脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶及合成脱氧短小蛇根草苷苷元的方法

本发明属于合成生物学领域以及酶工程领域，更具体地，本发明涉及一种分离的脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶及合成脱氧短小蛇根草苷苷元的方法。

背景技术：

1、喜树碱(camptothecin，cpt)属于单萜吲哚类生物碱，在临床上被应用于肺癌、结肠癌、肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤的治疗。在喜树碱药物生产中，目前的制备主要包含以下三类技术路径：天然提取、化学全合成及半合成优化工艺。

2、实践中，仍较多地依赖于从二级保护植物喜树和青脆枝中提取获得喜树碱。例如，将原料粉碎后，用乙醇浸泡；减压浓缩回收乙醇，氯仿萃取去除杂质；甲醇溶解后经结晶纯化，获得喜树碱粗品。并且喜树为保护树种，难以规模化获取。

3、本领域也会采取化学全合成法制备喜树碱，需构建喜树碱分子中的五个环(a-e环)，特别是含手性碳的e环内酯结构。利用sharpless不对称二羟基化反应构建e环手性中心；喹啉、吡咯等杂环的合成策略分别用于a/b环和c/d环的构建。然而，化学全合成法的步骤复杂，需要较高的生产环境。在半合成法中，以天然提取的喜树碱或中间体为起点进行结构修饰，其结合了天然与合成的工艺

4、近年来，利用合成生物学技术在微生物细胞中生产天然产物成为了研究热点，如人参皂苷、红景天苷、青蒿酸都已实现了在微生物中的从头合成。尽管本领域目前对于喜树碱的合成有一定的探索分析，然而其合成途径的一些生物元件仍未解析清楚，很多重要的生物元件包括催化脱氧短小蛇根草苷(deoxypumiloside)合成脱氧短小蛇根草苷苷元(deoxypumiloside aglycone)的参与元件仍有待深入研究和挖掘。

5、也即，本领域已知从脱氧短小蛇根草苷到喜树碱的生物合成过程中，脱氧短小蛇根草苷首先被转化为脱氧短小蛇根草苷苷元，然后被转化为喜树碱。但却仍然不清楚参与这一过程的活性元件。

6、因此，本领域亟待挖掘和鉴定可以将脱氧短小蛇根草苷转化为脱氧短小蛇根草苷苷元的活性元件，以期为喜树碱的异源生物合成提供新的途径。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种分离的脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶及合成脱氧短小蛇根草苷苷元的方法。

2、在本发明的第一方面，提供一种合成脱氧短小蛇根草苷苷元的方法，包括：

3、以糖苷水解酶催化脱氧短小蛇根草苷、使之脱去糖基，从而合成脱氧短小蛇根草苷苷元；

4、其中，所述糖苷水解酶是脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶，其为seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白或其保守性变异蛋白；

5、其中，所述的脱氧短小蛇根草苷包括其类似物(与其具有相同/相似母核结构的化合物)；所述的脱氧短小蛇根草苷苷元包括其类似物(与其具有相同/相似母核结构的化合物)。

6、在一种优选的实施方式中，所述seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白为短小蛇根草来源的酶。

7、在一种优选的实施方式中，所述催化在体外(胞外)进行；较佳地，在体外的反应体系中，以纯化的所述脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶或含有该酶的混合液(如粗酶液，发酵液等)进行催化。

8、在一种优选的实施方式中，所述催化在胞内或胞间(如细胞培养物中)进行，包括在具有脱氧短小蛇根草苷合成体系的细胞(包括工程化的细胞)内，以脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶进行催化(如通过引入脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶的表达盒，来加强该步骤/节点的反应)。

9、在一种优选的实施方式中，所述具有脱氧短小蛇根草苷合成体系的细胞中，所述具有脱氧短小蛇根草苷合成体系为天然存在于细胞的体系或为通过基因工程重组方法建立的表达脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶的细胞。

10、在一种优选的实施方式中，所述脱氧短小蛇根草苷合成体系包括：secologanin(断马钱子苷)与tryptamine(色胺)形成strictosidine(异胡豆苷)，进而依次形成：strictosamide(异长春花苷内酰胺)、strictosamide epoxide(异长春花苷内酰胺环氧化物)、strictosamide diol(异长春花苷内酰胺二醇)、pumiloside、deoxypumiloside(脱氧短小蛇根草苷)的体系。

11、在一种优选的实施方式中，所述表达盒被包含在重组表达载体中。

12、在一种优选的实施方式中，脱氧短小蛇根草苷作为底物，被添加于所述细胞，从而加强该步骤/节点的反应。

13、在一种优选的实施方式中，所述细胞包括：天然表达脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶的细胞；或通过基因工程重组方法而表达脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶的细胞。

14、在一种优选的实施方式中，所述细胞包括：原核细胞或真核细胞。

15、在一种或多种实施方式中，所述真核细胞包括酵母。

16、在一种或多种实施方式中，所述的酵母包括：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母。

17、在一种或多种实施方式中，所述真核细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

18、在一种或多种实施方式中，所述的细胞包括：植物细胞。

19、在一种或多种实施方式中，所述原核细胞包括大肠杆菌或链霉菌。

20、在本发明的另一方面，提供一种脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶的用途，用于作为糖苷水解酶，催化脱氧短小蛇根草苷、使之脱去糖基并合成脱氧短小蛇根草苷苷元；其中，所述脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶为seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白或其保守性变异蛋白；其中，所述的脱氧短小蛇根草苷包括其类似物(与其具有相同/相似母核结构的化合物)；所述的脱氧短小蛇根草苷苷元包括其类似物(与其具有相同/相似母核结构的化合物)。

21、在本发明的另一方面，提供一种分离的脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶，其为seqid no.2所示氨基酸序列的蛋白或其保守性变异蛋白。

22、在一种优选的实施方式中，所述的分离的脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶的保守性变异蛋白包括：

23、(1)seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有糖苷水解酶活性的蛋白；

24、(2)氨基酸序列与seq id no.2所示的蛋白有80％(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地99％以上)以上相同性，且具有糖苷水解酶活性的蛋白；或

25、(3)在seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白的n端或c端添加标签序列，或在其n端添加信号肽序列后形成的、且具有糖苷水解酶活性的蛋白。

26、在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶；较佳地，该多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.1所示。

27、在本发明的另一方面，提供一种表达构建体(如表达载体)，它含有所述的多核苷酸，或含有所述的脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶的表达盒。

28、在本发明的另一方面，提供一种基因工程化的细胞，其中包括外源引入的脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶表达盒(或含有该表达盒的表达构建体)；所述脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶为seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白或其保守性变异蛋白；较佳地，所述细胞为具有脱氧短小蛇根草苷合成体系的细胞；更佳地，所述脱氧短小蛇根草苷合成体系包括：secologanin(断马钱子苷)与tryptamine(色胺)形成strictosidine(异胡豆苷)，进而依次形成：strictosamide(异长春花苷内酰胺)、strictosamide epoxide(异长春花苷内酰胺环氧化物)、strictosamide diol(异长春花苷内酰胺二醇)、pumiloside、deoxypumiloside(脱氧短小蛇根草苷)的体系。

29、在本发明的另一方面，提供一种制备所述的重组细胞的方法，包括：将脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶表达盒引入到细胞中，获得所述重组细胞；所述脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶为seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白或其保守性变异蛋白；较佳地，还在重组细胞中外源引入脱氧短小蛇根草苷合成体系或体系中的部分组件；较佳地，所述表达盒被包含在重组表达载体中。

30、在本发明的另一方面，提供一种用于生物合成脱氧短小蛇根草苷苷元的试剂盒，其中包括所述的脱氧短小蛇根草苷苷元合成酶，所述的表达构建体；或所述的基因工程化的细胞。

31、在本发明的另一方面，提供一种合成(包括生物合成)喜树碱的方法，包括：(a)利用前面任一所述的方法催化脱氧短小蛇根草苷、使之脱去糖基，制备脱氧短小蛇根草苷苷元；(b)将步骤(a)的脱氧短小蛇根草苷苷元进一步转化为喜树碱。

32、在一种优选的实施方式中，步骤(a)中所述脱氧短小蛇根草苷的制备方法包括：以secologanin(断马钱子苷)与tryptamine(色胺)制备strictosidine(异胡豆苷)，进而依次制备：strictosamide(异长春花苷内酰胺)、strictosamide epoxide(异长春花苷内酰胺环氧化物)、strictosamide diol(异长春花苷内酰胺二醇)、pumiloside、脱氧短小蛇根草苷。

33、在一种优选的实施方式中，所述方法包括以下的合成/催化步骤：

34、

35、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。