理参数，在维持孢子结构完整性的前提下引发dna错配与重组；配合浓度为0.10μg/ml的链霉素平板进行筛选，既排除了假阳性生长，又筛选得到由于相关蛋白位点突变而带来次级代谢产物合成增加的克隆，提高了所述高产阿卡波糖突变株的筛选效率。

17、优选的，所述利用

trey基因敲除载体进行同源重组敲除

trey基因的具体过程为：采用温敏型质粒pkc1139作为骨架构建

trey基因敲除载体；将所述

trey基因敲除载体通过接合转移导入所述高产阿卡波糖突变株中，经同源重组和筛选获得所述敲除了

trey基因的重组菌。

18、通过采用上述技术方案，由于利用了所述温敏型质粒pkc1139的温度敏感复制特性，通过调节培养温度诱导所述

trey基因敲除载体在宿主染色体上发生单交换整合与双交换剔除，实现了所述

trey基因的敲除，避免了抗性标记基因残留对所述高产阿卡波糖突变株造成的代谢负担，便于后续遗传改造操作。

19、优选的，所述将编码

acbs基因的核苷酸序列连接至表达载体获得

acbs过表达载体并将所述

acbs过表达载体导入所述敲除了

trey基因的重组菌中的具体过程为：将编码

acbs基因的核苷酸序列连接至作为所述表达载体的整合型质粒pset152，采用强启动子构建所述

acbs过表达载体；采用

escherichia coli et12567作为接合转移供体菌，将所述

acbs过表达载体转入所述敲除了

trey基因的重组菌中。

20、通过采用上述技术方案，由于选用了作为所述表达载体的整合型质粒pset152，能够将所述

acbs基因整合至染色体的特定位点并稳定遗传，避免了发酵过程中游离质粒丢失的情况；同时采用所述

escherichia coli et12567作为接合转移供体菌，规避了限制修饰系统对外源dna的降解作用，明显提高了所述

acbs过表达载体接合转移的效率。

21、优选的，所述采用

escherichia coli et12567作为接合转移供体菌，将所述

acbs过表达载体转入所述敲除了

trey基因的重组菌中的具体操作为：将所述接合转移供体菌与作为受体细胞的所述敲除了

trey基因的重组菌按照10:1的比例混合，在30℃的条件下培养4至5天进行接合转移。

22、通过采用上述技术方案，限定了所述接合转移供体菌与受体细胞之间按照10:1的混合比例，并限定了培养时间与温度，保证所述接合转移供体菌能够充分接触所述受体细胞，形成细胞间物理接触，保证了所述

acbs过表达载体的有效导入。

23、本发明第三方面提供游动放线菌合成阿卡波糖重组菌在发酵合成阿卡波糖中的应用，采用如下的技术方案：

24、将所述游动放线菌合成阿卡波糖重组菌接种于发酵培养基中，在温度28℃、摇床转速220rpm、ph6.4至6.7的条件下进行发酵；发酵至48h时，补加质量百分比为3%的葡萄糖和麦芽糖混合物进行补料分批发酵，总发酵周期维持7天，提取得到富含阿卡波糖的发酵产物。

25、通过采用上述技术方案，限定了发酵条件，前期的温度及摇床转速参数保证了菌株的有效扩增；在发酵至48h时补加所述葡萄糖和麦芽糖混合物，解除了底物抑制效应，同时麦芽糖作为所述阿卡波糖合成的糖基受体，配合所述游动放线菌合成阿卡波糖重组菌内部的酶催化网络以及所述

trey基因敲除后无副产物竞争的代谢环境，驱动底物发生缩合反应，明显提升了所述阿卡波糖的产量及提取纯度。

26、本发明提供了游动放线菌合成阿卡波糖突变体及重组菌构建方法与应用。具备以下有益效果：

27、1、本发明通过采用高产阿卡波糖突变株作为受体细胞、内部敲除

trey基因且过表达

acbs基因，利用敲除

trey基因减少了发酵过程中的副产物积累以降低后续提取难度，同时利用

acbs基因过表达催化4-氨基-4,6-双脱氧葡萄糖与ndp-缬氨醇的连接反应，最终提高了游动放线菌合成阿卡波糖重组菌发酵合成阿卡波糖的纯度与产量。

28、2、本发明通过对原始菌株

actinoplanes sp.se50/110进行大气压室温等离子体诱变和链霉素抗性筛选获得具有遗传稳定性的高产阿卡波糖突变株，并在构建过程中采用温敏型质粒pkc1139进行同源重组敲除

trey基因以及将编码

acbs基因的核苷酸序列连接至整合型质粒pset152进行表达，保证了游动放线菌合成阿卡波糖重组菌基因结构的稳定性。

29、3、本发明通过将游动放线菌合成阿卡波糖重组菌接种于发酵培养基中进行发酵，并在发酵过程的中途补加葡萄糖和麦芽糖混合物进行补料分批发酵，利用葡萄糖和麦芽糖混合物配合游动放线菌合成阿卡波糖重组菌内部的基因改造特征促进了合成进程，满足了重组菌在总发酵周期内对碳源的需求，最终能够有效提取得到富含阿卡波糖的发酵产物。