下一代测序分析中的三维碱基判读的制作方法

本公开的实施例一般涉及测序数据分析中的图像处理和碱基判读，并且具体涉及原位样品的三维(3d)图像。

背景技术：

1、在下一代测序(ngs)或ngs样应用（诸如合成法测序、结合法测序或亲合力测序）中，为了鉴定靶标核酸的序列，一次一个核苷酸碱基合成新的链。在每个测序循环中，一个碱基附接至任何给定的链。在每个循环的成像步骤中，记录图像。将碱基判读算法应用于图像，以“读取”来自每个簇或聚合酶克隆(polony)的连续信号，并且将光学信号转换为添加至每个dna片段的核苷酸碱基序列的识别。传统测序数据分析依赖于二维(2d)流动池图像。当对原位样品诸如细胞或组织进行测序分析时，样品沿着垂直于图像平面的z方向具有厚度。因此，在选定的z层级处的流动池图像可包括来自定位于相邻z层级处的失焦聚合酶克隆的信号和其他不期望的信号，例如来自细胞膜的信号。对于快速且准确的三维(3d)流动池图像处理和碱基判读存在需求，以确保对3d样品诸如细胞和组织进行可靠的碱基判读和测序分析。

技术实现思路

1、本文提供了系统、设备、方法和/或计算机程序产品实施例和/或它们的组合和子组合，其能够实现快速且准确的流动池图像处理，以用于样品诸如原位细胞或组织的可靠且准确的碱基判读。流动池图像可来自不同的测序循环和/或不同的通道。

2、作为此类的具体应用，本文公开了用于处理3d体积样品（例如，细胞或组织）的流动池图像的图像处理的方法、系统和介质的实施例，使得能够依赖于图像强度、簇或聚合酶克隆位置和/或尺寸来进行准确的碱基判读。本文的图像处理方法可逆转光学系统的成像过程，并且实际上改善光学系统的半高全宽(fwhm)。因此，本文所公开的图像处理方法可以有利地增加3d样品或传统2d样品中聚合酶克隆或簇的可检测密度。本文的方法可通过以计算方式提高流动池图像的空间分辨率来有利地减少可能由2d或3d维度上的邻近聚合酶克隆引起的聚合酶克隆的颜色混合的影响。

3、在一些实施例中，使用神经网络（例如卷积神经网络）从已从测序系统获取的低分辨率z堆叠生成3d样品流动池图像的高分辨率z堆叠，并且后续的初级分析可基于高分辨率流动池图像而非低分辨率流动池图像来执行。在一些实施例中，在样品的流动池图像的高分辨率z堆叠的图像处理中使用神经网络（例如，卷积神经网络），以生成碱基判读。

4、这些方面的实施例包括对应的计算机系统、设备和记录在计算机存储装置上的计算机程序产品，其单独或组合地被配置成执行该方法的操作。对于被配置或待配置成执行操作的计算机系统，该计算机系统已在其上安装了在操作中使该计算机系统执行该操作或动作的软件、固件、硬件或它们的组合。对于被配置或待配置成执行操作或动作的计算机程序产品，该计算机程序产品包括当由硬件处理器执行时使得硬件处理器执行操作或动作的指令。

5、下面参考附图详细描述本公开的另外的实施例、特征和优点，以及本公开的各个实施例的结构和操作。

1.一种计算机实现的方法，其包括：

2.一种用于预测碱基判读结果的计算机实现的方法，其包括：

3.根据权利要求2所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

4.根据权利要求2所述的计算机实现的方法，其中所述一个或多个像素包括不包含在所述聚合酶克隆图的任何聚合酶克隆中的至少一个像素。

5.根据权利要求2所述的计算机实现的方法，其中所述一个或多个像素包括不包含在所述聚合酶克隆图中任何聚合酶克隆中的至少一个像素和包含在所述聚合酶克隆图中至少一个聚合酶克隆中的至少一个像素。

6.根据权利要求2所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

7.根据权利要求3所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

8.根据权利要求7所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

9.根据权利要求8所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

10.根据权利要求2至9中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述神经网络使用训练流动池图像的训练数据集进行预训练。

11.根据权利要求10所述的计算机实现的方法，其中所述神经网络在操作(iia)之前使用训练流动池图像的训练数据集进行预训练。

12.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述神经网络在操作(iia)之后且在操作(iii)之前不进行训练或重新训练。

13.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述样品在其内包含多联体分子，并且所述第一多个流动池图像是在不同z位置的z堆叠处获取的，沿z方向具有所述第一分辨率。

14.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一多个流动池图像是从单一颜色通道获取的。

15.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述一个或多个循环包括当前循环n，并且所述第一多个流动池图像是从所述当前循环n之前的至少一个循环获取的。

16.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述一个或多个循环包括测序运行中的多个循环。

17.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(iia)通过所述第一可重构装置或所述集成电路，基于所述第二多个流动池图像来确定所述聚合酶克隆图包括：

18.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(iia)包括：

19.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第三分辨率在一个或多个空间维度上为所述第一分辨率或所述第二分辨率的至少2倍至32倍大。

20.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第三分辨率在一个或多个空间维度上大于所述第一分辨率和所述第二分辨率。

21.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述聚合酶克隆图包括所述第二多个流动池图像中的至少一些聚合酶克隆中的每一个的空间坐标。

22.根据权利要求2至21中任一项所述的计算机实现的方法，其中(ii)通过所述处理器或所述第一可重构逻辑装置将所述第二多个流动池图像作为输入提供给所述神经网络包括：

23.根据权利要求2至22中任一项所述的计算机实现的方法，其中(iii)使用所述神经网络，通过所述第一可重构装置或所述集成电路来预测对应于所述第二多个流动池图像的一个或多个聚合酶克隆的碱基判读结果包括：

24.根据权利要求23所述的计算机实现的方法，其中每个对应图像块包括定位在或紧邻所述对应图像块的中心的聚合酶克隆。

25.根据权利要求23至24中任一项所述的计算机实现的方法，其中每个对应图像块沿空间维度包括2至128个像素。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的计算机实现的方法，所述多个图像块包括100至106个图像块。

27.根据权利要求23至26中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述多个图像块中的至少两个图像块包括至少部分重叠的图像块图像，所述至少部分重叠的图像块图像包括相同的像素。

28.根据权利要求23至27中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述多个图像块中的每个图像块包括与所述多个图像块中的另一图像块至少部分地重叠的像素。

29.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，所述一个或多个颜色通道包括2、3或4个颜色通道。

30.根据权利要求2至29中任一项所述的计算机实现的方法，所述方法进一步包括：

31.根据权利要求23至30中任一项所述的计算机实现的方法，其中每个图像块包括来自所述一个或多个颜色通道和一个或多个循环的一个或多个图像块图像。

32.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述一个或多个循环包括测序运行的连续循环。

33.根据权利要求23至32中任一项所述的计算机实现的方法，其中使用所述神经网络并且基于所述输入来预测所述多个碱基判读结果，其中每个碱基判读结果对应于对应图像块，包括：

34.根据权利要求23至33中任一项所述的计算机实现的方法，其中使用所述神经网络并且基于所述输入来预测所述多个碱基判读结果，其中每个碱基判读结果对应于对应图像块，包括：

35.根据权利要求23至34中任一项所述的计算机实现的方法，其中使用所述神经网络并且基于所述输入来预测所述多个碱基判读结果，其中每个碱基判读结果对应于对应图像块，包括：

36.根据权利要求35所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

37.根据权利要求36所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

38.根据权利要求2所述的方法，其中(iii)通过所述第一可重构装置或所述集成电路，使用所述神经网络来预测对应于所述第二多个流动池图像的一个或多个聚合酶克隆的一个或多个碱基判读结果包括：

39.根据权利要求1所述的计算机实现的方法，其中所述样品在其内包含多联体分子，并且其中所述第一多个流动池图像是在不同z位置的z堆叠处获取的。

40.一种计算机实现的方法，其包括：

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为包括原位细胞、组织、两者的细胞样品。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经网络为卷积神经网络。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为3d样品，并且所述神经网络为3d神经网络。

44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为2d样品，并且其中所述神经网络为2d神经网络。

45.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述神经网络为卷积神经网络。

46.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述神经网络使用基于将所述训练流动池图像的训练碱基判读结果与所述训练流动池图像的参考碱基判读结果进行比较的一个或多个损失函数进行预训练。

47.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述训练流动池图像仅来自单一颜色通道。

48.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述训练流动池图像中的每一个包括来自沿时间维度堆叠的多个测序循环的同一视场的流动池图像。

49.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述训练流动池图像中的每一个包括来自一个或多个循环的同一视场的流动池图像。

50.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述训练流动池图像中的每一个包括所述样品在一个或多个z层级处的流动池图像。

51.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(iii)使用所述神经网络来预测所述第二多个流动池图像包括预测所述第一多个流动池图像的高分辨率后处理图像，并且其中处理包括以下中的一者或多者：降噪、降背景；强度偏移校正；强度归一化；颜色校正；滞后和/或失步；图像配准；和反卷积。

52.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(v)基于所述第二多个流动池图像来对所述经确定的聚合酶克隆中的每一个执行对应的碱基判读未使用神经网络。

53.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(iv)从所述第二多个流动池图像确定所述聚合酶克隆未使用神经网络。

54.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(iv)从所述第二多个流动池图像确定所述聚合酶克隆包括从所述第二多个流动池图像确定所述聚合酶克隆中的每一个的中心的位置。

55.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(iv)从所述第二多个流动池图像确定所述聚合酶克隆未使用神经网络。

56.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述神经网络包括第一图像处理部分和第二碱基判读部分。

57.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中使用所述神经网络，通过所述第一可重构装置或所述集成电路来预测所述第二多个流动池图像包括：

58.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一图像处理部分包括以下中的一者或多者的至少部分：所述神经网络的输入层、卷积层、池化层、嵌入层、输出层和编码器，并且其中所述第二碱基判读部分缺少以下中的任一者：所述神经网络的卷积层、池化层、嵌入层、输出层、编码器和解码器。

59.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一图像处理部分包括以下中的一者或多者的至少部分：所述神经网络的输入层、卷积层、池化层、嵌入层和编码器，并且其中所述第二碱基判读部分包括以下中的一者或多者的至少部分：所述神经网络的输入层、输出层、卷积层、池化层、嵌入层、编码器和解码器。

60.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述处理器包括以下中的一者或多者：cpu、gpu、tpu、npu、fpga和ai芯片。

61.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述处理器包括以下中的一者或多者：cpu、npu和fpga。

62.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述处理器缺少任何npu、fpga或ai芯片。

63.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一可重构逻辑装置包括一个或多个fpga单元。

64.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述集成电路包括一个或多个npu、ai芯片或两者。

65.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述处理器、所述第一可重构逻辑装置和所述集成电路中的一者或多者在所述测序系统的单一外壳内包括在所述测序系统中。

66.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述集成电路与所述第一可重构逻辑装置进行数据通信。

67.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述卷积网络包括u-net。

68.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中第一卷积包括具有卷积核的3d卷积。

69.根据前述权利要求中任一项所述的测序系统，其中所述第一卷积包括具有卷积核的2d卷积。

70.根据前述权利要求中任一项所述的测序系统，其中所述卷积核具有至少三个维度。

71.根据前述权利要求中任一项所述的测序系统，其中所述神经网络为3d卷积神经网络。

72.根据前述权利要求中任一项所述的测序系统，其中所述神经网络为2d卷积神经网络。

73.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一分辨率和所述第二分辨率为3d分辨率。

74.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一多个流动池图像来自单一颜色通道。

75.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(v)通过所述处理器，基于所述第二多个流动池图像来对所述经确定的聚合酶克隆中的每一个执行对应的碱基判读包括：

76.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第三多个流动池图像是从不同于所述单一通道的一个或多个颜色通道获取的，并且其中所述第三多个流动池图像包括所述第一分辨率。

77.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第四多个流动池图像包括所述第二分辨率。

78.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一多个流动池图像来自一个或多个颜色通道。

79.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一多个流动池图像包括：在一个或多个循环中，固定在所述支持物上的多联体分子中的核苷酸碱基a、g、c和t/u的不均衡多样性。

80.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述多联体分子中的两个或更多个不同多联体分子具有对应于不同靶标rna分子或靶标cdna分子的不同插入序列。

81.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述经确定的聚合酶克隆的每个位置对应于所述多联体分子的位置。

82.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述多联体分子中的核苷酸碱基a、g、c和t/u的所述不均衡多样性包括：在所述一个或多个循环中，(1)一种或多种类型的核苷酸碱基的数量与(2)碱基的总数量的百分比小于20%、15%、10%或5%。

83.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述样品包含空间密度范围为103至1010个每mm2的过载多联体分子。

84.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一分辨率的范围为0.1 um至5 um。

85.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中下采样因子为2、4或8。

86.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中在正在执行测序运行的同时执行操作(ii)至(v)中的一者或多者。

87.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述一个或多个循环包括当前循环n。

88.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中n的范围为1至500。

89.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中在所述当前循环n之后的循环中的所述测序反应尚未执行或当前正在执行的同时执行操作(ii)至(v)中的一者或多者。

90.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中流动池图像的训练数据集包括在不同z位置处采集的流动池图像的z堆叠。

91.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第二分辨率在所有三个维度上为所述第一分辨率的至少4倍、6倍或8倍大。

92.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

93.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一多个流动池图像是从所述测序系统的单一颜色通道获取的。

94.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中(vi)通过所述处理器从所述第二多个流动池图像确定聚合酶克隆包括：

95.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中基于(iv)中的所述经确定的聚合酶克隆来生成包括聚合酶克隆的空间位置的聚合酶克隆图进一步包括：

96.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中通过所述处理器从所述第二多个流动池图像确定聚合酶克隆包括：

97.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述支持物包括玻璃或塑料基底。

98.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述支持物被包括在流动池装置中。

99.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

100.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

101.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

102.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

103.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一多个第一靶标特异性锁式探针中的单个锁式探针包含：

104.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一靶标特异性锁式探针包含第一靶标条形码序列，所述第一靶标条形码序列对应于且唯一地识别所述第一靶标cdna序列或所述第一靶标rna序列。

105.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一靶标特异性锁式探针包含第一靶标条形码序列，所述第一靶标条形码序列定位成与所述第一靶标特异性锁式探针的与所述第一靶标cdna分子或所述第一靶标rna序列选择性地杂交的区中的一者相邻。

106.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一靶标特异性锁式探针包含至少一个通用衔接子序列。

107.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一靶标特异性锁式探针包含用于滚环扩增引物的通用引物结合位点或其互补序列。

108.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一靶标特异性锁式探针包含通用压实寡核苷酸结合位点或其互补序列。

109.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中多种核苷酸试剂包括：多价分子、核苷酸、核苷酸类似物或它们的组合。

110.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中单个核苷酸或核苷酸类似物是可检测地标记的或未标记的。

111.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述可检测地标记的单个核苷酸或核苷酸类似物包含对应于每种不同类型的核苷酸碱基a、g、c和t/u的不同可检测颜色标记。

112.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中单个多价分子包含附接有多个核苷酸臂的核心，并且所述单个多价分子的每个臂包含相同类型的核苷酸碱基。

113.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中生成所述第一多个流动池图像包括：

114.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一多个流动池图像包括从与所述多个多联体分子结合的所述核苷酸试剂发射的光学颜色信号。

115.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

116.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：通过将下列操作重复至少一次来对所述多个多联体进行反复地测序：

117.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述第一测序读段产物包含以下中的一些或全部：所述第一多联体分子的一个或多个串联单元中的第一靶标条形码序列；所述第一多联体分子的一个或多个串联单元中的第一插入序列；或它们的组合。

118.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

119.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其进一步包括：

120.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中生成固定在所述支持物上的所述样品的所述第一多个流动池图像包括：

121.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中对所述样品内部的至少所述第一多联体进行测序包括：

122.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中生成固定在所述支持物上的所述样品的所述第一多个流动池图像包括：

123.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实现的方法，其中对所述细胞样品内部的至少所述第二多联体进行测序包括：