gD蛋白的突变体及其在制备诱导强效中和抗体的疫苗中的应用的制作方法

本发明涉及核酸疫苗，具体涉及gd蛋白的突变体及其在制备诱导强效中和抗体的疫苗中的应用。

背景技术：

1、单纯疱疹病毒2型（hsv-2）是一种双链dna包膜病毒，为疱疹病毒科单纯疱疹病毒属成员，是生殖器疱疹的主要病原体，同时与宫颈癌、新生儿疱疹等疾病的发生密切相关。hsv-2感染呈全球流行态势，人群感染率居高不下，且病毒感染后可在体内建立终身潜伏感染，目前尚无根治手段，仅能通过抗病毒药物缓解症状，无法彻底清除病毒，给公共卫生带来巨大负担。因此，开发安全、高效的预防性及治疗性疫苗是公共卫生领域的迫切需求。hsv-2的包膜表面存在多种糖蛋白，其中gd蛋白是介导病毒与宿主细胞结合、融合的关键蛋白，也是诱导机体产生中和抗体的核心抗原靶点。gd蛋白可特异性识别并结合宿主细胞的受体（如hvem、nectin-1），启动病毒入侵过程，是hsv-2疫苗研发的主要抗原靶点。

2、目前国内外针对hsv-2疫苗的研发主要集中在蛋白亚单位疫苗、减毒活疫苗、dna疫苗等方向，但均存在显著局限性：蛋白亚单位疫苗免疫原性较弱，需配合佐剂使用，且诱导的中和抗体效价低、保护期短，难以有效预防病毒潜伏感染；减毒活疫苗存在毒力返祖风险，对免疫功能低下人群的安全性难以保障，临床应用受限；dna疫苗在体内的表达效率低，诱导的体液免疫和细胞免疫应答均较弱，难以实现临床转化。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供gd蛋白的突变体及其在制备诱导强效中和抗体的疫苗中的应用，本发明基于优化gd蛋白氨基酸序列，进一步采用经密码子优化获得mrna编码序列，能够在体内实现高效表达gd抗原蛋白，诱导机体产生针对hsv-2的高滴度特异性中和抗体和强烈的体液免疫应答，有效预防hsv-2感染，解决现有hsv-2疫苗免疫保护效果差、安全性低等问题。

2、本发明提供了单纯疱疹病毒2型gd蛋白的突变体，其具有：

3、（1）、如seq id no:1所述的氨基酸序列；或

4、（2）、如（1）所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与（1）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

5、（3）、与（1）或（2）所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列。

6、本发明提供了编码所述突变体的核酸分子，其具有：

7、（4）、如seq id no:2所示核苷酸序列；

8、（5）、如（4）所示的核苷酸序列经缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；和/或

9、（6）、与（4）所示的核苷酸序列具有至少80%同源性的序列且编码所述突变体的核酸分子；

10、（7）、与（4）～（6）中任一项部分互补或完全互补的核酸分子。

11、在一些具体实施例中，本发明提供的编码所述突变体的核酸分子具有如seq idno:2所示核苷酸序列。

12、在一些具体实施例中，所述核酸分子中至少一个尿嘧啶（u）替换为假尿嘧啶（ψ）。

13、本发明还提供了表达载体，包括：编码所述突变体的核酸分子。

14、本发明还提供了宿主，转化和/或转染上述表达载体。

15、在本发明的一些实施方案中，上述宿主包括：宿主细胞。

16、本发明还提供了上述突变体的制备方法，将上述宿主接种，培养，诱导，纯化后，获得所述突变体。

17、本发明还提供了产品，包括：上述突变体、上述核酸分子、上述表达载体、上述宿主和/或上述制备方法获得的突变体。

18、本发明提供了核糖核酸片段，其包括所述的核酸分子，还包括5’帽结构、5’utr、3’utr和3’poly(a)尾中至少一种。

19、在一些实施例中，所述5’帽结构包括m7g(5’)ppp(5’)g；

20、所述3’poly(a)尾的长度为150~300。

21、在一些具体实施例中，所述3’poly(a)尾由202个腺嘌呤核苷酸组成。

22、在一些具体实施例中，其具有如seq id no:3所示核苷酸序列的核酸分子。

23、在一些具体实施例中，所述的核糖核酸片段中至少一个尿嘧啶（u）替换为假尿嘧啶（ψ）。

24、本发明提供了所述的突变体、所述的核酸分子或所述的核糖核酸片段在制备防治单纯疱疹病毒2型感染的疫苗中的应用。

25、本发明提供了疫苗，包括所述的核糖核酸片段、疫苗载体和辅料。

26、在一些实施例中，所述疫苗载体选自脂质体纳米颗粒(lnp)、阳离子脂质复合物、聚合物纳米粒子、鱼精蛋白纳米粒子、多肽纳米粒子、病毒载体、无机纳米粒子、细胞穿透肽和自组装rna-脂质复合物中的至少一种；

27、所述疫苗的粒径为80~120nm。

28、在一些具体实施例中，所述疫苗载体为脂质体纳米颗粒(lnp)。

29、在一些实施例中，所述疫苗的剂型为注射剂或鼻腔喷雾剂。

30、本发明提供了所述的疫苗的制备方法，包括取所述核糖核酸片段与所述疫苗载体经微流控设备混合后，获得所述疫苗。

31、在一些实施例中，所述核糖核酸片段与所述疫苗载体的质量比为1：（8~12）。

32、在一些具体实施例中，所述核糖核酸片段与所述疫苗载体的质量比为1：10。

33、本发明还提供了一种防治单纯疱疹病毒2型感染的方法，其为给予本发明所述的疫苗。

34、本发明所述疫苗的给药方式包括肌肉注射、鼻腔喷雾，优选为肌肉注射。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

36、本发明提供一种单纯疱疹病毒2型（hsv-2）gd蛋白的突变体，以及编码所述突变体的mrna，本发明通过优化gd蛋白氨基酸序列，进一步基于宿主偏好性的密码子优化，并结合核苷修饰策略，获得了如seq id no:2所示的优化gd蛋白mrna的序列。该核苷酸序列使得转录后的mrna结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高，能够系统性地提升抗原的表达水平与免疫原性。

37、本发明提供的基于gd蛋白作为靶点的mrna疫苗，包括优化后的gd蛋白的mrna和疫苗载体。该核酸疫苗将体外转录合成的优化gd蛋白mrna，实现在哺乳动物体内表达天然结构gd蛋白的效果，为填补该靶点疫苗研发空白、提升抗原的表达效率和免疫保护效果具有重要的应用价值。

1.单纯疱疹病毒2型gd蛋白的突变体，其特征在于，其具有：

2.编码权利要求1所述突变体的核酸分子，其特征在于，其具有：

3.核糖核酸片段，其特征在于，其包括权利要求2所述的核酸分子，还包括5’帽结构、5’utr、3’utr和3’poly(a)尾中至少一种。

4.根据权利要求3所述的核糖核酸片段，其特征在于，

5.根据权利要求3所述的核糖核酸片段，其特征在于，其具有如seq id no:3所示核苷酸序列。

6.根据权利要求2所述的核酸分子或权利要求3~5任一项所述的核糖核酸片段，其特征在于，所述核酸分子和/或所述的核糖核酸片段中至少一个尿嘧啶（u）替换为假尿嘧啶（ψ）。

7.权利要求1所述的突变体、权利要求2或6所述的核酸分子或权利要求3~6任一项所述的核糖核酸片段在制备防治单纯疱疹病毒2型感染的疫苗中的应用。

8.疫苗，其特征在于，包括权利要求3~6任一项所述的核糖核酸片段、疫苗载体和辅料。

9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗载体选自脂质体纳米颗粒(lnp)、阳离子脂质复合物、聚合物纳米粒子、鱼精蛋白纳米粒子、多肽纳米粒子、病毒载体、无机纳米粒子、细胞穿透肽和自组装rna-脂质复合物中的至少一种；

10.权利要求8或9所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括取所述核糖核酸片段与所述疫苗载体经微流控设备混合后，获得所述疫苗。