一种基于支架蛋白拓扑构象锁的酶控蛋白分子开关及其构建方法和应用

本发明涉及生物，具体涉及一种基于支架蛋白拓扑构象锁的酶控蛋白分子开关及其构建方法和应用。

背景技术：

1、蛋白质是生命的物质基础，是生命活动的主要承担者与执行者，几乎参与所有细胞过程，如催化反应、信号传导、结构支持、运输、免疫防御等。研究蛋白质功能是理解复杂生命过程以及生命机理的关键所在。蛋白分子开关可通过酶切、光、温度、小分子等外界刺激诱导自身构象发生改变，进而实现蛋白活性的开启或关闭切换，是调控及研究蛋白功能的重要工具；尤其适用于在细胞原位条件下对蛋白活性进行精准调控，为解析蛋白质功能提供了关键研究手段。

2、现有的蛋白分子开关的构建方式主要集中于二聚化调控、变构调控及肽标签介导的调控三种类型。二聚化调控型分子开关主要通过人为诱导分裂蛋白的聚合或解聚，实现蛋白的活性调控，但其分裂蛋白间存在一定的固有亲和力，在无诱导的条件下可能会自发的结合恢复活性，造成较高背景活性，调控动态范围有限。变构调控型开关通过偶联的可调控结构元件来调控蛋白的构象变化，实现蛋白活性的调控，比如gcamps、catev以及flip_gfp等，但目前基于该技术构建蛋白分子开关需要依据蛋白的不同结构设计不同的调控结构元件，通用适配性差。肽标签介导的调控型开关通过在靶蛋白两端连接可酶切肽标签，利用酶切作用改变蛋白的定位或稳定性，但该技术不适用于在细胞原位条件下对蛋白活性进行精准调控。除了以上基于天然蛋白的改造构建蛋白分子开关，随着ai设计蛋白技术的发展成熟，已有研究基于ai设计了一种通用的人工分子开关（lockr），通过“cage-latch-key”三个核心组件调控功能短肽活性的开启与关闭，但该分子开关只适用于分子量小，结构简单的功能短肽，不适用于分子量大、结构较为复杂的功能蛋白的活性调控。

3、总而言之，开发一种通用性强、高效率的构建高性能蛋白分子开关的方法，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明针对现有酶控蛋白分子开关适配性窄、背景活性高、难以兼容大分子蛋白等技术问题，提供一种基于支架蛋白拓扑构象锁的酶控蛋白分子开关及其构建方法和应用，所述酶控蛋白分子开关可实现不同类型、不同复杂度靶蛋白的通用调控，显著提升构建效率与开关性能，并解决结构复杂大分子蛋白开关化难的技术瓶颈。

2、为此，本发明的第一方面，提供一种基于支架蛋白拓扑构象锁的酶控蛋白分子开关，所述酶控蛋白分子开关包括支架蛋白、靶蛋白和蛋白酶识别切割位点；

3、其中，所述靶蛋白的n端与c端通过所述蛋白酶识别切割位点的氨基酸序列相连后利用loop环断裂位点嵌入所述支架蛋白内部，形成空间拓扑构象自锁结构；

4、常态下所述靶蛋白的构象锁定，生物学活性被抑制；

5、所述蛋白酶识别切割位点被相应的蛋白酶特异性识别并切割后，所述靶蛋白的构象锁定被解除，恢复生物学活性。

6、进一步地，

7、所述支架蛋白为具备稳定三维折叠结构的天然支架蛋白、其同源变体蛋白或人工改造支架蛋白；

8、所述靶蛋白为具备活性的功能蛋白；

9、进一步地，

10、所述靶蛋白为由dna编码的蛋白质，可选的，包括荧光蛋白、荧光素酶和t7 rna聚合酶中的一种或几种；

11、所述蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶，可选地，包括tev蛋白酶、ns3蛋白酶和caspase-3蛋白酶中的一种或几种。

12、进一步地，所述蛋白酶识别切割位点的切割方式包括：

13、蛋白酶直接识别并切割；或

14、通过外界调控因子辅助蛋白酶切割。

15、进一步地，

16、所述外界调控因子为物理调控因子，包括光照、磁场、超声波、电场和温度中的一种或几种，通过所述物理调控因子的刺激，直接改变所述蛋白酶的构象、定位或者活性，或经其他蛋白质或核酸分子间接改变所述蛋白酶的构象、定位或者活性，使所述蛋白酶能有效切割所述蛋白酶识别切割位点；或

17、所述外界调控因子为化学小分子诱导剂，包括小分子化合物、小分子化合物聚合物和盐离子中的一种或几种，通过所述化学小分子诱导剂改变所述蛋白酶的构象、定位或者活性，使所述蛋白酶能有效切割所述蛋白酶识别切割位点。

18、本发明的第二方面，提供一种编码所述的酶控蛋白分子开关的核酸分子。

19、本发明的第三方面，提供一种包含所述的核酸分子的表达载体。

20、本发明的第四方面，提供一种所述的酶控蛋白分子开关的构建方法，包括：

21、提供编码靶蛋白c端结构域的第一核酸片段、编码靶蛋白n端结构域的第二核酸片段和编码所述蛋白酶识别切割位点的第三核酸片段；

22、将第一核酸片段、第三核酸片段和第二核酸片段依次串联，形成插入片段；

23、将所述插入片段整合至支架蛋白编码基因的核酸序列中，使得所述插入片段位于所述支架蛋白的拓扑结构内部对应位置，形成融合序列；

24、利用分子生物学手段获得包含所述融合序列的重组表达载体；

25、将所述重组表达载体导入宿主细胞中表达，获得所述酶控蛋白分子开关。

26、本发明的第五方面，提供一种用于靶蛋白可控激活的试剂盒，所述试剂盒包括所述的表达载体和/或能够特异性识别并切割所述蛋白酶识别切割位点的蛋白酶。

27、本发明的第六方面，提供所述的酶控蛋白分子开关在蛋白酶活性检测、蛋白酶活性改造、蛋白酶活性进化、蛋白功能调控、和/或细胞生理信号检测中的应用。

28、相比现有技术，本发明至少包括以下有益效果：

29、本发明提供的基于支架蛋白拓扑构象锁的酶控蛋白分子开关，包括支架蛋白、靶蛋白和蛋白酶识别切割位点；靶蛋白的n端与c端通过蛋白酶识别切割位点的氨基酸序列相连后通过loop环断裂位点嵌入支架蛋白内部，形成空间拓扑构象自锁结构；常态下靶蛋白的构象锁定，生物学活性被抑制；蛋白酶识别切割位点被相应蛋白酶识别并切割后，靶蛋白的构象锁定被解除，恢复生物学活性。本发明构建方法通用性强，可适配荧光蛋白、荧光素酶、大分子t7 rna聚合酶等各类靶蛋白，构建的酶控蛋白分子开关具有低背景、高响应、信噪比高的优势，可用于蛋白功能调控、蛋白酶活性检测、蛋白酶活性改造、蛋白酶活性进化及细胞凋亡等生理信号检测，应用前景广阔。

1.一种基于支架蛋白拓扑构象锁的酶控蛋白分子开关，其特征在于，所述酶控蛋白分子开关包括支架蛋白、靶蛋白和蛋白酶识别切割位点；

2.根据权利要求1所述的酶控蛋白分子开关，其特征在于，

3.根据权利要求1所述的酶控蛋白分子开关，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的酶控蛋白分子开关，其特征在于，所述蛋白酶识别切割位点的切割方式包括：

5.根据权利要求4所述的酶控蛋白分子开关，其特征在于，

6.一种编码权利要求1-5任一项所述的酶控蛋白分子开关的核酸分子。

7.一种包含权利要求6所述的核酸分子的表达载体。

8.一种权利要求1-5任一项所述的酶控蛋白分子开关的构建方法，其特征在于，包括：

9.一种用于靶蛋白可控激活的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求7所述的表达载体和/或能够特异性识别并切割所述蛋白酶识别切割位点的蛋白酶。

10.权利要求1-5任一项所述的酶控蛋白分子开关在蛋白酶活性检测、蛋白酶活性改造、蛋白酶活性进化、蛋白功能调控、和/或细胞生理信号检测中的应用。