一种利用Kosakoniasp.菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌及其制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种利用kosakonia sp菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌，还涉及其制备方法，以及所述重组菌在以葡萄糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

背景技术：

1、母乳寡糖（human milk oligosaccharides，hmos）是母乳中天然存在的第三大固体成分，含量仅次于乳糖及脂肪，具有重要的免疫活性，对婴幼儿的生长发育影响重大。作为其中分泌最为丰富的功能性成分，由d-半乳糖、d-葡萄糖和l-岩藻糖组成的岩藻糖基乳糖（2′-fl 和 3-fl）备受关注。多项研究表明岩藻糖基乳糖可以显著改善婴儿肠道菌群并影响幼婴的认知发育，占比最高的2′-fl目前已被批准作为婴儿奶粉的营养添加剂使用。另外，2′-岩藻糖基乳糖的益生元特性使其亦可作为皮肤保养的活性成分在化妆品领域发挥功效，应用潜力巨大。

2、目前，2′-岩藻糖基乳糖的生产主要依赖以甘油为底物的模式微生物大肠杆菌的发酵合成。但是，由于需要通过外源途径的引入以实现关键前体gdp-l-岩藻糖的胞内积累，针对2′-岩藻糖基乳糖的规模化生产，该底盘实际并不具备发酵优势。底物成本高、碳源利用率低、发酵周期长，菌株退化风险高是当前2′-岩藻糖基乳糖生产工业化过程中面临的一系列重要问题。

3、另外，以2′-岩藻糖基乳糖为终产物的代谢改造依然处于经验积累阶段，改造周期长且复杂。基因组规模代谢网络模型是一种基于基因组注释信息系统性构建的代谢网络数学模型，用于描述目标生物体内所有已知代谢反应及其相互连接关系，可以用于分析及预测目标微生物的代谢流量分布情况，为提高微生物发酵的代谢产物提供有效帮助。目前尚未发现可以指导2′-岩藻糖基乳糖产量提高的基因组代谢模型的相关报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种利用kosakonia sp.菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌；本发明的目的之二在于提供一种所述利用kosakonia sp.菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌的制备方法；本发明的目的之三在于提供所述重组菌在以葡萄糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、一种利用kosakonia sp.菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌，所述重组菌是在敲除wcaj基因阻断gdp-fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy使代谢流向2′-岩藻糖基乳糖的kosakonia sp.cctcc m2018092菌株中进行如下改造得到的：

4、（1）敲除lacz基因，所述lacz基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、（2）敲除ptsg基因和crr基因，所述ptsg基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述crr基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；

6、（3）敲除edd基因，所述edd基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；

7、（4）敲除pgm基因，所述pgm基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；

8、（5）敲除pfka基因，所述pfka基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；

9、（6）敲除gcd基因，所述gcd基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。

10、在本发明优选的实施方案中，所述重组菌以葡萄糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖，其2′-岩藻糖基乳糖摇瓶产量达到24.78 ± 0.64 g/l。

11、在本发明优选的实施方案中，所述重组菌在5l发酵罐中发酵108 h后，2′-岩藻糖基乳糖终产量达到147.93 ± 4.16 g/l，葡萄糖转化率达到0.82 ± 0.04 g/g。

12、2、一种所述利用kosakonia sp.菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌的制备方法，包括以下步骤：

13、（1）在已敲除wcaj基因同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy的kosakonia sp. cctcc m2018092菌株中，利用crispr/cas9基因编辑系统依次敲除lacz、ptsg、crr、edd、pgm、pfka基因，获得重组菌株k02；

14、（2）在k02菌株中，利用crispr/cas9基因编辑系统敲除gcd基因，以关闭葡萄糖酸化反应，从而提高gdp-l-岩藻糖的代谢通量比例，获得所述利用kosakonia sp.菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌株。

15、在本发明优选的实施方案中，所述crispr/cas9基因编辑系统使用的质粒为pcas质粒和pcb003质粒。

16、在本发明优选的实施方案中所述lacz基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ptsg基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述crr基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述edd基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述pgm基因的核苷酸序列如seq idno.5所示，所述pfka基因的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述gcd基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。

17、3、所述重组菌在以葡萄糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

18、在本发明优选的实施方案中，所述应用包括以下步骤：

19、（1）种子培养：将重组菌接种于种子培养基中，于30 ℃、220 rpm条件下培养24小时；

20、（2）发酵罐发酵：将步骤（1）所得种子液按10%接种量接种于发酵培养基中，于30℃、ph 6.9、转速500 rpm条件下发酵108小时，发酵过程中当葡萄糖浓度降至20 g/l时开始匀速补加葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5~20 g/l。

21、在本发明优选的实施方案中，所述种子培养基包含：葡萄糖30 g/l、胰蛋白胨3.6g/l、酵母粉7.2 g/l。

22、在本发明优选的实施方案中，所述发酵培养基包含：葡萄糖60 g/l、胰蛋白胨3.6g/l、酵母粉7.2 g/l、kh2po40.7 g/l、(nh4)2hpo40.4 g/l、mgso4·7h2o 1 g/l、nacl 0.5 g/l、一水柠檬酸0.8 g/l、吐温80 3 ml/l、消泡剂1 ml/l、乳糖30 g/l。

23、本发明的有益效果在于：本发明在基因组规模代谢网络模型的指导下对一株具有gdp-l-岩藻糖生产偏好性的kosakonia sp. cctcc m2018092菌株进行改造。通过fba分析预测关键葡萄糖分支代谢节点基因gcd，使得2′-岩藻糖基乳糖摇瓶产量提升101%，在5l发酵罐发酵108 h后终产量达到147.93 ± 4.16 g/l，葡萄糖转化率达到0.82 ± 0.04 g/g，实现以葡萄糖为碳源的2′-岩藻糖基乳糖高效生产。

1.一种利用kosakonia sp.菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于，所述重组菌是在敲除wcaj基因阻断gdp-fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy使代谢流向2′-岩藻糖基乳糖的kosakoniasp. cctcc m2018092菌株中进行如下改造得到的：

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以葡萄糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖，其2′-岩藻糖基乳糖摇瓶产量达到24.78 ± 0.64 g/l。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌在5l发酵罐中发酵108 h后，2′-岩藻糖基乳糖终产量达到147.93 ± 4.16 g/l，葡萄糖转化率达到0.82 ± 0.04 g/g。

4.一种如权利要求1-3任一项所述利用kosakonia sp.菌株改造生产2′-岩藻糖基乳糖的重组菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑系统使用的质粒为pcas质粒和pcb003质粒。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述lacz基因的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述ptsg基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述crr基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述edd基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述pgm基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述pfka基因的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述gcd基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。

7.如权利要求1-3任一项所述重组菌在以葡萄糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述种子培养基包含：葡萄糖30 g/l、胰蛋白胨3.6 g/l、酵母粉7.2 g/l。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包含：葡萄糖60 g/l、胰蛋白胨3.6 g/l、酵母粉7.2 g/l、kh2po4 0.7 g/l、(nh4)2hpo4 0.4 g/l、mgso4·7h2o 1 g/l、nacl 0.5 g/l、一水柠檬酸0.8 g/l、吐温80 3 ml/l、消泡剂1 ml/l、乳糖30 g/l。