一种通过增强子影响猪窝总产仔数的分子遗传标记及其应用

本发明属于细胞工程和基因工程，具体涉及一种snp通过影响增强子在调控窝总产仔数中的应用。

背景技术：

1、卵泡作为卵巢内最基本的结构和功能单位，是卵母细胞发育与成熟的载体，其发育状态直接决定雌性个体的生殖潜力。卵巢卵泡的总数在生命早期就被确定，随着年龄的增长，不断消耗至耗竭会导致生殖衰老。卵泡发育经过原始、初级和次级卵泡阶段，然后获得窦腔（三级卵泡和成熟卵泡）。在窦状期后，卵泡发育有两种命运，大约有99%的卵泡发生闭锁，只有少数卵泡在初情期后发生的循环gn刺激下，达到排卵前阶段。在卵泡发育过程中，颗粒细胞可通过焦亡参与卵泡命运调控，当颗粒细胞焦亡达到一定程度时，可认为卵泡已进入闭锁状态。卵泡的大量闭锁将导致排卵率下降，进而显著降低哺乳动物的繁殖性能。因此，母猪卵巢卵泡的生长发育状况是影响其繁殖能力的关键因素，并直接关系到养殖生产的经济效益。

2、卵泡闭锁的发生与颗粒细胞（granulosa cells, gcs）焦亡密切相关。在实际生产中，因不能按时发情或不发情而被淘汰的雌性哺乳动物，严重影响其利用效率及养殖场经济效益。其主要原因一方面在于卵巢卵泡发育不足，激素分泌水平较低，难以维持正常的发情周期；另一方面，卵泡内颗粒细胞焦亡水平异常升高，导致炎性因子释放及细胞膜结构受损，从而破坏卵泡微环境稳态，促进卵泡闭锁的发生，并加速原始卵泡储备的消耗，最终引起卵巢功能减退。

3、

rock2（rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2）基因编码rho相关蛋白激酶2，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛参与细胞骨架重塑、细胞增殖、迁移及程序性细胞死亡等多种生物学过程。作为rhoa信号通路的重要下游效应分子，rock2可通过调控肌动蛋白细胞骨架及相关信号通路，影响细胞形态及功能状态。近年来研究表明，rock2在炎症反应及细胞死亡调控中发挥重要作用，尤其与炎性程序性细胞死亡（焦亡）相关信号通路密切相关。

4、增强子（enhancer）是基因组中重要的顺式作用调控元件，通常分布于基因的上游、下游或内含子区域，能够在较远距离内调控靶基因的转录活性。增强子通过结合特定转录因子及共激活因子，促进rna聚合酶ⅱ的募集，并通过改变染色质空间构象与靶基因启动子形成相互作用，从而增强基因的转录效率。活性增强子通常伴随特征性组蛋白修饰标记，如h3k27ac和h3k4me1，并可转录产生增强子rna（enhancer rna, erna），参与转录调控过程。然而，现有技术中关于增强子的研究多集中于疾病或细胞工程领域，对于增强子在特定组织或细胞类型中的功能调控机制仍缺乏系统研究，尤其是在卵巢颗粒细胞及其相关生理过程中的作用尚不明确。

5、单核苷酸多态性（snp）是基因组中最常见的遗传变异类型，具有分布广泛、遗传稳定性高及易于检测等特点，已成为畜禽遗传改良的重要分子标记。通过全基因组关联分析（gwas），已在多种猪群中鉴定出大量与窝总产仔数等繁殖性状显著相关的snp位点。进一步研究表明，绝大多数与复杂性状相关的snp位于基因组非编码区，尤其富集于增强子等顺式调控元件。这类变异可通过影响转录因子结合或染色质可及性，调控靶基因转录活性，进而导致表型差异。因此，解析增强子区域snp的功能及其对基因表达的调控机制，对于揭示繁殖性状的分子基础具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供snp、增强子和

rock2基因相关生物材料在调控窝重产仔数中的应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种snp分子标记或用于检测其的引物对的应用，所述snp分子标记为snprs335005633，位于猪参考基因组sscrofa11.1第3号染色体125191723 bp位点，该位点表现出g/a多态性；所述的应用为如下应用中的至少一种：

4、1）在评估猪繁殖性状中的应用；

5、2）在筛选高繁殖性能候选种猪中的应用。

6、进一步地，gg基因型个体的窝总产仔数显著高于aa基因型，gg基因型个体的初情日龄显著短于aa基因型。

7、

rock2基因相关生物材料的应用，所述的生物材料为如下物质a、b、c、d、中的任意一种或多种：

8、a.

rock2基因增强子snp区域核酸分子；

9、b.

rock2基因增强子核酸分子、

rock2基因增强子核心功能区核酸分子或其同源核酸分子；

10、c.

rock2基因全长基因组dna、cds或其同源核酸分子；

11、d.

rock2基因编码的蛋白或其同源氨基酸。

12、进一步地，所述的应用为调控繁殖形状或性能的应用。

13、更进一步地，所述的应用为如下应用ⅰ、ⅱ、ⅲ、iv中的任意一种或多种：

14、i、调控卵泡发育/制备调控卵泡发育产品中的应用；

15、ii、调控颗粒细胞焦亡/制备调控颗粒细胞焦亡产品中的应用；

16、iii、调控初情日龄/制备调控初情日龄产品中的应用。

17、iv. 调控窝总产仔数/制备调控窝总产仔数产品中的应用。

18、进一步地，所述的产品选自饲料、饲料添加剂、实验试剂、化学试剂和药物中的至少一种。所述药物与试剂彼此独立地存在。

19、进一步地，所述的应用为在哺乳动物中的应用。

20、进一步地，所述的应用为在猪或鼠中的应用。

21、进一步地，应用ⅰ包括：抑制或部分抑制b、c或d的试剂在促进卵泡发育/制备促进卵泡发育产品中的应用。

22、进一步地，应用ⅰi包括：抑制或部分抑制b、c或d的试剂在抑制颗粒细胞焦亡/制备抑制颗粒细胞焦亡产品中的应用。

23、进一步地，应用iiⅰ包括：抑制或部分抑制b、c或d的试剂在缩短初情日龄/制备缩短初情日龄产品中的应用。

24、进一步地，应用ⅰv包括：抑制或部分抑制b、c或d的试剂在提高窝总产仔数/制备提高窝总产仔数产品中的应用。

25、进一步地，当所述的应用为在猪中的应用时：

26、a中所述

rock2基因增强子snp区域位于chr3：125191723 bp。

27、b中所述增强子位于chr3：125190740-125191802 bp。

28、c中所述的全长基因组dna的核苷酸如ncbi gene id：397445（ncbi referencesequence：nc_010445.4）的序列所示；cds的核苷酸如ncbi xm_021087837.1的序列所示。

29、d中所述的蛋白的氨基酸如ncbi xp_020943493.1的序列所示。

30、进一步地，当所述的应用为在鼠中的应用时：

31、c中所述的全长基因组dna的核苷酸序列如ncbi gene id：19878（ncbi referencesequence：nc_000078.7）的序列所示；cds的核苷酸序列如genbank：xm_036157270.1的序列所示。

32、d中所述的蛋白的氨基酸序列如genbank：xp_036013164.1的序列所示。

33、进一步地，所述的同源核酸分子是指与核酸分子的核苷酸序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的核酸分子。

34、进一步地，所述的同源氨基酸是指与蛋白的氨基酸序列至少具有60%、至少具有65%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的氨基酸。

35、进一步地，抑制或部分抑制b、c或d的试剂包括sgrna、sirna、shrna或包含其的敲除重组载体。

36、当所述的应用为在猪中的应用时，所述的sgrna对应的靶向序列为如下至少一种：

37、rock2-sgrna1：5′-cgtgatggacgtgactacga-3′（seq id no.1）

38、rock2-sgrna2：5′-ctggccacgaaacaatgcgt-3′（seq id no.2）

39、rock2-sgrna3：5′-gactagacacgagtataacg-3′（seq id no.3）

40、rock2-sgrna4：5′-cctaaggttgactcattaac-3′（seq id no.4）。

41、当所述的应用为在猪或鼠中的应用时，所述的sirna对应的靶向序列为如下至少一种：

42、rock2-sirna1：5′-ggauaaacauggacaucuatt-3′（seq id no.5）

43、rock2-sirna2：5′-ugaagaaagucaagagauutt-3′（seq id no.6）

44、rock2-sirna3：5′-ugaaagagcuggagaucaatt -3′（seq id no.7）。本发明的验证结果如下：

45、1. snp rs335005633影响增强子活性

46、本发明通过全基因组关联分析发现snp位点与繁殖性状相。对增强子erock2区域组蛋白修饰物的富集水平进行分析，结果显示，该区域增强子组蛋白修饰物h3k27ac、h3k4me1等显著富集。进一步构建增强子双荧光载体，转染至gcs内，增强子区域荧光素酶活性显著升高。构建增强子e1 1-1062 bp、e2 1-889 bp和e3 1-456 bp的双荧光截短片段载体，荧光素酶活性检测表明e1、e2和e3均显著提高了荧光素酶活性，其中，e1组的相对荧光素酶活性最高，显著高于e2组（p<0.05），而e2与e3组无显著差异。进一步构建snp双荧光载体并命名为pgl3-aa。结果表明，与g等位基因相比，a等位基因的增强子活性显著降低。

47、2. 增强子促进

rock2表达

48、本发明通过将构建好的erock2表达载体转入gcs中，qrt-pcr结果表明转染不同浓度的pcdna3.1-erock2质粒后，erna的水平均显著升高，其中转染400 ng/ml浓度的组中rock2的mrna含量最高。qrt-pcr和wb检测发现，转染增强子表达载体显著提高了靶基因的mrna和蛋白水平。针对增强子设计sgrna，效率检测后，将sgrna分别与crispr-dcas9-vp64激活系统或crispr-dcas9-krab沉默系统共转染至gcs中。qrt-pcr和wb检测结果表明，激活增强子，erna及

rock2的mrna和蛋白表达量均显著上调；沉默增强子，erna及其靶基因

rock2mrna和蛋白表达量显著降低。atac-qpcr结果显示，定点激活erock2后染色质可及性显著升高，而定点抑制则显著降低erock2染色质可及性。3c-pcr结果表明，erock2与

rock2启动子之间形成染色质环。

49、

3. rock2促进卵巢颗粒细胞焦亡

50、本发明通过将构建好的

rock2过表达载体和

rock2小干扰片段转入gcs中，qrt-pcr结果表明转染400 ng/ml和1000 ng/ml浓度的pcdna3.1-rock2质粒后，

rock2的mrna水平显著升高，其中转染400 ng/ml浓度的组中

rock2的mrna含量最高；显示si-

rock2-1和si-

rock2-2均显著降低

rock2的mrna水平，并且si-

rock2-1干扰效果最佳。qrt-pcr和wb检测发现，过表达

rock2显著提高了焦亡信号通路中

casp1、casp4、gsdmd、gsdme、asc的mrna水平，而干扰

rock2表现出相反的作用效果。随后，通过流式细胞术分析，过表达

rock2显著促进gcs焦亡；干扰

rock2显著降低了焦亡细胞的百分比。

51、

4. rock2增强子促进颗粒细胞焦亡

52、本发明通过将构建好的增强子重组载体转入gcs，通过qrt-pcr检测转染效率，结果显示400 ng/ml浓度的pcdna3.1-erock2组转染效果最好。进一步检测靶基因

rock2的mrna和蛋白表达水平，发现转染增强子重组载体显著提高

rock2的mrna和蛋白水平。进一步利用crispra激活增强子，

rock2和其下游焦亡信号通路中

casp1、casp4、gsdmd、gsdme、asc的mrna水平显著上升，而利用crispri抑制增强子，

rock2和其下游焦亡通路基因水平则显著下降。同时，流式细胞术和qrt-pcr结果也表明，转染增强子重组载体后颗粒细胞焦亡信号通路和细胞焦亡水平显著上升，而转染增强子重组载体并干扰

rock2颗粒细胞焦亡信号通路和细胞焦亡水平显著下降。

53、5.

rock2促进小鼠卵泡发育

54、本发明通过将过表达

rock2以及敲低

rock2的慢病毒载体腹腔注射如小鼠体内，通过qrt-pcr和wb检测发现与注射lv-nc的小鼠相比，注射lv-

rock2的小鼠卵巢中

casp1、

casp4、gsdmd、gsdme及asc的mrna的mrna水平显著提高。与对照组相比，sh-rock2组卵巢中黄体数量和有腔卵泡比例显著增加，而腔前卵泡的数量和比例显著下降；相反，在lv-rock2中，有腔卵泡和黄体数量下降，同时腔前卵泡所占比例显著升高。与lv-nc组相比，lv-rock2处理组小鼠的初情启动日龄显著延迟，小鼠的窝总产仔数显著降低；而sh-rock2组小鼠初情启动日龄显著提前，窝总产仔数显著上升。综上，

rock2能够抑制小鼠卵巢卵泡的生长发育，延缓初情日龄，降低窝总产仔数。

55、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

56、本发明以snp-增强子-

rock2基因为研究对象，采用了分子和细胞生物学方法研究其在窝总产仔数中的应用，从多层次、多角度验证增强子和

rock2基因调控对卵巢卵泡的生长发育影响。本发明能够为母猪繁殖性能的遗传改良提高新参考，具有良好的应用价值。