一种高褐藻二、三糖含量的海藻酶解液的制备方法及其应用

本发明涉及农业生物，具体涉及一种高褐藻二、三糖含量的海藻酶解液的制备方法及其应用。

背景技术：

1、海藻是地球上最古老的生物之一，分为褐藻、红藻、绿藻三大类，海带、裙带菜均为大宗经济褐藻。褐藻细胞壁富含褐藻胶（聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸），经降解得到的褐藻寡糖是天然植物生物刺激素，可诱导作物抗逆、促进种子萌发、刺激根系生长，在水稻绿色栽培领域具备极高应用价值。

2、现有海藻酶解液制备方法存在明显缺陷，化学降解法强酸/强碱高温裂解，反应剧烈，寡糖糖苷键无选择性断裂，产物聚合度分布杂乱，二糖、三糖占比极低；产生大量酸碱废液，污染环境，寡糖活性基团被破坏，促生效果大幅下降，无法适配水稻种子浸种需求；物理降解法仅破碎细胞壁，褐藻胶大分子降解不彻底，产物大分子多糖占比高，难以被水稻种子快速吸收，批次产物聚合度差异大，品质不稳定，规模化加工能耗成本高；酶解法直接对海藻粉进行酶解，褐藻胶分子内部氢键、致密结晶结构阻碍酶分子接触酶切位点，酶催化效率低、反应周期长，产物平均聚合度高，高活性二糖、三糖总占比不足；且褐藻胶裂解酶热稳定性差，单位产物酶耗量大，工业化生产成本高。

技术实现思路

1、针对上述不足，本发明的目的在于提供一种高褐藻二、三糖含量的海藻酶解液的制备方法及其应用，提供了一种利用氯化胆碱-乳酸 des 预处理耦合褐藻胶裂解酶定向降解、高富集褐藻二、三糖的一体化绿色制备工艺，同时建立适配水稻浸种育苗的完整应用方法。

2、本发明为实现技术目的采用的技术方案为：

3、本发明提供了一种高褐藻二、三糖含量的海藻酶解液的制备方法，包括：

4、（1）des 预处理：将海藻粉与氯化胆碱-乳酸低共熔溶剂按固液比 1:15~1:25 g/ml 混合，60~100℃搅拌提取 1~3 h，固液分离收集提取液；

5、（2）醇沉分离：向步骤（1）得到的提取液中加入 3~5 倍体积无水乙醇，低温静置醇沉，离心收集沉淀，无水乙醇洗涤沉淀；

6、（3）定向酶解反应：将步骤（2）得到的沉淀采用缓冲液复溶后，加入褐藻胶裂解酶，在25~55℃、ph 6.0~10.0 条件下酶解 2~24 h；

7、（4）离心纯化：将步骤（3）得到的酶解混合液离心，保留上清液，即为高褐藻二、三糖含量的海藻酶解液。

8、优选的是，步骤（1）中，所述氯化胆碱-乳酸低共熔溶剂中氯化胆碱与乳酸的摩尔比为1:2，含水量10~30%。

9、优选的是，步骤（2）中，4℃静置醇沉12小时，10000 r/min离心20分钟，收集沉淀。

10、优选的是，步骤（3）中，所述褐藻胶裂解酶的终浓度 40~70 u/ml；所述缓冲液采用ph 6.0~10.0 的pbs 缓冲溶液。

11、优选的是，步骤（1）中，提取温度为70~85℃；步骤（3）中，酶解条件为温度 35~45℃，ph 8.5~9.0，时间10~14 h。

12、优选的是，步骤（4）中，离心转速为6000~12000rpm，离心时间为20~30分钟。

13、本发明还提供了一种高褐藻二、三糖含量的海藻酶解液，通过上述制备方法得到，所述海藻酶解液中，活性组分褐藻二糖 42~48 wt%、褐藻三糖 35~40 wt%。

14、本发明又提供了海藻酶解液在水稻促生中的应用，包括：

15、促进水稻种子萌发：将消毒后的干净水稻种子置于50~1000倍（更优选150~250倍）稀释的所述海藻酶解液中，浸泡萌发24~48小时；

16、促进水稻幼苗生长：在水稻幼苗两叶一心期采用150~250 倍稀释的所述海藻酶解液叶面喷施。

17、优选的是，促进水稻幼苗生长包括：增加幼苗的苗长、根长以及侧根数。

18、优选的是，采用以下方法获得消毒后的干净水稻种子：选择颗粒大小一致，圆润饱满的水稻种子用清水清洗2~3次后，使用1~10%次氯酸钠溶液浸泡消毒15~25分钟，清水清洗2~5次洗净残留的溶液。

19、优选的是，在27~29℃恒温光照培养箱中浸种萌发，光照强度3000 lx，光照/黑暗周期14 h/10 h。

20、本发明的有益效果在于：

21、采用低共熔溶剂与酶解法联用绿色制备海藻酶解液，二者存在协同增效作用：des氢键解离作用破坏褐藻胶规整结晶结构，暴露出大量隐藏的酶切位点；后续酶解可精准断裂褐藻胶中间糖苷键，而非无规降解，最终实现褐藻二糖（dp2）含量达到42~48%、褐藻三糖（dp3）含量达到35~40%，总占比≥77%，平均聚合度仅 2.4；对比仅单纯酶解工艺（平均聚合度 4.2（刘瑞志，2009），褐藻二、三糖总占比不足 60%），产生预料不到的寡糖组分富集效果；低聚合度产物的获得，使本发明制备的海藻酶解液具有更高的植物促生活性和抗逆诱导活性。

22、针对水稻种子萌发、幼苗根系发育定制稀释浓度、浸种时长、温湿度、叶面补喷配套方案，水稻促生效果显著，能够实现发芽率、根长、侧根数三重指标大幅提升。

1.一种高褐藻二、三糖含量的海藻酶解液的制备方法，包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氯化胆碱-乳酸低共熔溶剂中氯化胆碱与乳酸的摩尔比为1:2，含水量10~30%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，4℃静置醇沉12小时，10000 r/min离心20分钟，收集沉淀。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述褐藻胶裂解酶的终浓度 40~70 u/ml；所述缓冲液采用ph 6.0~10.0 的pbs 缓冲溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，离心转速为6000~12000rpm，离心时间为20~30分钟。

6.一种高褐藻二、三糖含量的海藻酶解液，其特征在于，通过权利要求1~5任意一项所述的制备方法得到，所述海藻酶解液中，活性组分褐藻二糖 42~48 wt%、褐藻三糖 35~40wt%。

7.权利要求6所述的海藻酶解液在水稻促生中的应用，包括：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，促进水稻幼苗生长包括：增加幼苗的苗长、根长以及侧根数。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用以下方法获得消毒后的干净水稻种子：选择颗粒大小一致，圆润饱满的水稻种子用清水清洗2~3次后，使用1~10%次氯酸钠溶液浸泡消毒15~25分钟，清水清洗2~5次洗净残留的溶液。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在27~29℃恒温光照培养箱中浸种萌发，光照强度3000 lx，光照/黑暗周期14 h/10 h。