米易鸡匍匐性状及早期胚胎致死的分子标记与应用的制作方法

本发明涉及基因工程及鸡遗传育种领域，具体涉及一种可鉴定米易鸡匍匐性状及早期胚胎致死的双基因缺失分子标记与应用。

背景技术：

1、匍匐性状（creeper trait）是家禽中一种特有的异常肢体表型，其主要特征为长骨严重缩短（软骨发育不良）及身体矮小。该性状在我国米易鸡、兴义矮脚鸡、云龙矮脚鸡以及日本矮脚鸡等诸多优良地方鸡种中广泛存在。匍匐性状鸡不仅具有独特的观赏和经济价值，其作为单基因决定性状的典型代表，也是发育生物学及人类软骨发育疾病研究的重要模式生物。然而，在实际育种生产中，该性状伴随的胚胎致死问题导致种群孵化率低、后代胫长不一致、个体体重差异较大，严重制约了地方特色鸡种的保种效率与产业化推广。

2、匍匐性状的研究始于20世纪初期，landauer和dunn（1930）提出，匍匐性状由常染色体上的显性半致死基因（

cp）控制，纯合致死胚胎（

cp/cp）通常在胚胎发育极早期（第3至第4天）死亡并伴随微血管、神经及消化系统等多发性发育异常；而杂合个体（cp/+）能够存活，但表现出胫短、体矮的典型软骨营养不良特征。随着高通量基因组学技术的发展，最新研究证实，导致日本矮脚鸡

cp性状的原因突变是一个跨度约为25 kb的大片段基因组结构缺失，该缺失区域同时覆盖了印度刺猬因子（

ihh）基因和非同源末端连接因子1（

nhej1）基因。由于

ihh信号通路在脊椎动物软骨细胞的增殖、分化以及骨形成过程中发挥着不可替代的核心调控作用，其表达量的单倍体不足直接导致了杂合子（cp/+）软骨发育受阻与肢体缩短；另一方面，

nhej1在细胞dna双链断裂修复通路中具有不可或缺的作用，在胚胎早期细胞快速分裂阶段，

nhej1的完全丧失（纯合状态）会引发dna修复机制崩溃及系统性细胞凋亡，这正是

cp/cp纯合个体在骨骼发生前即出现早期致死的根本分子诱因。

3、米易鸡原产于四川省攀枝花市米易县，是我国宝贵的家禽遗传资源，已被列入《国家畜禽遗传资源品种名录》。在米易鸡的选育与产业化推广过程中，匍匐性状所关联的显性半致死效应已成为制约其种群规模扩大的核心瓶颈。由于

cp基因的存在，导致米易鸡在繁育过程中长期面临胚胎孵化率低、雏鸡胫长整齐度差、弱雏比例高等问题。

4、目前，已有针对兴义矮脚鸡匍匐性状的dna分子标记及诊断引物（中国发明专利申请号cn201610144985.4），该技术方案基于ihh基因单基因缺失（约11.9 kb）设计pcr检测体系。此外，也有针对云龙矮脚鸡的三引物多重pcr检测技术（中国专利申请cn202410505278.8），其基于云龙矮脚鸡的缺失和倒位复合结构设计引物，野生型扩增产物为635 bp，突变型扩增产物为408 bp。然而，以米易鸡基因组dna为模板，采用包括jin等公开条件及经优化条件在内的多种pcr扩增条件对兴义矮脚鸡诊断引物进行测试，均未获得可用于米易鸡判型的预期特异性扩增组合。对引物结合区域和断点序列的比对分析进一步表明，米易鸡与兴义矮脚鸡在缺失断点、倒位结构及相应引物结合序列上存在实质差异，现有兴义矮脚鸡引物不能在米易鸡基因组上形成其原检测体系所需的特异性扩增组合。因此，该现有分子标记不能直接用于米易鸡的基因型鉴定，其不适用性来源于目标结构和引物结合序列的差异，而非单一pcr参数的选择。

5、同样地，云龙矮脚鸡的分子标记技术也不能直接应用于米易鸡。对云龙矮脚鸡专利公开引物与米易鸡已获得的基因组序列进行比对分析表明，两者在缺失断点、倒位片段及引物结合区域的核苷酸序列上存在品种特异性差异，云龙矮脚鸡公开引物在米易鸡基因组中不能形成其原检测体系所需的特异性扩增组合。因此，不能仅依据相近的复合结构变异长度或品种名称推定现有引物可以通用，仍需依据米易鸡特异的断点连接序列和引物结合区域建立专用检测体系。

6、为了揭示米易鸡匍匐性状的底层遗传特征，通过对米易鸡匍匐型（cp/+）及正常型（+/+）个体进行sanger测序验证发现，米易鸡7号染色体上同样存在覆盖ihh与nhej1基因的复合结构变异。具体表现为两段不连续的大片段缺失（缺失长度分别约为13,472 bp和11,560 bp，总缺失长度约为25,032 bp），且位于两缺失片段之间的一段长约为672 bp的基因组序列发生了倒位。这一基于测序结果确证的结构变异，明确了米易鸡匍匐性状及早期胚胎致死的分子遗传标记。

7、鉴于上述25 kb大片段联合缺失对dna损伤修复与软骨发育造成的双重破坏机制，单纯依靠传统的形态学筛选不仅效率低下，且无法从根本上阻断致死等位基因对育种群体的负面影响。因此，针对米易鸡独特的遗传背景开发全新的精准鉴定方法已成为亟待解决的技术难题。开发一种基于米易鸡特有的

ihh和

nhej1大片段联合缺失区域的精准分子标记检测技术，对于在分子水平上优化米易鸡选配方案、精准剔除致死胚胎、提升种群繁殖效率及推动地方优质种源的可持续利用具有重大的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种鉴定米易鸡匍匐性状及早期胚胎致死的联合缺失dna分子标记。

2、本发明的另一目的是提供一种精准鉴定米易鸡正常型（+/+）、匍匐型（cp/+）和纯合致死型（

cp/cp）的检测试剂盒，以指导米易鸡的科学选配。

3、本发明的又一目的是提供一种精准鉴定米易鸡匍匐性状及早期致死胚胎基因型的方法。

4、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

5、第一方面，本发明提供一种与米易鸡匍匐性状及早期胚胎致死相关的dna分子标记，所述dna分子标记为米易鸡7号染色体上两段不连续缺失，长度分别为13,472 bp和11,560 bp，总缺失长度为25,032 bp，缺失区域同时覆盖ihh基因与nhej1基因，且与野生型等位基因相比，突变型等位基因中除发生所述缺失，位于两缺失片段之间的672 bp片段还发生倒位。

6、优选地，所述dna分子标记的突变型等位基因特异性扩增产物具有如seq id no:5所示的核苷酸序列；野生型等位基因特异性扩增产物具有如seq id no:4所示的核苷酸序列。

7、第二方面，本发明提供用于扩增和识别第一方面所述dna分子标记的特异性引物组，所述特异性引物组包括：

8、用于扩增野生型等位基因片段的上游引物my-f3，其核苷酸序列如seq id no:1所示；

9、用于扩增野生型等位基因片段和突变型等位基因片段的公共下游引物my-r1，其核苷酸序列如seq id no:2所示；

10、用于扩增突变型等位基因跨断点片段的上游引物my-f2，其核苷酸序列如seq idno:3所示。

11、所述引物组的设计原理为：在野生型等位基因（+）中，引物my-f2的方向与my-r1一致，无法形成有效扩增，仅有引物my-f3与my-r1配对扩增出502 bp片段；而在突变型等位基因（

cp）中，由于发生两片段缺失伴随中间672 bp片段的倒位，致使结合在该区域的my-f2引物方向发生翻转，并被拉近至my-r1附近，从而特异性扩增出跨越断点的366 bp目的片段。通过上述三引物体系，可在单一pcr反应管中同时检测野生型和突变型等位基因。

12、第三方面，本发明提供一种精准鉴定米易鸡正常型(+/+)、携带致死基因的匍匐型(cp/+)和纯合致死型(cp/cp)的pcr检测试剂盒，包含第二方面所述的特异性引物组。

13、进一步地，所述检测试剂盒包含以下组分：

14、（1）dna提取试剂：包含碱裂解液与中和试剂，用于组织或血液样本的免提纯快速裂解；

15、（2）特异性引物：包含my-f3（seq id no:1）、my-r1（seq id no:2）和my-f2（seq idno:3）引物，进一步优选地，各引物工作浓度为10 pmol/μl；

16、（3）pcr扩增试剂：包含高保真dna聚合酶、无核酸酶的ddh2o；

17、（4）标准对照品：包含阳性对照（已知鉴定为cp/+的米易鸡基因组dna）、阴性对照（已知鉴定为+/+的米易鸡基因组dna）以及空白对照（无核酸酶的ddh2o）。

18、第四方面，本发明提供一种精准鉴定米易鸡匍匐性状及早期致死胚胎基因型的方法，包括以下步骤：

19、s1，提取待测米易鸡样品的基因组dna；

20、s2，以待测样品的基因组dna为模板，利用第二方面所述的特异性引物组进行pcr扩增；

21、s3，检测pcr扩增产物，根据扩增条带的大小和数量判断待测个体的基因型：

22、若扩增产物中仅检测到大小为502 bp的野生型目的条带，则判定该个体为正常型(+/+)；

23、若扩增产物中同时检测到大小为502 bp的野生型目的条带和大小为366 bp的突变型目的条带，则判定该个体为携带致死基因的匍匐型杂合子(cp/+)；

24、若扩增产物中仅检测到大小为366 bp的突变型目的条带，则判定该个体为纯合致死型(cp/cp)。

25、可选地，步骤s1中，所述待测米易鸡样品包括血液、体组织或早期胚胎。

26、优选地，步骤s2中，所述pcr扩增的反应体系包括：基因组dna，kod one酶，引物my-f2、my-f3、my-r1，ddh2o。

27、进一步优选地，所述pcr扩增的反应体系（10.0 μl）包括：基因组dna 1 μl，kodone酶5 μl，浓度为10 pmol/μl的引物my-f2、my-f3、my-r1各0.2 μl，ddh2o补足至总体积10μl。

28、更优选地，pcr扩增程序为：98℃预变性1 min；98℃变性10 sec，58℃退火5 sec，68℃延伸5 sec，共30个循环；68℃延伸5 min；4℃保存备用。

29、优选地，步骤s3中，所述检测pcr扩增产物，采用的方法包括常规琼脂糖凝胶电泳检测。

30、第五方面，本发明提供第一方面所述dna分子标记或第二方面所述特异性引物组在制备米易鸡分子标记辅助育种用产品、种质资源鉴定用产品或构建米易鸡匍匐性状动物模型用产品中的应用。

31、本发明的有益效果在于：

32、本发明突破了以往仅针对

ihh单一基因缺失进行检测的局限，针对米易鸡基因组中导致软骨营养不良（

ihh缺失）与dna双链修复功能崩溃（

nhej1缺失）的25 kb双基因大片段缺失位点进行精确定位检测。不仅能准确识别表现匍匐性状的杂合子个体（cp/+），更能有效识别并提前预判发生早期死亡的纯合子胚胎（

cp/cp），成功克服了现有其它品种专用型引物在米易鸡中非特异性扩增的弊端，提供了一种米易鸡群体全基因型（+/+、cp/+、

cp/

cp）精准分辨的检测技术方案。在米易鸡选育中，本检测方法操作简便、分型结果清晰明确。将其直接应用于种鸡群的早期筛查与核心群组建，能够指导育种人员进行科学选配，有效规避致死型（

cp/cp）后代的产生，可显著提升群体孵化率、大幅度降低弱雏比例，降低育种成本。

33、本发明提供的分子标记为利用米易鸡作为天然动物模型，深入研究脊椎动物双基因联合调控网络、致死基因演化机理以及人类相关骨骼发育障碍与基因组不稳定性疾病提供了高效的分子遗传学工具。