一种基于O/W乳液稳定体系的肠道菌群冷冻干燥包埋方法及其应用与流程

本发明涉及一种基于o/w乳液稳定体系的肠道菌群冷冻干燥包埋方法及其应用，属于生物医药。

背景技术：

1、目前，肠道菌群移植（fmt）是一种将健康供体粪便中的功能性肠道菌群移植至患者肠道的新型生物治疗技术，在艰难梭菌感染（cdi）、炎症性肠病（ibd）等疾病治疗中效果显著。然而，传统fmt制剂面临严峻挑战：

2、活菌递送效率低：外源性菌群需经口服通过“口腔-胃-小肠-结肠”途径，胃内强酸及小肠消化酶形成多重生理屏障，导致活菌数量大幅衰减，最终到达结肠的比例仅为1%～10%。

3、缺乏靶向能力：现有载体难以实现结肠精准释放，导致临床给药剂量波动大。

4、现有包埋技术如喷雾干燥法高温易致失活，溶胶-凝胶法周期长，离子凝胶法耐酸性弱。因此，开发一种能高效抵御胃肠环境胁迫且成本可控的肠道菌群包埋技术是行业急需解决的技术问题。

5、近年来，利用蛋白质稳定的乳液包埋益生菌以提升其胃肠道耐受能力的技术路线已有报道。现有的此类路线通常需要将益生菌预先制成冻干粉末并分散于油相中，再借助葡萄糖酸-δ-内酯、结冷胶及钙离子等交联剂构建蛋白质-多糖双网络乳液凝胶，方能抵抗胃酸和胆汁盐胁迫并实现结肠递送。然而，上述路线存在以下固有缺陷：

6、其一，菌体需先经历一次冷冻干燥，二次干燥损伤使起始活性偏低，且冻干菌粉与油脂直接大面积接触，易造成菌膜损伤；其二，凝胶化工艺需引入多种外源交联剂并长时间静置成型，工艺冗长、成本高，残留交联剂亦存在生物安全性隐患；其三，尤为重要的是，现有乳液包埋研究多针对单一纯种益生菌菌株，其评价指标仅考虑单株菌的存活率。而粪便来源的复杂混合肠道菌群包含大量耐受性各异、且对氧与脱水高度敏感的严格厌氧菌，不同菌种对酸、胆盐、冷冻及干燥胁迫的耐受性差异极大，常规包埋与加工过程极易导致敏感菌种的选择性死亡，从而使递送后菌群的群落结构较原始样本发生显著偏移，削弱菌群移植（fmt）制剂的生态学功效。因此，如何在省略预冻干与凝胶化步骤的前提下，以简化的工艺实现对复杂混合肠道菌群的全谱系保护与群落结构保真，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于o/w乳液稳定体系的肠道菌群冷冻干燥包埋方法及其应用，可以有效解决上述问题。

2、本发明提供一种基于o/w乳液稳定体系的肠道菌群冷冻干燥包埋方法，包括以下步骤：

3、（1）原料制备：制备中链甘油三酯（mct）、具有乳化活性的天然蛋白水溶液、含水肠道菌群菌泥及冷冻干燥保护剂水溶液；所述含水肠道菌群菌泥为来源于健康供体粪便且未经冷冻干燥的肠道菌群菌泥；

4、（2）o/w乳液制备：将所述天然蛋白水溶液与所述中链甘油三酯按油水体积比1:8～10混合，于25～35℃下乳化处理，得到无分层、无油滴上浮的o/w乳液；

5、（3）复合体系构建：先将菌泥与保护剂水溶液按1g:4～10ml混匀，再与o/w乳液按1g:8～10ml混匀，形成"菌泥-保护剂-o/w乳液"复合体系；体系中不加入交联剂和凝胶化剂，不经交联固化处理；

6、（4）冷冻干燥：将所述复合体系直接进行真空冷冻干燥，得到肠道菌群冻干粉；所述真空冷冻干燥依次包括预冻阶段、升华干燥阶段和解析干燥阶段，所述预冻阶段的预冻温度为-60℃～-40℃，所述解析干燥阶段的最终干燥温度为25℃～35℃。

7、本发明中，所述肠道菌群以未经冷冻干燥的含水菌泥形式提供，并直接以水相形态与冷冻干燥保护剂水溶液混合，再与预制o/w乳液共混；无需预先将菌体冻干成粉末，亦无需将菌体分散于油相；所述复合体系中不加入交联剂和凝胶化剂，不经交联固化处理，所述复合体系经混合均匀后直接进行一步真空冷冻干燥；通过先将具有乳化活性的天然蛋白水溶液与中链甘油三酯乳化形成无分层、无油滴上浮的o/w乳液，再使所述o/w乳液与"菌泥-冷冻干燥保护剂"体系按比例共混，在冷冻干燥过程中于菌体表面原位形成“蛋白连续相＋脂质分散相”的复合保护层，其中脂质分散相构成疏水防护屏障，蛋白连续相维持界面稳定；所述冷冻干燥采用预冻温度-60℃～-40℃、解析干燥最终温度25℃～35℃的温和程序，在保持菌群活性的同时避免剧烈冰晶对菌体损伤。

8、本发明通过上述各技术特征协同作用，使得所述方法能够在无需交联剂与凝胶化处理的情况下，仅以"预制o/w乳液＋含水菌泥共混＋一步冻干"的简化工艺实现对复杂肠道菌群的高效保护。

9、在一些实施例中，步骤（1）中所述含水肠道菌群菌泥的制备包括：取健康供体新鲜粪便样本，加入生理盐水后于4℃下搅拌混匀，依次经100目、150目和200目滤网分级过滤，收集滤液；将所述滤液于4℃、5000×g离心10min，弃去上清液；按菌泥重量与生理盐水体积之比为1g:9ml的比例重悬洗涤，再于4℃、8000×g离心10min，弃去上清液，收集得到所述含水肠道菌群菌泥。

10、在一些实施例中，步骤（1）中所述中链甘油三酯的制备包括：取中链甘油三酯加热至45～55℃恒温保持，去除结晶颗粒，经有机相滤膜过滤除菌；所述具有乳化活性的天然蛋白水溶液的制备方法为：将具有乳化活性的天然蛋白粉末按质量体积浓度3%～5%的比例溶解于4℃预冷的去离子水中，调节ph为6.9～7.1，静置过夜使蛋白舒展，经水系滤膜过滤除菌。

11、在一些实施例中，步骤（2）中所述o/w乳液的制备工艺为：将具有乳化活性的天然蛋白水溶液置于25～35℃水浴中，在搅拌状态下按油水体积比1:8～10的比例缓慢加入中链甘油三酯，持续搅拌直至形成无分层、无明显油滴上浮且倒置容器无挂壁结块的o/w乳液。

12、在一些实施例中，所述具有乳化活性的天然蛋白选自乳清蛋白、大豆分离蛋白和酪蛋白中的一种或多种；所述冷冻干燥保护剂包括选自乳糖、麦芽糖、海藻糖、麦芽三糖、低聚果糖、酪蛋白酸钠和明胶中的一种或多种。

13、在一些实施例中，所述冷冻干燥保护剂为乳糖、麦芽糖与海藻糖的混合物，或为海藻糖、麦芽三糖、低聚果糖、酪蛋白酸钠与明胶的混合物。

14、在一些实施例中，所述预冻阶段的预冻温度为-60℃～-40℃，保温时间为3～6h；所述升华干燥阶段在真空条件下由-45℃～-35℃经-35℃～-25℃、-25℃～-15℃阶梯升温至-15℃～0℃；所述解析干燥阶段由0℃～15℃经15℃～25℃阶梯升温至25℃～35℃。

15、本发明提供一种由上述方法制备的肠道菌群冻干粉，所述冻干粉包含肠道菌群、冷冻干燥保护剂以及由具有乳化活性的天然蛋白和中链甘油三酯形成的o/w乳液冻干产物，所述具有乳化活性的天然蛋白和中链甘油三酯包裹于菌体表面形成复合保护层。

16、在一些实施例中，所述复合保护层包括由所述具有乳化活性的天然蛋白构成的连续相和由所述中链甘油三酯构成的分散相，且所述复合保护层连续包覆于菌体表面。

17、本发明提供一种上述的肠道菌群冻干粉在制备口服肠道菌群移植制剂或肠道微生物递送药物中的应用，所述口服肠道菌群移植制剂或肠道微生物递送药物用于治疗艰难梭菌感染（cdi）或炎症性肠病（ibd），或用于维持肠道菌群群落结构的多样性。

18、本发明的有益效果是：

19、现有乳液包埋技术（包括以乳液凝胶形式递送益生菌的技术）均以单一纯种菌株为对象，其效果仅体现为单菌存活率的提升。而粪便来源的复杂混合肠道菌群中，不同菌种对酸、胆盐、冷冻及脱水胁迫的耐受性差异极大，加工过程极易造成敏感厌氧菌的选择性死亡并引发群落偏移。然而，本发明中，所述肠道菌群冻干粉复溶后经人工胃液处理2h再经人工肠液处理3h，采用16s rrna高通量测序表征，其菌群群落结构与原始肠道菌群样本之间的β多样性聚类距离，小于在相同条件下由未添加所述o/w乳液的对照冻干粉经相同处理后的样本与所述原始肠道菌群样本之间的β多样性聚类距离。换言之，与对照相比，本发明所得冻干粉经模拟胃肠液胁迫后与原始菌群样本的菌群结构更为接近，证明本发明在保护活菌数量的同时，完整维持了复杂混合菌群的群落结构。该菌群结构保真性表明，本发明能够对各耐受性不同的菌种实现非选择性、等比例的保护，这是针对单一纯种菌株的现有包埋技术无法实现、亦无法预期的技术效果。

20、本发明在冷冻干燥过程中于菌体表面形成“蛋白连续相+脂质分散相”复合保护层（其形成机理推测为冷冻过程中冰晶生长挤压诱导的蛋白～油滴原位自组装成膜）。mct形成的疏水层有效抵御胃酸侵蚀，具有乳化活性的天然蛋白增强体系稳定性。实验数据显示，经本发明方法处理的菌群在模拟胃肠液处理后平均存活率可达42%以上，远高于对照组（约2%）。

21、本发明经人工胃液与人工肠液复合胁迫处理后，本发明冻干粉中的活菌存活率显著高于空白对照及现有常规海藻酸钠包埋对照，为口服肠道菌群移植（fmt）制剂的制备提供了结构基础，有利于降低临床给药剂量波动，减少因过量给药引发的腹胀、腹泻等不良反应。

22、本发明采用天然可食用的mct和具有乳化活性的天然蛋白，无化学残留，生物相容性好，且原料成本低，工艺适合规模化生产。