一种用于异体脐带血NK细胞扩增培养的组合物及培养方法

本发明属于细胞免疫治疗，尤其涉及一种用于异体脐带血nk细胞扩增培养的组合物及培养方法。

背景技术：

1、恶性肿瘤是全球范围内威胁人类生命健康的重大疾病，传统治疗手段如手术、化疗、放疗等虽在一定程度上能控制病情进展，但存在治疗特异性差、副作用显著、易复发转移等诸多局限，难以满足临床治疗的精准化、高效化需求。

2、自然杀伤（natural killer, nk）细胞作为先天免疫系统的核心效应细胞，无需抗原预先致敏即可直接识别并杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞，同时还能通过分泌干扰素（ifn-γ）、肿瘤坏死因子（tnf-α）等细胞因子调节机体免疫微环境，激活适应性免疫应答，在抗肿瘤、抗病毒感染以及免疫稳态维持中发挥不可替代的关键作用。基于nk细胞的免疫疗法凭借其独特的作用机制、广谱的抗肿瘤/抗病毒活性以及较低的脱靶效应风险，已成为继car-t细胞疗法之后肿瘤免疫治疗领域的另一大研究热点，在白血病、淋巴瘤、实体瘤等多种疾病的临床研究中展现出良好的治疗潜力。

3、然而，nk细胞在人体外周血中占比极低（仅占外周血单个核细胞的5%-15%），且体外扩增过程中面临诸多亟待突破的技术瓶颈，严重制约了其临床转化与产业化应用：

4、1. 扩增效率不足：传统体外培养体系（如基于il-2、il-15等单一细胞因子的培养方法）从外周血或脐带血单个核细胞中诱导扩增nk细胞时，扩增倍数普遍有限，通常不足1000倍，扩增周期长达2-3周。而临床治疗中，单次给药剂量通常需要达到109~1010个活性nk细胞，现有扩增效率难以满足规模化的临床剂量需求，导致多数研究停留在小样本探索阶段，无法开展大规模临床试验及广泛临床应用。

5、2. 细胞纯度不稳定：扩增产物中易混杂t细胞（cd3+）、b细胞、单核细胞等其他免疫细胞，其中t细胞的残留风险尤为突出。若将含残留t细胞的nk细胞制剂用于异体移植，极易引发移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, gvhd），这是临床细胞治疗中致命的不良反应之一，严重时可导致患者多器官衰竭死亡。目前，现有技术难以稳定获得cd3-cd56+纯度达90%以上的高活性nk细胞，细胞制剂的安全性和有效性无法得到充分保障。

6、3. 工艺重复性差：nk细胞的扩增效率和功能活性受供体年龄、健康状况、免疫状态等个体差异影响极大，不同供体来源的细胞在相同培养条件下的扩增效果差异显著。同时，现有培养工艺缺乏标准化的操作流程，包括细胞接种密度、细胞因子添加时序与浓度、培养环境参数（如温度、ph值、气体浓度）等关键环节均未实现统一规范，导致工艺稳定性和重复性差，难以满足产业化大规模生产的质量控制要求，阻碍了nk细胞疗法的标准化推广。

7、4. 血清依赖与安全性风险：胎牛血清（fetal bovine serum, fbs）是传统nk细胞培养体系中的常用添加成分，虽能通过提供多种生长因子、营养物质促进nk细胞增殖，但存在诸多不可忽视的问题：一是fbs来源复杂，不同批次间成分差异大，进一步加剧了工艺的不稳定性；二是fbs中含有异种蛋白、病毒、支原体等潜在病原体，存在传播疾病的风险；三是异种蛋白的引入会增加细胞制剂的免疫原性，可能引发患者机体的免疫排斥反应，严重影响治疗安全性。因此，含fbs的培养体系不符合临床级细胞制备的gmp规范，无法满足临床应用的安全性要求。

8、5. 生产成本高昂：现有nk细胞扩增多依赖商业化培养试剂盒，此类试剂盒价格昂贵，且大多针对自体nk细胞培养设计，培养规模小、成本可控性差。对于异体nk细胞疗法而言，需要实现规模化、标准化生产以降低单位剂量成本，现有商业化试剂盒难以适配异体规模化生产的需求，导致nk细胞制剂的生产成本居高不下，极大地限制了其临床可及性。

9、脐带血作为新生儿娩出时脐带和胎盘内残留的血液，具有来源丰富、采集便捷、对供体无任何伤害等独特优势，且脐带血来源的nk细胞（umbilical cord blood-derived nkcells, ucb-nk cells）相较于外周血nk细胞具有更显著的临床应用潜力：一是免疫原性低，脐带血nk细胞表面的主要组织相容性复合体（mhc）分子表达水平低，异体移植时引发gvhd和免疫排斥反应的风险远低于外周血nk细胞；二是增殖能力和活性更强，脐带血nk细胞处于未成熟状态，体外扩增潜力更大，且杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞的活性更优；三是来源稳定可控，可建立标准化的脐带血库进行长期储存和规范化管理，能为异体nk细胞疗法提供稳定的细胞来源。

10、尽管脐带血nk细胞作为异体nk细胞疗法的理想来源具有诸多优势，但现有技术体系仍存在明显短板：现有扩增技术多为通用型方案，缺乏针对异体脐带血nk细胞的特异性、可产业化的高效扩增方案。因此，开发一种适配异体脐带血nk细胞的高效、稳定、安全、低成本的扩增技术，突破现有技术瓶颈，具有至关重要的现实意义和巨大的临床应用价值。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于异体脐带血nk细胞扩增培养的组合物及培养方法；本发明提供的组合物及培养方法扩增效率高，产物纯度高；在14天内实现nk细胞扩增倍数>5000倍，总细胞数达临床应用规模；产物中cd3-cd56+ nk细胞纯度稳定≥90%，cd3+ t细胞残留<10%。

2、本发明提供了一种用于异体脐带血nk细胞扩增培养的组合物，包括第一培养组合物、第二培养组合物、第三培养组合物和第四培养组合物；

3、所述第一培养组合物包括x-vivo 15无血清培养基+3~8%（v/v）血浆+终浓度150~250 iu/ml的il-2+nk扩增试剂盒a；所述nk扩增试剂盒a的使用量为0.5~1.5ml/2×107初始细胞；

4、所述第二培养组合物包括x-vivo 15无血清培养基+3~8%（v/v）血浆+终浓度150~250 iu/ml的il-2；

5、所述第三培养组合物包括x-vivo 15无血清培养基+3~8%（v/v）血浆+nk扩增试剂盒b，所述nk扩增试剂盒b的使用量为3~5ml/2×107初始细胞；

6、所述第四培养组合物包括x-vivo 15无血清培养基+终浓度150~250 iu/ml的il-2。

7、优选的，所述第一培养组合物的使用时间为细胞培养的第0~3d；所述第二培养组合物的使用时间为细胞培养的第3~6d；所述第三培养组合物的使用时间为细胞培养的第7~8d，所述第四培养组合物的使用时间为细胞培养的第8~14d。

8、优选的，所述第一培养组合物包括x-vivo 15无血清培养基+4~7%（v/v）血浆+终浓度180~220 iu/ml的il-2+nk扩增试剂盒a；所述nk扩增试剂盒a的使用量为0.8~1.2ml/2×107初始细胞；

9、所述第二培养组合物包括x-vivo 15无血清培养基+4~7%（v/v）血浆+终浓度180~220 iu/ml的il-2；

10、所述第三培养组合物包括x-vivo 15无血清培养基+4~7%（v/v）血浆+nk扩增试剂盒b；所述nk扩增试剂盒b的使用量为3.5~4.5ml/2×107初始细胞；

11、所述第四培养组合物包括x-vivo 15无血清培养基+终浓度180~220 iu/ml的il-2。

12、本发明提供了基于所述的组合物进行异体脐带血nk细胞的培养方法，包括以下步骤：

13、1）将脐带血单个核细胞以0.8~1.2×106活细胞/ml密度接种至第一培养组合物中进行0~3d的第一阶段激活培养；

14、2）然后每1~3d向培养体系中添加第二培养组合物进行早期扩增培养；

15、3）早期扩增培养结束后，向培养体系中添加第三培养组合物进行二次激活；

16、4）二次激活后，每2~3d向培养体系中添加第四培养组合物至第14d，收获细胞。

17、优选的，步骤2）所述早期扩增培养过程中添加第二培养组合物2~3次，每一次的添加量为培养体积的0.5~5倍，具体为10~100ml。

18、优选的，步骤3）所述第三培养组合物的添加量为培养体积的1~1.5倍。

19、优选的，步骤4）所述第四培养组合物每一次的添加量为0.25~3倍。

20、优选的，步骤4）所述收获细胞包括依次进行的离心、收集细胞、用氯化钠注射液重悬至2~5×107 cells/ml。

21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种用于异体脐带血nk细胞扩增培养的组合物，包括第一培养组合物、第二培养组合物、第三培养组合物和第四培养组合物；所述组合物根据细胞的培养阶段设定不同的组合，结合本发明的培养方法能够实现提高扩增效率和产物纯度高的效果；在14天内实现nk细胞扩增倍数>5000倍，总细胞数达临床应用规模；产物中cd3-cd56+ nk细胞纯度稳定≥90%，cd3+ t细胞残留<10%。