一种粪菌移植构建人源肠道菌群小鼠模型的方法

本发明涉及一种粪菌移植构建人源肠道菌群小鼠模型的方法，属于实验动物模型构建。

背景技术：

1、人源肠道菌群（human flora-associated，hfa）小鼠是将人源肠道微生物群落移植至小鼠体内、从而模拟人体肠道微生态环境的经典实验动物模型，在探究菌群与宿主代谢、免疫及神经等系统互作机制方面具有不可替代的应用价值。粪菌移植（fecalmicrobiota transplantation，fmt）是现阶段构建该模型的主流技术，该技术以人体粪便为菌群供体，经标准化处理后使hfa稳定定植于小鼠肠道内。流程主要包含样本前处理与菌群移植两大阶段：新鲜人体粪便按照既定比例加入无菌磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，pbs），经涡旋混匀、滤网过滤去除固体杂质，再通过低温离心富集菌体，重悬后得到浓度标准化的粪菌悬液。肠道菌群的定植质量直接决定该模型的可靠性与实验可重复性，针对受体小鼠的处理主要分为两种模式，无特定病原体（specific pathogenfree，spf）小鼠需提前饲喂广谱抗生素以清除自身原生菌群、降低内源性菌群对移植菌群的竞争排斥，无菌小鼠则凭借天然无菌的生理特征可直接用于移植；制备完成的粪菌悬液多采用口服灌胃方式送入小鼠消化道，部分实验会搭配灌肠操作以提升远端肠道的菌群定植效率。模型验证阶段常采用16s rdna高通量测序、宏基因组测序等手段，从物种组成、菌群丰度及代谢功能等维度比对小鼠与供体肠道菌群的相似性与重建程度。因此，fmt是实现hfa在小鼠肠道内稳定定植、搭建人源化菌群小鼠模型的核心技术，其技术优化与流程标准化直接决定模型的构建质量与应用价值。

2、在正常生理状态下，hfa可维持小鼠肠道微生态稳态。然而，当hfa定植率下降、菌群结构失衡，即引发hfa小鼠模型失真。hfa紊乱可能造成小鼠肠道屏障损伤、局部免疫异常，并提升代谢、心血管等相关实验的误差风险。随着肠道微生物研究的不断深入，近年来hfa小鼠模型的使用范围持续扩大，实验需求呈现逐年增长的趋势，hfa小鼠模型已成为肠道菌群及相关产品功效验证的核心实验载体。如面向通用人源菌群定植的fmt操作方法（cn115735852a《一种粪菌移植人源化无菌小鼠模型的构建方法》）采用无菌小鼠为受体，通过多次灌胃实现菌群定植；针对特定致病菌定植的造模技术（cn118160678a《利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法》）以spf级小鼠经抗生素预处理后灌胃给药；适配心血管疾病研究的菌群模型构建方案（cn121795388a《一种利用人源化菌群构建动脉硬化小鼠模型的方法》）同样采用口服灌胃途径进行fmt。这些技术虽然能够实现hfa向小鼠体内的初步定植，完成基础模型搭建，但多数方案在菌群递送方式上存在共性局限：无菌小鼠缺乏与免疫系统长期共进化的原生微生物群落，导致黏膜免疫发育不全与定植屏障缺失，无法真实反映供体菌群在正常宿主内的功能互作，且无菌繁育与维持需专用隔离设备，成本高昂，质控严苛；口服灌胃作为主要移植途径，其菌群液经上消化道时易受胃酸、胆汁及胰液等消化液破坏，导致活菌存活率显著降低；灌胃操作难以使菌群均匀分布于整个肠道，尤其远端结肠区域定植效率不足，造成菌群空间分布不均、定植深度受限，直接影响模型与供体肠道微生态的相似度。同时，现有技术移植参数不统一，不同方案所用受体小鼠品系、抗生素种类与疗程、粪菌液浓度及移植频次差异较大，导致实验结果间可比性与通用性不足。

3、当前fmt技术可初步实现hfa在小鼠肠道内定植，但该领域现有构建方案仍存在诸多问题待解决。现有技术在粪菌处理环节缺乏统一规范，操作过程中菌种活性易受环境影响；移植方式以口服灌胃为主，其菌群液经上消化道时易受胃酸、胆汁及胰液等消化液破坏，导致活菌存活率显著降低，且灌胃操作难以使菌群有效抵达并定植于远端结肠，造成肠道菌群空间分布不均、定植深度不足；同时，受体小鼠品系的选用多基于经验而非系统验证，不同品系肠道结构及定植偏好差异影响模型适配性。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供了一种粪菌移植构建人源肠道菌群小鼠模型的方法，本发明以封闭群icr小鼠为受体，采用结肠灌肠途径直接将供体菌群递送至结肠部位，从而绕过上消化道屏障，减少菌群在转运过程中的活性损失，实现人源肠道菌群在小鼠结肠内的高丰度定植，提高hfa小鼠模型的构建成功率和菌群代表性。

2、技术方案：本发明所述的一种粪菌移植构建人源肠道菌群小鼠模型的方法，包括如下步骤：

3、（1）采集健康供体的新鲜粪便样本，经处理后制备粪菌悬液并低温保存；

4、（2）采用抗生素处理小鼠，配合灭菌饲养环境，构建伪无菌小鼠模型；

5、（3）将步骤（1）制备的粪菌悬液复溶后，移植给药至步骤（2）的伪无菌小鼠体内，构建人源肠道菌群小鼠模型。

6、进一步地，步骤（1）中，所述健康供体为20～30岁的健康成年人，饮食正常，无肠道疾病，且至少三个月未接受过抗生素治疗。

7、进一步地，步骤（1）中，所述粪菌悬液的制备方法为：将各志愿者的新鲜粪便等量混合后，按质量体积比1:5～1:9（g/ml）加入无菌厌氧菌肉汤，均质后经无菌纱布过滤，滤液离心收集沉淀；加入含nacl和甘油的无菌保存液，涡旋振荡，即得粪菌悬液；速冻后低温保存。

8、优选地，步骤（1）中，所述粪菌悬液的制备方法为：将各志愿者的新鲜粪便等量混合后，按质量体积比1:9（g/ml）加入无菌厌氧菌肉汤（wilkins-chalgren厌氧菌肉汤），均质后经无菌纱布过滤，滤液离心收集沉淀；加入含nacl和甘油的无菌保存液，涡旋振荡，即得粪菌悬液；速冻后低温保存。

9、进一步地，步骤（2）中，所述抗生素处理的方法为：将小鼠分为对照组和模型组，模型组灌胃混合抗生素溶液，对照组灌胃等量溶剂，每天1~2次，连续灌胃7~14 d。

10、优选地，步骤（2）中，所述抗生素处理的方法为：将小鼠分为对照组和模型组，模型组灌胃混合抗生素溶液，对照组灌胃等量溶剂，每天1次，连续灌胃7 d。

11、进一步地，步骤（2）中，所述灭菌饲养环境处理包括：将饮用水替换为无菌纯水，其中模型组饮用水中添加氨苄青霉素；饲料更换为紫外照射后的杀菌饲料；定期更换洁净的灭菌鼠笼及垫料。

12、进一步地，步骤（2）中，所述抗生素选自万古霉素、硫酸新霉素、甲硝唑中的一种或多种；其中，万古霉素的灌胃剂量为50～100 mg/kg，硫酸新霉素的灌胃剂量为100~200 mg/kg，甲硝唑的灌胃剂量为100 ~200mg/kg。

13、优选地，步骤（2）中，所述抗生素选自万古霉素、硫酸新霉素、甲硝唑中的一种或多种；其中，万古霉素的灌胃剂量为50 mg/kg，硫酸新霉素的灌胃剂量为100 mg/kg，甲硝唑的灌胃剂量为100 mg/kg。

14、进一步地，步骤（3）中，在粪菌移植前，给予小鼠正常生理恢复期，且移植前禁食以促进肠道排空；冻存的粪菌悬液水浴解冻后，加入无菌生理盐水，充分混匀。

15、进一步地，所述给药方式为灌胃或灌肠，所述菌液的给药剂量为0.1~0.2 ml。

16、优选地，所述菌液的给药剂量为0.1ml。

17、进一步地，所述给药每隔1~2天进行1次，连续14~21天。

18、优选地，所述给药每隔2天进行1次，连续14天。

19、进一步地，其特征在于，自移植开始之日起，每隔7天收集小鼠粪便样品，按步骤（1）所述方法制备成粪菌悬液，于-80℃保存，用于检测人源肠道菌群的定植情况。

20、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

21、（1）活菌存活率显著提高：结肠灌肠直接绕过上消化道消化液破坏，最大限度保留菌群活性，提升hfa定植丰度。

22、（2）实现远端结肠深度定植：菌群直达结肠靶部位，避免口服灌胃的空间分布不均问题，确保定植深度与均衡性。

23、（3）受体适配性明确：选用封闭群icr小鼠作为标准化受体，提高模型构建成功率与批次稳定性。

24、（4）模型可靠性整体提升：综合上述改进，所构建hfa小鼠模型菌群活性高、定植效果好、个体差异小，为后续研究提供更稳定的实验平台。