三重修饰的天麻外泌体纳米制剂及其制备方法和应用

本发明涉及医药，具体涉及一种三重修饰的天麻外泌体纳米制剂及其制备方法和应用，尤其是一种突触结合蛋白、α-突触核蛋白抗体及左旋多巴三重修饰的天麻外泌体纳米制剂及其制备方法和在制备帕金森治疗药物中的应用。

背景技术：

1、帕金森病目前仍是一项严峻的临床挑战，其病理特征表现为涉及多巴胺能神经元进行性退变与α-突触核蛋白异常聚集的自我强化循环。这种病理性蛋白的持续累积不断加速细胞损伤及后续多巴胺能神经末梢丧失。尽管左旋多巴通过暂时补充多巴胺成为当前临床主要疗法，却无法阻断潜在的蛋白病理进程或中断毒性级联反应。该症状缓解效果在四至六年后逐渐减弱，患者可能出现“开关现象”，其是对左旋多巴剂量反应产生的临床症状波动性运动障碍。

2、当前聚焦于清除α-突触核蛋白的临床尝试（如单抗药物prasinezumab和cinpanemab）均遭遇挫折，未能达到主要临床终点，这凸显了单一抗体疗法的局限性。因此，现有治疗方案存在双重困境：左旋多巴仅缓解症状而不改变病程，基于抗体的策略又缺乏有效阻断病理进展的效力。要突破这些障碍，需要将多巴胺补充与毒性聚集体清除相结合的综合性方案，即通过共同递送左旋多巴与更强效的α-突触核蛋白降解剂实现协同治疗。

3、天然产物为神经保护提供了新途径，其中天麻已展现抑制蛋白寡聚化的潜力。研究表明天麻能抑制α-突触核蛋白寡聚化并维持囊泡稳态。更重要的是，天麻来源的细胞外囊泡（gev）可能继承植物母细胞的活性成分（尤其是mirna），从而产生与原生植物相似的α-突触核蛋白抑制效果。植物源囊泡可携带具有跨物种调控功能的治疗性mirna。其纳米结构及独特膜成分能增强生物屏障穿透能力，使其成为脑部药物递送的优先载体。因此，gev有望成为实现帕金森病精准治疗多重要求的综合性平台。

4、然而，天然gev的递送面临两大障碍：非特异性生物分布与低效细胞摄取，可能导致中枢神经系统脱靶不良反应。有效递送还需实现后续的神经元内化。当前广泛采用的狂犬病毒糖蛋白或转铁蛋白配体策略，常受内源性配体竞争抑制及受体表达量限制影响，且这些受体在非靶组织的广泛表达易导致通路饱和与脱靶清除。

技术实现思路

1、本发明针对上述不足，提供了一种突触结合蛋白、α-突触核蛋白抗体及左旋多巴三重修饰的天麻外泌体纳米制剂及其制备方法和在制备帕金森治疗药物中的应用。该发明能被神经元高效摄取，并释放天麻外泌体中的活性治疗成分如核酸和蛋白，从而发挥显著的帕金森治疗的功能，缓解神经炎症并修复神经损伤，为帕金森治疗提供了新的策略。

2、本发明首先提供了一种突触结合蛋白、α-突触核蛋白抗体及左旋多巴三重修饰的天麻外泌体纳米制剂的制备方法，其包括对天麻外泌体进行如下a）-c）的功能组分修饰：

3、a)使其携带突触结合蛋白或其功能性片段；

4、b)使其携带α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段；

5、c)使其携带左旋多巴；

6、并且，所述a)-c)中的功能组分修饰通过连接子或直接偶联至天麻外泌体的表面或内部。

7、根据本发明的优选方案，所述a)、b)或c)中的至少一种功能组分通过选自以下的一种或多种方式连接至外泌体：共价键连接、非共价键连接、疏水插入、化学点击反应、或通过连接子介导的偶联。

8、根据本发明的优选方案，所述共价键连接包括通过磷脂分子锚定于外泌体膜；所述化学点击反应包括叠氮-二苯并环辛炔点击化学反应；所述连接子包括可断裂连接子或不可断裂连接子。

9、进一步的，所述共价键连接包括通过磷脂分子（如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺）锚定于外泌体膜；所述化学点击反应包括叠氮-二苯并环辛炔点击化学反应；所述连接子包括可断裂连接子（如活性氧敏感的硫缩酮连接子）或不可断裂连接子。

10、根据本发明的优选方案，所述制备方法包括如下步骤：

11、1）对天麻进行榨汁，汁液经过滤，离心，弃沉淀，得到上清液；

12、2）上清液离心收集沉淀，用磷酸缓冲液重悬沉淀得到天麻外泌体重悬液；

13、3）将突触结合蛋白通过二硬脂酰磷脂酰乙醇胺连接子共价偶联至天麻外泌体表面，得到突触结合蛋白修饰的天麻外泌体；

14、4）将α-突触核蛋白抗体通过叠氮-二苯并环辛炔点击化学反应偶联至步骤3）所得外泌体表面，得到突触结合蛋白及α-突触核蛋白抗体双重修饰的天麻外泌体；

15、5）将左旋多巴通过活性氧敏感的硫缩酮连接子连接至步骤4）所得外泌体上，得到所述三重修饰的天麻外泌体纳米制剂。

16、进一步的，步骤2）离心过程所采用的离心力应大于步骤1）所述的离心力；步骤1）的离心条件为在3000~20000g条件下离心10~60min；步骤2）的离心条件为在4000~30000g条件下离心1~4h。

17、进一步的，步骤3）具体为：将天麻外泌体重悬液置于20~30℃摇床中，90~200rpm条件下振荡1~3h，然后再加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺修饰的突触结合蛋白，置于20~30℃摇床中，90~200rpm共同振荡1~3h，于0~10℃，100000~200000g条件下离心0 .5~4h，弃去上清，得到突触结合蛋白修饰的天麻外泌体。

18、进一步的，步骤3）中突触结合蛋白与外泌体质量比为0 .5:1-4:1。

19、进一步的，所述突触结合蛋白的氨基酸序列选自与seq id no: 1（对应ncbi geneid: 6857）、seq id no: 2（对应ncbi gene id: 33473）、seq id no: 3（对应ncbi geneid: 6542418）或seq id no: 4（对应ncbi gene id: 6643643）具有至少70%、80%、90%或95%同源性的序列中的一种或多种；所述突触结合蛋白的氨基酸序列优选自seq id no: 1、seqid no: 2、seq id no: 3或seq id no: 4所示序列；进一步优选为seq id no: 1（syt1，ncbi gene id: 6857）所示序列。

20、进一步的，步骤4）具体为：α-突触核蛋白抗体使用n3-peg5-hns进行叠氮化修饰，将其与步骤3）所得外泌体按照1：1~1：20的质量比，在37℃共同孵育1~3h；然后100000~200000g条件下离心0 .5~4h，弃去上清，得到突触结合蛋白及α-突触核蛋白抗体双重修饰的天麻外泌体。

21、进一步的，步骤5）具体为：用疏水基团修饰左旋多巴，将其与步骤4）所得外泌体按照1：1~1：20的质量比，在37℃共孵育1~3h，100000~200000g条件下离心0 .5~4h，弃去上清，得到三重修饰的天麻外泌体。

22、本发明还提供了一种突触结合蛋白、α-突触核蛋白抗体及左旋多巴三重修饰的天麻外泌体纳米制剂，其采用前述方法制备得到。

23、本发明还提供了前述的天麻外泌体纳米制剂在制备用于治疗和/或预防神经退行性疾病（优选帕金森病）的药物中的应用。

24、进一步的，所述药物被配制为经鼻给药、口服、静脉注射、或脑内给药的剂型。更进一步的，所述为经鼻给药的药物。将外泌体应用于经鼻制剂，突触结合蛋白增加纳米制剂被神经元摄取的效率，外泌体缓解神经炎症并修复神经损伤，同时该发明生产快捷方便，应用于帕金森治疗制剂的制备简单高效方便。

25、与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：

26、1）协同双重治疗机制：

27、本发明首次实现了“清除-补充”双重协同治疗策略。本发明的天麻外泌体纳米制剂通过将天麻外泌体（gev）与左旋多巴共递送，既可通过gev下调usp30、pias2等关键泛素-蛋白酶体调控因子，促进α-突触核蛋白降解并恢复线粒体自噬功能，又可通过左旋多巴补充多巴胺水平，实现病因治疗与症状缓解的协同统一，显著优于单一靶点的抗体或左旋多巴疗法。

28、（2）精准病灶靶向：

29、本发明采用α-突触核蛋白抗体（biib054）对载体进行表面功能化修饰，结合ros敏感性硫缩醛（tk）连接子，实现了对帕金森病病灶微环境的高度精准识别与响应性释药。抗体介导的主动靶向使载体优先富集于α-syn聚集区域，活性氧触发左旋多巴与抗体的按需释放，显著降低非特异性分布和系统毒性，提升治疗窗口。

30、（3）创新修饰促进摄取：

31、本发明首次将突触囊泡蛋白（syt1）引入植物源外泌体表面，模拟神经元突触囊泡的钙依赖性内吞机制。syt1修饰不仅显著提升了sh-sy5y细胞对载体的摄取效率（较未修饰gev提高2倍以上），还引导载体进入rab11+回收途径，减少溶酶体降解，增强胞内递送效率。采用ros敏感键实现微环境响应性释放，同时使用peg掩蔽防止syt1在正常组织中过早暴露，并促进靶向内化。该机制优于传统rvg或转铁蛋白修饰策略，具有更高的神经元选择性和内吞效率。