一种靶向巯基的可逆共价环肽噬菌体展示文库的构建方法及应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种靶向巯基的可逆共价环肽噬菌体展示文库的构建方法及应用。

背景技术：

1、共价配体通过动力学捕获蛋白质-配体复合物，已成为实现高亲和力与持久靶点结合的有力工具。临床成功的药物如ibrutinib和sotorasib利用不可逆共价机制，实现对治疗相关蛋白质中亲核残基的选择性修饰。然而，不可逆共价抑制剂的选择性有限，易与非靶标亲核残基发生非特异性反应，且共价键的永久性使其作用时间无法调控，从而增加长期毒性风险。因此，可逆共价策略应运而生，旨在保留共价结合的动力学优势，同时提高选择性和安全性。

2、设计有效的可逆共价抑制剂需要对弹头基团的共价反应速率、可逆性和化学稳定性进行精细调控。在靶向半胱氨酸的弹头中，α-氰基丙烯酰胺因其反应速率易于调控而备受关注。研究表明，在α,β-不饱和michael受体的α位引入氰基可将不可逆的硫醇加成转化为可逆过程，通过对α位和β位进行空间和电子特性的修饰可精确控制加合物的驻留时间。然而，现有研究多集中于单点修饰或少数几个取代基的考察，缺乏对α-取代基同时影响水解稳定性、硫醇反应动力学和加合物解离半衰期的系统性评价。特别是，如何在同一个弹头骨架中平衡这三种性质——使其既足够稳定以抵抗水解、又具有适中的硫醇反应性以避免非特异性捕获、同时具有足够长的加合物驻留时间以实现持久靶点占据——仍缺乏系统的构效关系研究和设计指导。

3、此外，尽管环肽因其构象刚性和较大表面积能够靶向传统小分子难以作用的蛋白界面，且噬菌体展示技术已广泛应用于环肽配体的高通量筛选，但现有平台主要依赖非共价相互作用，难以实现持久靶点占据。虽然已有研究将不可逆或可逆亲电弹头引入噬菌体展示肽库，但将经过系统性动力学优化的可调节可逆共价弹头与环肽噬菌体展示文库相结合，特别是设计能够同步实现环化与弹头安装的双功能交联剂，仍未见报道。

4、针对上述不足，本发明提出了一类α-取代基可调节的α,β-不饱和腈基可逆共价亲电试剂，通过系统的构效关系研究，能够协同优化弹头的水解稳定性、硫醇结合速率及可逆性。在此基础上，本发明进一步设计了基于1,3-二氯丙酮的双功能交联剂，能够同步完成含半胱氨酸对的多肽环化与可逆共价弹头的引入。将该策略与噬菌体展示技术相结合，构建了可逆共价环肽文库，为高亲和力环肽配体的高通量筛选提供了通用技术平台。

技术实现思路

1、本发明提供了一类可逆共价亲电试剂、双功能交联剂、可逆共价环肽噬菌体展示文库及其构建方法和应用。通过对α,β-不饱和腈类弹头的α-取代基进行系统优化，本发明获得了可调节水解稳定性、硫醇结合速率及可逆性的弹头；在此基础上，设计合成了基于1,3-二氯丙酮的双功能交联剂，实现了多肽环化与弹头引入的同步安装；结合噬菌体展示技术，构建了可逆共价环肽高通量筛选平台，并成功获得了靶向keap1的高亲和力环肽。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供了一类可逆共价亲电试剂、双功能交联剂、可逆共价环肽噬菌体展示文库及其构建方法和应用。通过对α,β-不饱和腈类弹头的α-取代基进行系统优化，本发明获得了可调节水解稳定性、硫醇结合速率及可逆性的弹头；在此基础上，设计合成了基于1,3-二氯丙酮的双功能交联剂，实现了多肽环化与弹头引入的同步安装；结合噬菌体展示技术，构建了可逆共价环肽高通量筛选平台，并成功获得了靶向keap1的高亲和力环肽。

4、第一方面，本发明提供了一类可逆共价亲电试剂，具有式（i）所示结构：

5、；

6、式（i）中，r如附图1中所示。

7、第二方面，本发明提供了一种用于构建靶向巯基的可逆共价环肽噬菌体展示文库的双氯衍生物，具有式（ii）所示结构：

8、 ；

9、式（ⅱ）中，r具体结构如附图3所示。

10、优选的，所述双氯衍生物选自化合物16、17、18中的任一种，其化学结构如附图3所示。

11、上述双氯衍生物的合成方法包括以下步骤：

12、（1）将式（ⅰ）中化合物6、7、8与2-(氨基氧基)乙胺、edc/nhs在50mm tris中进行酰胺缩合反应，得到中间体式（ii-a）：

13、；

14、（2）将式（ii-a）中间体与1,3-二氯丙酮在含有0.1%tfa的dmso中反应得到式（ⅱ）目标化合物。

15、优选的，所述双氯衍生物选自以下化合物16、17、18中的任一种，其结构如附图3所示。

16、第三方面，本发明提供了一种靶向巯基的可逆共价环肽的制备方法，包括：含有两个半胱氨酸残基的线性肽先用还原剂还原二硫键，再与式(ii)所示的双氯衍生物反应，使双氯衍生物的两个氯原子与线性肽的两个半胱氨酸残基的巯基发生取代反应，形成环肽，同时保留α,β-不饱和腈基结构。

17、第四方面，本发明提供了一种靶向巯基的可逆共价环肽噬菌体展示文库的构建方法。该方法首先通过pcr扩增获得噬菌粒载体，经notⅰ酶切处理后，利用t4连接酶进行连接反应构建dna文库，再将该dna文库电转化至宿主菌中，使用辅助噬菌体m13ko7-δp3侵染，组装出多价展示的含半胱氨酸对的随机肽的噬菌体库；最后将获得的噬菌体文库与式(ii)所示的双氯衍生物反应，使双氯衍生物与所述半胱氨酸对发生交联，同时引入可逆共价亲电弹头，获得可逆共价环肽噬菌体展示文库。

18、优选地，所述噬菌粒载体采用pcantab-5e，在噬菌体p3蛋白的n端融合表达cxnc随机肽序列；其中x为随机氨基酸，n为任意正整数；所述随机肽序列通过nnk简并密码子编码。

19、更优选的，n=9。

20、优选地，所述辅助噬菌体的制备方法为：将m13ko7-δp3质粒转化至工程菌中，经卡那霉素筛选获得阳性克隆菌；将阳性克隆菌扩大培养后，经peg 8000/nacl沉淀纯化，获得缺失p3基因的m13ko7-δp3辅助噬菌体。

21、更优选的，工程菌的构建方法为：将编码cas9酶的pcas质粒转化至大肠杆菌tg1中并制备成感受态细胞，再将ptarget质粒和编码p3蛋白的基因共转化到上述感受态细胞中，经鉴定基因敲入成功后，采用无抗生素培养传代方法丢失ptarget质粒，丢失成功后采用28-32℃培养以丢失温度敏感型质粒pcas，最终得到p3基因整合至基因组的tg1工程菌。

22、第五方面，本发明提供了一种靶向keap1的可逆共价环肽的筛选方法。具体地，以keap1蛋白为靶标，对第五方面构建的可逆共价环肽噬菌体展示文库进行亲和筛选。经过2-4轮筛选后，获得富集的噬菌体。将这些噬菌体感染宿主菌，从感染后的宿主菌中提取质粒，对质粒中编码环肽的核酸序列进行测序，确定环肽的氨基酸序列。

23、第六方面，本发明提供了一种靶向巯基的可逆共价环肽。该环肽由第四方面所述方法制备，其中线性肽的氨基酸序列选自seq id no:1-3中的任一种，双氯衍生物选自化合物16、17、18中的任一种。具体地：当线性肽为seq id no:1时，与化合物16、17、18分别反应得到环肽30、33、36；当线性肽为seq id no:2时，与化合物16、17、18分别反应得到环肽31、34、37；当线性肽为seq id no:3时，与化合物16、17、18分别反应得到环肽32、35、38。

24、优选的，所述可逆共价环肽为化合物32，其结构如附图9所示。该化合物32与keap1的抑制常数

ki为3.7 nm，具有最优的亲和力。

25、第七方面，本发明提供了上述可逆共价环肽的用途，所述的可逆共价环肽在如下至少一项中的用途：

26、（1）用于制备调节keap1-nrf2信号通路的药物；

27、（2）用于检测keap1蛋白；

28、（3）用于制备检测keap1蛋白的检测试剂；

29、（4）用于制备治疗keap1相关疾病的药物。

30、第八方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述可逆共价环肽以及药学上可接受的载体。

31、第九方面，本发明提供了一种keap1检测试剂盒，其包含上述可逆共价环肽。

32、本发明相比现有技术具有以下优点：

33、（1）与之前的可逆共价弹头缺乏系统性构效关系研究不同，本发明首次系统性的建立了α,β-不饱和腈类弹头的α-取代基与水解稳定性、硫醇结合速率及可逆性之间的构效关系，实现了弹头性质的协同调控，为可逆共价抑制剂的理性设计提供了指导。

34、（2）现有噬菌体展示平台主要依赖非共价相互作用，难以实现持久靶点占据。本发明将可调节的可逆共价化学与噬菌体展示技术相结合，构建可逆共价环肽文库，突破了非共价作用在亲和力及驻留时间方面的局限，为高亲和力可逆共价环肽的高通量筛选提供了通用平台。

35、（3）利用上述平台，本发明成功筛选出靶向keap1的高亲和力可逆共价环肽（

ki=3.7 nm），验证了该平台在复杂靶标配体发现中的有效性，为相关疾病的诊断与治疗提供了新型分子工具。