高温驱动表达OsGAD3基因在提高水稻生物量及产量中的应用

本发明属于农业生物，具体地说，涉及高温驱动表达osgad3基因在提高水稻生物量及产量中的应用。

背景技术：

1、水稻是一年生草本植物，是人类赖以生存的主要粮食作物之一。全球约有一半的人口以稻米为主食，且比重还在逐渐提高。水稻产量的提高对我国粮食生产和粮食安全有着重要意义。

2、谷氨酸脱羧酶广泛存在于原核和真核生物中，是一个胞内酶，主要存在于细胞质中，与磷酸吡哆醛辅因子结合催化l-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(gaba)和co2。gad是gaba生物合成途径中的关键酶。动物体内，gaba是中枢神经系统主要的抑制性神经递质。细菌中，gaba的合成和分泌是细菌抵抗极端酸性ph环境的主要机制。植物中，gaba的合成与植物生长的逆境生理密切相关。与动物和细菌中不同的是，植物中gad蛋白的c末端存在一个钙调素(cam)结合结构域(cambd)，它受ca2+/cam调节。在2020年，有研究证实了水稻osgad3具有cambd，并通过crispr/cas9基因编辑获得了富含gaba的水稻，表明cambd的去除会导致植物体内的gaba含量更高。在研究浸泡的水稻种子的表达模式发现，3个谷氨酸脱羧酶中osgad3表现出了较高的表达水平，据此推测osgad3可能在gaba的富集以及早期种子的吸胀中发挥重要作用。

3、gaba是连接植物碳代谢和氮代谢的核心枢纽。gaba支路是三羧酸循环(tca循环)的一条“捷径”，可以快速补充循环中的中间产物(琥珀酸)。gaba的合成底物是谷氨酸(一种氨基酸)，其代谢产物又可以转化为其他氨基酸。当氮源充足时，gaba可以作为氮的临时储存库；当氮需求增加时，它可以被分解利用。

4、gaba在植物中远不止是一种代谢中间物，它更是一种至关重要的信号分子和应激代谢物，在植物应对环境和调控自身生长中扮演着多重关键角色。热害、冷害、盐胁迫、干旱等也会引起细胞内钙信号和ph的变化，激活gad，从而诱导gaba积累，帮助植物稳定细胞状态，提高抗逆性。作为重要的信号分子，gaba能够调控花粉管导向与受精，花粉管尖端有感知gaba的受体，花粉管会沿着gaba浓度递增的方向生长，最终精准找到胚珠，完成受精。gaba浓度过高或过低都会导致花粉管导向失败，影响结实率。gaba可以通过调控细胞壁的ph值和相关酶活性来影响细胞伸长和分裂，从而调节植物的生长发育，影响根系的生长和构造。

5、目前已知水稻的gad基因有5个成员，分别为osgad1(ab056060)、osgad2(ab056061)、osgad3(ay187941)、osgad4(af377946.3)和osgad5(ak070858)。其中关于osgad1、osgad2的研究比较多而有关其他几个基因的研究报道则较少，且osgad3对水稻gaba积累具有更显著的作用，但其具体调控机制尚不清楚。

6、因此，本领域迫切需要开发一种通用的、可能适用于多种作物的生物技术方法，有望为应对全球粮食安全挑战提供新解决方案。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种通用的、可能适用于多种作物的生物技术方法，有望为应对全球粮食安全挑战提供新解决方案。

2、本发明研究发现，osgad3与双子叶植物拟南芥谷氨酸脱羧酶atgad2的氨基酸序列相似性比osgad1和osgad2更高，且osgad3对水稻gaba积累具有更显著的作用，而gaba是连接植物碳代谢和氮代谢的核心枢纽。因此我们认为基因osgad3对于水稻生长发育调节和生物量性状的形成或许十分关键。基于此，本发明包括如下技术方案。

3、本发明的第一方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式i结构：

4、p1-s1-s2(i)；

5、式中，

6、p1、s1、s2分别为用于构成所述构建物的元件；

7、p1为高温响应启动子序列；

8、s1为叶绿体转运蛋白的编码序列；

9、s2为gad3蛋白的编码序列；

10、并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

11、在另一优选例中，所述高温响应启动子包括phsfa2、phsp21。

12、在另一优选例中，所述高温响应启动子来源于如下植物：拟南芥。

13、在另一优选例中，所述高温响应启动子的核苷酸序列如seq id no.5所示。

14、在另一优选例中，所述叶绿体转运蛋白包括rbcsptp。

15、在另一优选例中，所述叶绿体转运蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示。

16、在另一优选例中，所述叶绿体转运蛋白来源于如下植物：拟南芥。

17、在另一优选例中，所述gad3蛋白来自单子叶植物。

18、在另一优选例中，所述的gad3蛋白来自如下植物：禾本科农作物、十字花科植物、豆科类植物，优选禾本科农作物。

19、在另一优选例中，所述的gad3蛋白来自如下植物：水稻、拟南芥、小麦、玉米、大豆、大麦、燕麦、黑麦、高粱、棉花、蔬菜，优选水稻。

20、在另一优选例中，所述gad3蛋白包括水稻的osgad3蛋白osgad3(登录号：q84u04)。

21、在另一优选例中，所述gad3基因(gad3蛋白的编码序列)包括水稻的osgad3基因osgad3(登录号4332184)。

22、在另一优选例中，所述gad3基因包括野生型gad3基因和截短型gad3基因。

23、在另一优选例中，所述的截短型包括突变后编码蛋白的功能增强的截短形式。

24、在另一优选例中，所述的截短型gad3基因编码的多肽与野生型gad3基因所编码的多肽基本相同。

25、在另一优选例中，所述的截短型gad3基因包括与野生型gad3基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％)的多核苷酸。

26、在另一优选例中，所述截短型gad3基因为全部或部分缺失钙调素(cam)结合结构域(cambd)的gad3基因。

27、在另一优选例中，所述的截短型gad3基因包括在野生gad3基因的3＇端截短50-80个(优选60-80个，更优选72个)核苷酸的多核苷酸。

28、在另一优选例中，所述gad3蛋白包括野生型gad3蛋白和截短型gad3蛋白。

29、在另一优选例中，所述截短型gad3蛋白为全部或部分缺失钙调素(cam)结合结构域(cambd)的gad3蛋白。

30、在另一优选例中，所述gad3蛋白的氨基酸序列选自下组：

31、(i)具有seq id no.1或2所示氨基酸序列的多肽；

32、(ii)将如seq id no.1或2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控农艺性状功能的、由(i)衍生的多肽；或

33、(iii)氨基酸序列与seq id no.1或2所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，具有所述调控农艺性状功能的多肽。

34、在另一优选例中，所述gad3基因的核苷酸序列选自下组：

35、(a)编码如seq id no.1或2所示多肽的多核苷酸；

36、(b)序列如seq id no.3或4所示的多核苷酸；

37、(c)核苷酸序列与seq id no.3或4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

38、(d)在seq id no.3或4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

39、(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

40、在另一优选例中，所述的osgad3基因包括cdna序列、基因组序列、或其组合。

41、在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列长度为1-1000nt，较佳地1-500nt，更佳地，1-100nt，更佳地，1-50nt，更佳地，1-10nt，更佳地，1-5nt。

42、在另一优选例中，所述核苷酸连接序列不影响各元件的正常转录和翻译。

43、本发明第二方面提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括叶绿体转运蛋白和gad3蛋白，并且所述融合蛋白由本发明第一方面所述的核酸构建物编码。

44、本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物。

45、在另一优选例中，所述载体为植物表达载体。

46、在另一优选例中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。

47、在另一优选例中，所述的载体为农杆菌ti载体。

48、在另一优选例中，所述的构建物整合到所述载体的t-dna区。

49、在另一优选例中，所述载体是环状的或线性的。

50、本发明第四方面提供了一种基因工程细胞，所述细胞含有本发明第一方面所述的核酸构建物，或其基因组整合有一个或多个本发明第一方面所述的核酸构建物。

51、在另一优选例中，所述的细胞为植物细胞。

52、在另一优选例中，所述植物细胞为含有叶绿体的植物细胞。

53、在另一优选例中，所述的植物包括单子叶植物。

54、另一优选例中，所述的基因工程细胞是用选自下组的方法将权利要求1所述的核酸构建物导入细胞的：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(peg)介导法。

55、本发明第五方面提供了一种试剂，包括：

56、本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第三方面所述的载体。

57、本发明第六方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明第五方面所述的试剂。

58、在另一优选例中，所述试剂盒还含有标签或说明书。

59、本发明第七方面提供了一种本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述的试剂或本发明第六方面所述试剂盒的用途，用于改良植物农艺性状或制备改良植物农艺性状的制剂或组合物，所述改良植物农艺性状包括选自下组的一种或多种：

60、(a)增加植物的分蘖数量；和/或

61、(b)增加生物量；和/或

62、(c)增加产量；和/或

63、(d)促进植物生长发育。

64、在另一优选例中，所述增加产量包括增加单株产量。

65、本发明第八方面提供了一种改良植物农艺性状的方法，包括步骤：

66、(a)将本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述的试剂转化植物细胞，获得转化的植物细胞；

67、(b)将步骤(a)中转化的植物细胞再生成植株，从而使gad3基因在植物的叶绿体中表达，其中所述改良植物农艺性状包括选自下组的一种或多种：

68、(a)增加植物的分蘖数量；和/或

69、(b)增加生物量；和/或

70、(c)增加产量；和/或

71、(d)促进植物生长发育。

72、在另一优选例中，用选自下组的方法转化植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(peg)介导法。

73、在另一优选例中，所述方法包括步骤：

74、(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物；

75、(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而所述核酸构建物转入所述植物细胞或组织或器官；

76、(c)选择已转入所述核酸构建物的植物细胞或组织或器官；和

77、(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株，所述植株中的gad3基因在植物的叶绿体中表达。

78、在另一优选例中，所述植物细胞或组织或器官含有叶绿体。

79、本发明第九方面提供了一种制备基因工程植物的方法，所述方法包括以下步骤：

80、(a)提供植物细胞，所述植物细胞含有本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第三方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的核酸构建物；

81、(b)将(a)的植物细胞再生为植株，从而获得基因工程植物。

82、在另一优选例中，所述基因工程植物的植物农艺性状包括选自下组的一种或多种：

83、(a)增加植物的分蘖数量；和/或

84、(b)增加生物量；和/或

85、(c)增加产量；和/或

86、(d)促进植物生长发育。

87、本发明第十方面提供了一种基因工程植物，所述的植物是用本发明第九方面所述的方法制备的，或者所述植物的植物细胞中含有本发明第一方面所述的构建物或其基因组整合有一个或多个本发明第一方面所述的构建物。

88、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。