RPL27A作为标志物在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用的制作方法

本发明涉及疾病诊断，尤其涉及rpl27a作为标志物在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用。

背景技术：

1、结核病（tuberculosis，tb）是由结核分枝杆菌（

mycobacterium tuberculosis）感染引起的重大慢性传染性疾病，致死率高。早发现、早诊断、早治疗是阻断结核传播、降低死亡率的核心策略。然而，现有诊断方法存在明显局限。

2、在传统的病原学检测领域中，传统痰涂片镜检灵敏度低（约50%～60%），且无法区分死活菌；固体培养虽为金标准，但耗时长达数周；以genexpert mtb/rif虽大幅缩短了检测时间并提高了灵敏度，但对菌载量极低的样本仍存在假阴性，且所有病原学方法均无法有效诊断活动性结核病（active tuberculosis，atb），更不能区分atb与结核潜伏感染（latent tuberculosis infection，ltbi）。免疫学方法如结核菌素试验（tuberculin skintest，tst）和γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assay，igra），仅能判断是否存在结核感染，同样无法区分atb与ltbi。ltbi中5%~10%可能进展为atb，两种感染状态的治疗方案差异巨大，误判将导致atb患者延误治疗、加剧传播，或ltbi者承受不必要的长期药物毒性。临床迫切需要能够准确鉴别atb与ltbi的新型标志物。

3、近年来，基于宿主基因表达谱的转录组学分析通过检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，pbmcs）中特定基因的表达水平，可直接反映机体在不同感染状态下的免疫应答特征，成为开发新型诊断标志物的重要方向。已有研究报道了gbp5、dusp3、klf2等多个差异表达基因可作为候选标志物，但部分标志物在不同人群中重复性欠佳，且尚缺乏可用于临床常规检测的成熟方案。此外，现有基因标志物检测多需依赖高通量测序或复杂生物信息学分析，难以在基层医疗机构推广。因此，寻找能够准确、快速、便捷地鉴别atb与ltbi的新型生物标志物及检测方法，仍是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供rpl27a作为标志物在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用，旨在克服现有技术的缺陷，提供新的用于有效区分活动性结核病与结核潜伏感染的标志物及其应用。

2、

rpl27a基因位于人类第11号染色体短臂p15.4区域，编码60s核糖体大亚基组成蛋白l27a（60s ribosomal protein l27a），其表达的蛋白分子量约为17kda，属于l15p核糖体蛋白家族成员，定位于细胞质中，参与真核生物蛋白质合成中核糖体结构的维持。

rpl27a基因在进化上高度保守，从低等真核生物到哺乳动物均存在同源基因。在肿瘤等疾病背景下已有文献报道

rpl27a的差异表达，但尚无在结核病领域的研究报道，本发明首次发现其作为结核感染状态鉴别标志物。

3、本发明通过实验发现，在外周血单个核细胞中，

rpl27a基因的相对表达量与结核感染进展程度相关：与受试群体中的结核潜伏感染者相比，活动性结核病患者pbmc中

rpl27a的转录水平显著降低，可区分两种感染状态。

4、基于此，本发明提供了以下技术方案：

5、第一方面，本发明提供

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白作为标志物在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用。

6、根据本发明提供的

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白作为标志物在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，与结核潜伏感染者相比，

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在活动性结核病患者中的表达量更低。

7、更优选地，与结核潜伏感染者相比，

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在活动性结核病患者的外周血单个核细胞中的表达量更低。

8、进一步优选地，所述表达量为相对表达量；所述相对表达量以健康人为对照获得，即采用2-δδct法结合

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在健康人的外周血单个核细胞中的表达量，计算得到

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在活动性结核病患者的外周血单个核细胞中的表达量，以及

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在结核潜伏感染者的外周血单个核细胞中的表达量。

9、在本发明中，术语“表达量”是指生物样本中靶标基因或其编码产物的丰度水平，用于反映特定生理或病理状态下基因转录或翻译的活跃程度。表达量可通过测定mrna的转录水平或蛋白质的翻译水平来表征，其数值可采用绝对定量或相对定量的方式表示。

10、在本发明中，术语“绝对表达量”通常指单位体积、单位细胞数或单位组织中靶标分子的实际拷贝数或浓度。

11、在本发明中，术语“相对表达量”涵盖基因相对表达量和蛋白相对表达量。基因相对表达量是指通过实时荧光定量pcr技术，以稳定的内参基因作为参照，对靶标基因的mrna转录水平进行归一化处理后得到的数值，计算可采用2-δδct法。蛋白相对表达量是指通过免疫印迹法等蛋白检测技术，以稳定的内参蛋白（如gapdh、β-actin）作为参照，将靶标蛋白条带灰度值进行归一化处理后得到的数值，通常表示为实验组相对于对照组的灰度比值或变化倍数。

12、在本发明中，用于相对定量检测的内参基因可根据待测样本类型、细胞来源及实验体系的实际需要进行选择。常用的内参基因包括但不限于gapdh、β-actin、tubullin等。更换内参基因的仅影响靶标基因表达量的归一化基准数值，而不影响靶标基因在不同类型样本间表达差异的判定方向及其统计学结论。换言之，本发明的检测结果不依赖于特定的内参基因选择，选用不同的内参基因进行校正后，靶标基因的差异表达趋势及后续鉴别诊断结论保持一致。

13、更进一步优选地，待测样本的

rpl27a基因的相对表达量≤阈值，则该待测样本为活动性结核病样本；待测样本的

rpl27a基因的相对表达量>阈值，则该待测样本为结核潜伏感染样本；所述待测样本存在结核分枝杆菌感染；所述阈值通过交叉验证法结合二分类模型确定。

14、再进一步优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证或k折交叉验证。

15、最优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证。

16、再进一步优选地，所述二分类模型选自logistic回归模型、支持向量机和随机森林中的任意一种。

17、最优选地，所述二分类模型为logistic回归模型，所述阈值为logistic回归模型所得最佳临界值。

18、再进一步优选地，用于确定所述阈值的样本量不低于60个。再进一步优选地，所述阈值为0.8～1.3。

19、最优选地，所述阈值为1.233。

20、根据本发明提供的

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白作为标志物在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，所述试剂包括引物。

21、更优选地，所述引物包括如seq id no:1～2所示的核苷酸序列。

22、进一步优选地，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列与seq id no:1具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性；所述下游引物与seq id no:2具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

23、更进一步优选地，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示。

24、更进一步优选地，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。

25、更优选地，所述试剂还包括荧光定量pcr试剂。

26、根据本发明提供的

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白作为标志物在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，所述产品包括：芯片、试纸、试剂、试剂盒、系统、装置或计算机可读介质。

27、第二方面，本发明还提供检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用。

28、根据本发明提供的检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，与结核潜伏感染者相比，

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在活动性结核病患者中的表达量更低。

29、更优选地，与结核潜伏感染者相比，

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在活动性结核病患者的外周血单个核细胞中的表达量更低。

30、进一步优选地，所述表达量为相对表达量；所述相对表达量以健康人为对照获得。

31、更进一步优选地，待测样本的

rpl27a基因的相对表达量≤阈值，则该待测样本为活动性结核病样本；待测样本的

rpl27a基因的相对表达量>阈值，则该待测样本为结核潜伏感染样本；所述待测样本存在结核分枝杆菌感染；所述阈值通过交叉验证法结合二分类模型确定。

32、再进一步优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证或k折交叉验证。

33、最优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证。

34、再进一步优选地，所述二分类模型选自logistic回归模型、支持向量机和随机森林中的任意一种。

35、最优选地，所述二分类模型为logistic回归模型，所述阈值为logistic回归模型所得最佳临界值。

36、再进一步优选地，用于确定所述阈值的样本量不低于60个。

37、再进一步优选地，所述阈值为0.8～1.3。

38、最优选地，所述阈值为1.233。

39、根据本发明提供的检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，所述试剂包括引物。

40、更优选地，所述引物包括如seq id no:1～2所示的核苷酸序列。

41、进一步优选地，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列与seq id no:1具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性；所述下游引物与seq id no:2具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

42、更进一步优选地，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示。

43、更进一步优选地，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。

44、更优选地，所述试剂还包括荧光定量pcr试剂。

45、根据本发明提供的检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，所述产品包括：芯片、试纸、试剂、试剂盒、系统、装置或计算机可读介质。

46、第三方面，本发明还提供检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备诊断活动性结核病和/或结核潜伏感染的产品中的应用。

47、根据本发明提供的检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备诊断活动性结核病和/或结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，与结核潜伏感染者相比，

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在活动性结核病患者中的表达量更低。

48、更优选地，与结核潜伏感染者相比，

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白在活动性结核病患者的外周血单个核细胞中的表达量更低。

49、进一步优选地，所述表达量为相对表达量；所述相对表达量以健康人为对照获得。

50、更进一步优选地，待测样本的

rpl27a基因的相对表达量≤阈值，则该待测样本为活动性结核病样本；待测样本的

rpl27a基因的相对表达量>阈值，则该待测样本为结核潜伏感染样本；所述待测样本存在结核分枝杆菌感染；所述阈值通过交叉验证法结合二分类模型确定。

51、再进一步优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证或k折交叉验证。

52、最优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证。

53、再进一步优选地，所述二分类模型选自logistic回归模型、支持向量机和随机森林中的任意一种。

54、最优选地，所述二分类模型为logistic回归模型，所述阈值为logistic回归模型所得最佳临界值。

55、再进一步优选地，用于确定所述阈值的样本量不低于60个。再进一步优选地，所述阈值为0.8～1.3。

56、最优选地，所述阈值为1.233。

57、根据本发明提供的检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备诊断活动性结核病和/或结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，所述试剂包括引物。

58、更优选地，所述引物包括如seq id no:1～2所示的核苷酸序列。

59、进一步优选地，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列与seq id no:1具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性；所述下游引物与seq id no:2具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

60、更进一步优选地，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示。

61、更进一步优选地，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。

62、更优选地，所述试剂还包括荧光定量pcr试剂。

63、根据本发明提供的检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备诊断活动性结核病和/或结核潜伏感染的产品中的应用，优选地，所述产品包括：芯片、试纸、试剂、试剂盒、系统、装置或计算机可读介质。

64、第四方面，本发明还提供一种用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的装置，所述装置包括检测模块、分析模块和输出模块；

65、所述检测模块用于对存在结核分枝杆菌感染的待测样本和对照样本进行检测，并获取

rpl27a基因和内参基因的表达量数据，所述对照样本采集自健康人；

66、所述分析模块用于结合所述检测模块获取的ct值数据分析得到

rpl27a基因的相对表达量，之后以所得

rpl27a基因的相对表达量数据作为输入数据，执行以下方法判断待测样本的类型：

67、待测样本的

rpl27a基因的相对表达量≤阈值，则该待测样本为活动性结核病样本；待测样本的

rpl27a基因的相对表达量>阈值，则该待测样本为结核潜伏感染样本；所述阈值通过交叉验证法结合二分类模型确定；

68、所述输出模块用于输出分析模块得到的待测样本的类型的判断结果。

69、根据本发明提供的一种用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的装置，优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证或k折交叉验证，和/或，所述二分类模型选自logistic回归模型、支持向量机和随机森林中的任意一种。

70、更优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证，和/或，所述二分类模型为logistic回归模型；所述阈值为logistic回归模型所得最佳临界值。

71、更优选地，用于确定所述阈值的样本量不低于60个。

72、进一步优选地，所述阈值为0.8～1.3。

73、更进一步优选地，所述阈值为1.233。

74、根据本发明提供的一种用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的装置，优选地，所述装置还包括存储模块，所述存储模块用于存储所述检测模块获取的表达量数据和/或所述阈值。

75、更优选地，所述存储模块还存储所述

rpl27a基因的相对表达量的计算公式。

76、进一步优选地，所述

rpl27a基因的相对表达量由2-δδct法计算得到。

77、更进一步优选地，所述2-δδct法的计算公式为：δct=ct

rpl27a-ct

内参基因，δct=δct样本-δct对照；其中，δct样本为待测样本中所述

rpl27a基因的相对表达量，δct对照为对照样本中所述

rpl27a基因的相对表达量，ct

rpl27a为

rpl27a基因的ct值，ct

内参基因为内参基因的ct值。

78、更进一步优选地，所述内参基因选自gapdh基因、β-actin基因或tubullin基因。

79、根据本发明提供的一种用于鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的装置，优选地，所述待测样本为血液样本、细胞样本或核酸样本。

80、更优选地，所述血液样本为外周血。

81、更优选地，所述细胞样本为外周血单个核细胞。

82、更优选地，所述核酸样本为外周血单个核细胞的核酸样本。

83、更优选地，所述核酸样本为rna。

84、第五方面，本发明还提供一种计算机可读介质，所述计算机程序被处理器执行时实现鉴别活动性结核病和结核潜伏感染的方法，所述方法包括：

85、获取待测样本的

rpl27a基因的相对表达量，根据待测样本的

rpl27a基因的相对表达量判定待测样本为活动性结核病样本或结核潜伏感染样本，所述待测样本存在结核分枝杆菌感染。

86、根据本发明提供的一种计算机可读介质，优选地，判定标准包括：待测样本的

rpl27a基因的相对表达量≤阈值，则该待测样本为活动性结核病样本；待测样本的

rpl27a基因的相对表达量>阈值，则该待测样本为结核潜伏感染样本；所述阈值通过交叉验证法结合二分类模型确定。

87、更优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证或k折交叉验证。

88、进一步优选地，所述交叉验证法为留一交叉验证。

89、更优选地，所述二分类模型选自logistic回归模型、支持向量机和随机森林中的任意一种。

90、进一步优选地，所述二分类模型为logistic回归模型，所述阈值为logistic回归模型所得最佳临界值。

91、更优选地，用于确定所述阈值的样本量不低于60个。

92、更优选地，所述阈值为0.8～1.3。

93、进一步优选地，所述阈值为1.233。

94、根据本发明提供的一种计算机可读介质，优选地，所述待测样本为血液样本、细胞样本或核酸样本。

95、更优选地，所述血液样本为外周血。

96、更优选地，所述细胞样本为外周血单个核细胞。

97、更优选地，所述核酸样本为外周血单个核细胞的核酸样本。

98、更优选地，所述核酸样本为rna。

99、

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白作为靶点在制备结核病诊断试剂、筛选抗结核药物或结核病治疗药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

100、检测

rpl27a基因和/或rpl27a蛋白的试剂在制备结核病诊断试剂、筛选抗结核药物或结核病治疗药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

101、本发明具有如下有益效果：

102、本发明首次发现

rpl27a基因在外周血单个核细胞中的表达水平与结核分枝杆菌感染状态显著相关，其在活动性结核病患者中的相对表达量显著低于潜伏感染者，为结核病的鉴别诊断提供了全新的生物标志物。基于该发现，本发明能够准确区分活动性结核与潜伏感染，有效填补了tst、igra等现有免疫学方法无法区分两种感染状态的临床空白，避免误判导致的延误治疗或过度治疗。同时，检测仅需采集少量外周血，创伤小，无需痰液等难获取样本；采用rt-qpcr方法，从样本处理到结果输出可在4小时内完成，远快于传统的痰液培养法。结果通过内参基因标准化计算相对表达量并结合预设阈值判读，定量客观，避免主观差异，易于标准化。检测仅需常规rt-qpcr试剂与仪器，成本低廉，无需依赖高通量测序或复杂生物信息学分析，适合各级医疗机构推广。