一种用PI4KB抑制剂通过灌注离体减脂脂肪肝的方法

本发明涉及一种用pi4kb抑制剂通过灌注离体减脂脂肪肝的方法。本技术主张2024年3月25日提交的欧洲申请24166005.9的权利，其内容通过引用并入本文。

背景技术：

1、主要营养素葡萄糖、氨基酸和脂肪酸（fa）的分解代谢是几乎所有细胞类型维持其各种细胞活性的能量需求的中心功能。在这些营养物中，fa具有最高的能量密度，因此构成重要的长期细胞能量底物。由于fa在高浓度下的毒性，它们中的大多数被酯化成甘油三酯（tg）并储存在脂滴（ld）中。为了避免饥饿期间营养短缺，tg储备被动员以释放fa，从而通过脂解或ld的自噬降解（即脂噬）满足细胞能量需求。脂解作用依次通过脂肪甘油三酯脂肪酶（atgl）、激素敏感型脂肪酶（hsl）和单酰基甘油脂肪酶（mgl）进行，将tg水解为fa和甘油，而脂噬过程由溶酶体酸性脂肪酶（lal）控制。尽管ld可以在几乎任何细胞类型中产生以储存过量的细胞内fa，但是脂肪组织是具有最高ld形成和储存水平的器官。在足够的葡萄糖供应的存在下，胰岛素信号传导增加脂肪生成，同时抑制脂解以促进脂肪组织中的脂质储存。相反，激素（肾上腺素）或交感神经元（去甲肾上腺素）刺激激活脂肪细胞脂解作用，以在禁食状态期间向其它器官供应fa。

2、在参与脂解的三种脂肪酶中，hsl通过儿茶酚胺信号激活蛋白激酶a（pka）的磷酸化而被激活。相反，胰岛素通过磷酸二酯酶3b（pde3b）介导camp降解来抑制此过程。然而，hsl的丧失导致人和小鼠中的轻度表型。因此，hsl的肝特异性耗竭不影响肝tg水平，并且在脂肪组织中，由于进行性脂肪营养不良，hsl的损失导致年龄依赖性肝脂肪变性。相反，atgl起更广泛的作用，如来自人或小鼠的各种组织中的显著ld积累，其中

atgl丧失功能。此外，小鼠中肝特异性

atgl敲除促进肝ld积累，而脂肪组织特异性atgl敲除显示肝中中性脂质水平显著降低，强调atgl在提供细胞内和细胞外fa中的作用。atgl功能在多个水平上受到调节，以满足能量稳态的复杂生理需求。在转录上，胰岛素信号传导通过抑制foxo1抑制

atglmrna合成。在翻译后水平，儿茶酚胺和胰高血糖素信号传导通过

pka和

camkii介导的脂肪细胞和肝细胞中ser406处atgl的磷酸化促进atgl酶活性。此外，atgl丰度可在多聚泛素化后由蛋白酶体介导的降解来调节，通过不同的e3连接酶，如cop1和pex2。

3、高尔基体由具有包含蛋白质修饰和折叠、囊泡形成、细胞骨架组织和脂质代谢的无数细胞内功能的池的栓系堆叠限定。为了执行这些过程，高尔基体结合跨越膜的整合蛋白或通过与高尔基体富集的脂质如ptdins4p相互作用募集胞质蛋白。由于ptdins4p的带正电特性，其可与含有带负电区域的蛋白质相互作用，例如nlrp3和stub1，从而使高尔基体ptdins4p能够分别调节炎症和蛋白质降解。高尔基体ptdins4p库由脂质激酶pi4kb、pi4k2a和pi4k2b产生，以由ptdins产生ptdins4p。相反，脂质磷酸酶sacm1l使ptdins4p去磷酸化。sacm1l活性通过er和高尔基体中分布的改变而被调节，后一区室中sacm1l的富集通过葡萄糖或血清剥夺而促进，导致高尔基体中ptdins4p水平的降低，这可能通过ptdins4p相互作用物影响多效性细胞内过程。

4、迄今为止，激素信号传导仍然是最佳的文献记载的协调葡萄糖可用性和全身性脂解的机制。在本发明的上下文中，研究了通过经由细胞内葡萄糖感测调节脂解来平衡葡萄糖和fa水平的供应的一般细胞内在机制。有趣的是，鉴定了这样一种新的调节机制，其涉及ptdins4p在高尔基体中e3连接酶复合物cul7fbxw8的装配中的中心作用，其进而多聚泛素化atgl以进行蛋白酶体靶向降解。值得注意的是，细胞内葡萄糖水平的消耗通过此途径被感测到，导致e3连接酶复合物的装配减少和atgl驱动的脂解作用增加。以这种方式，葡萄糖和fa的库是相互缠绕的。

5、基于上述现有技术，本发明的目的是提供离体减脂脂肪肝的手段和方法。此目的通过本说明书的独立权利要求的主题以及在本说明书的从属权利要求、实施例、附图和一般描述中描述的进一步的有利实施方式来实现。

技术实现思路

1、本发明的第一方面涉及用于离体减脂脂肪肝的方法，所述方法包括

2、在灌注步骤中使用灌注液灌注脂肪肝移植物，所述灌注液包括选自式1、2和3的pi4kb抑制剂的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

3、(1)、(2)、(3)，

4、其中

5、- z为(甲氧基)(甲基)苯基、(甲基)(三氟甲氧基)苯基、(甲氧基)(甲基)吡啶基、(乙基)(甲氧基)吡啶基、(乙氧基)(甲基)吡啶基或二甲氧基吡啶基，

6、- a11为h、甲基、乙基、羟甲基或羟乙基，

7、- q为式4的杂环，

8、(4)，

9、其中

10、x为n或c(h)，

11、y为n或c(h)，

12、t为s或n(ch3)

13、- r2、r4和r5独立选自h、甲基和乙基，

14、- r6a为so2r8，其中r6a在对位或间位，

15、- r7a选自oh、och3、卤素、nh2、ch2-oh和nh-co-r8，

16、- 每个r7b独立选自oh、卤素、cn、no2、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、ocf3、och2cf3、och2ph、och2-环丙基、och2ch2oh、och2ch2nme2、cf3、ocf3、c1-c6烷基-oh、nhso2r9、nhcor8和nr9r10，

17、- c为0或1

18、其中

19、r8为c1-c6烷基或nr9r10

20、r9和r10独立选自h和c1-c6烷基。

21、本发明利用细胞内在机制，其涉及通过细胞内葡萄糖感测的脂肪甘油三酯脂酶（atgl）驱动的脂解的高尔基体ptdins4p介导的调节（见图5f）。机制上，细胞内葡萄糖的消耗导致较低的高尔基体ptdins4p水平，并因此降低了e3连接酶复合物cul7fbxw8在高尔基体中的装配，因为e3连接酶复合物的装配需要ptdins4p的存在。e3连接酶复合物水平的降低导致高尔基体中atgl的多聚泛素化降低，从而降低蛋白酶体介导的降解。结果，atgl水平增加，并且atgl驱动的脂解作用增强。此细胞内在机制调节细胞内脂肪酸（fa）库和它们的细胞外释放以满足生理需求，包含禁食和葡萄糖剥夺。

22、atgl驱动的脂解作用的增强不仅在细胞内葡萄糖水平耗尽后观察到，而且通过抑制由ptdins产生ptdins4p的脂质激酶pi4kb来实现。请求保护的化合物是pi4kb抑制剂，其可用于药理学操作高尔基体ptdins4p-cul7fbxw8-atgl轴，如在单纯性肝脂肪变性和nash的小鼠模型中所示。施用请求保护的pi4kb抑制剂导致治疗性改善，即脂肪性小鼠肝脏的减脂。类似地，通过使用请求保护的pi4kb抑制剂离体灌注实现人脂肪肝移植物的减脂。

23、术语和定义

24、

通用

25、为了解释本说明书，将应用以下定义，并且在任何适当的时候，以单数使用的术语也将包含复数，反之亦然。在以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献冲突的情况下，将以所阐述的定义为准。

26、如本文所用，术语“包括”、“具有”、“含有”、和“包含”，以及其它类似形式、和其语法等同形式旨在在含义上等同并且是开放式的，因为这些词语中的任一个之后的一或多个项目并不意味着是此一或多个项目的详尽列表，或者意味着仅限于所列出的一或多个项目。例如，“包括”组分a、b、和c的物可由组分a、b、和c组成（即，仅含有），或者可不仅含有组分a、b、和c，而且可包括一或多个其他组分。因此，意图并理解的是，“包括”及其类似形式及其语法等同形式包含“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方式的公开。

27、在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另外明确规定，否则在所述范围的上限与下限之间的下限的单位的十分之一的每一中间值，和在所述范围中任意其他陈述的值或中间值，涵盖在本发明内，但受所述范围中任何具体排除的限制。在所述范围包含一个或二个限值的情况下，排除那些所包含的限值中的任一个或二个的范围也包含在本公开中。

28、本文提及的“约”值或参数包含（且描述）涉及该值或参数本身的变化。例如，提及“约x”的描述包含“x”的描述。

29、如本文所用，包含在所附权利要求中，单数形式“一”、“或”和“所述”包含复数指代物，除非上下文另外清楚指明。

30、“和／或”在这里被用作两个特定特征或部件中的每一个的具体叙述，可有也可没有其它特征或部件。因此，在诸如“a和／或b”的短语中使用的术语“和／或”旨在包含“a和b”、“a或b”、“a”（单独）和“b”（单独）。同样，在诸如“a、b和／或c”的短语中使用的术语“和／或”旨在涵盖以下方面中的每一个：a、b、和c；a、b、或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a（单独）；b（单独）；和c（单独）。

31、除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域（例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学、有机合成中）普通技术人员通常理解的相同含义。标准技术用于分子、遗传和生物化学方法（一般参见sambrook et al.,molecular cloning: a laboratory manual, 4th ed.(2012) cold spring harborlaboratory press, cold spring harbor, n.y.和ausubel et al., short protocolsin molecular biology (2002) 5th ed, john wiley和sons, inc.）以及化学方法。

32、

特定术语

33、术语“脂肪肝疾病”涉及其中过量脂肪在肝脏中积累的病症。同义术语是“肝脂肪变性”和“脂肪肝疾病”（sld）。

34、在本说明书的上下文中，术语脂肪肝疾病涵盖无炎症的肝脂肪变性病症（也称为“单纯性肝脂肪变性”）以及有炎症的肝脂肪变性病症（脂肪性肝炎）。

35、肝脂肪变性是由脂肪酸代谢的损伤引起的，其导致细胞质中甘油三酯脂肪的积累。当肝脏中的脂肪超过5–10%重量时确诊。

36、开始时，肝细胞在核周围存在脂质体，而不置换位于中心的核（微囊脂肪改变）。在晚期阶段，脂质体的尺寸增加，细胞核向细胞外周移位，产生特征性印章环外观（大囊泡脂肪改变）。大囊泡脂肪变性是最常见的形式，通常与酒精、糖尿病、肥胖症、和皮质类固醇有关。妊娠急性脂肪肝和雷氏综合征是由微囊脂肪变化引起的肝脂肪变性的实例。

37、严重的脂肪肝有时伴随炎症，这种情况被称为脂肪性肝炎。向酒精性脂肪性肝炎（ash）或非酒精性脂肪性肝炎（nash）的进展取决于潜在病因的持续性或严重性。两种情况下的病理损害是相似的。脂肪变性（脂质的滞留）和脂肪性肝炎的发作可以代表脂肪肝疾病进展的连续阶段。

38、基于不同的病因，脂肪肝疾病可以分为以下亚型（renella et al. 2023,hepatology 78(6):1966–1986，特别是图5和图6）：

39、- 代谢功能障碍相关的脂肪肝疾病（masld），

40、- 代谢性和酒精相关性肝病（metald），

41、- 酒精相关性肝病（ald），

42、- 隐源性脂肪性肝病，

43、- 具有特定病因的脂肪性肝病。

44、在本说明书的上下文中，诸如masld、metald或ald的术语指的是无炎症的肝脂肪变性病症。

45、当伴随炎症时，masld可发展为代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎（mash）。类似地，metald和ald可分别发展为代谢性和酒精相关性脂肪性肝炎和酒精性脂肪性肝炎（ash）。

46、隐源性脂肪性肝病涉及没有可鉴定原因的脂肪性肝病。其可发展成隐源性脂肪性肝炎。

47、具有特定病因的sld包含例如药物诱导的或单基因性脂肪肝疾病。具有特定病因的sld可发展为具有特定病因的脂肪性肝炎。

48、术语“代谢功能障碍相关的脂肪肝疾病”（masld）和“非酒精性脂肪肝疾病”（nafld）可互换使用。

49、术语“代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎”（mash）和“非酒精性脂肪性肝炎”（nash）可互换使用。

50、在本说明书的上下文中，术语“pi4kb”涉及磷脂酰肌醇4激酶β，特别是涉及uniprot标识符q9ubf8（人pi4kb）和q8bkc8（小鼠）指称的蛋白质。磷脂酰肌醇4激酶β催化磷脂酰肌醇在d-4位的磷酸化，产生磷脂酰肌醇-4-磷酸。

51、在本说明书的上下文中，术语“ptdins4p”涉及磷脂酰肌醇-4-磷酸。

52、在本说明书的上下文中，术语“ptdins”涉及磷脂酰肌醇。

53、在本发明的上下文中，术语“atgl”涉及脂肪甘油三酯脂肪酶，特别是涉及uniprot标识符q96ad5（人）和q8bj56（小鼠）所指的蛋白质。

54、术语“igl-1”溶液涉及一种溶液，具有下列组成：

55、乳糖酸：35.8 g/l；腺苷：1.336 g/l；别嘌呤醇：0.136 g/l；谷胱甘肽：0.922 g/l；聚乙二醇（peg 35000）：1 g/l；磷酸二氢钾：3.402 g/l；五水合棉子糖：17.84g/l；七水硫酸镁：1.232 g/l；氢氧化钠：足量；ph：7.4；注射用水：足量至1升。

56、igl-1是一种用于器官（肾、肝、胰腺）低温冲洗和储存的澄清、无菌、无热原的溶液。igl-1溶液在室温下渗透压为290 mosm/kg，总钠浓度为120 mmol/l，总钾浓度为25mmol/l，ph为7.4。

57、术语“belzer mps”涉及一种溶液，具有下列组成：

58、

hepes（游离酸）

2.38 g

10 mmol/l

磷酸二氢钾

3.4 g

25 mmol/l

甘露醇（usp）

5.4 g

30 mmol/l

葡萄糖（无水），βd (+)

1.80 g

10 mmol/l

葡萄糖酸钠

17.45 g

80 mmol/l

葡萄糖酸镁（无水）

1.13 g

5 mmol/l

核糖，d(-)

0.75 g

5 mmol/l

pentafraction（hes）

50.0 g

50 g/l

谷胱甘肽（还原型）

0.92 g

3 mmol/l

腺嘌呤（游离碱）

0.68 g

5 mmol/l

氢氧化钠

足量，ph：7.4

注射用水

足量至1000 ml

59、belzer mps是用于体外冲洗和暂时连续灌注保存外植器官的澄清至淡黄色、无菌、无热原、无毒溶液。此溶液在室温下计算渗透压为约300 mosm/kg、钾浓度为25 mmol/l、钠浓度为100 mmol/l，且ph为约7.4。

60、术语“belzer uw溶液”（威斯康星大学溶液）涉及一种溶液，具有以下组成：

61、

乳糖酸（作为内酯）

35.83 g

105 mmol/l

磷酸二氢钾

3.40 g

25 mmol/l

七水硫酸镁

1.23 g

5 mmol/l

五水合棉子糖

17.83 g

30 mmol/l

腺苷

1.34 g

5 mmol/l

别嘌呤醇

0.136 g

1 mmol/l

总谷胱甘肽

0.922 g

3 mmol/l

氢氧化钾

5.61 g

100 mmol/l

氢氧化钠／盐酸

足量，ph：7.4

注射用水

足量至1000 ml

62、术语“williams e”涉及williams, g.m., and gunn, j.m., long-term cellculture of adult rat liver epithelial cells. exp. cell research, 89, 139-142(1974)和williams, g.m. et al., isolation and long-term cell culture ofepithelial-like cells from rat liver. exp. cell research, 69, 106-112 (1971)中所述的细胞培养基。

63、术语“dmem”涉及dulbecco, r., and freeman, g., plaque production by thepolyoma virus. virology, 8, 396-397 (1959)；smith, j.d., freeman, g., vogt,m., and dulbecco, r., the nucleic acid of polyoma. virus, 12, 185-196 (1960)；morton, h.j., a survey of commercially available tissue culture media. invitro, 6, 89 (1970)；rutzky, l.p., and pumper, r.w., supplement to a survey ofcommercially available tissue culture media (1970). in vitro, 9, 468 (1974)中所述的细胞培养基。

64、

一般分子生物学：核酸序列、表达

65、术语“基因”指含有至少一个开放阅读框（orf）的多核苷酸，所述orf能够在转录和翻译后编码特定多肽或蛋白质。多核苷酸序列可用于鉴定与它们相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。

66、在本说明书的上下文中，术语“重组”涉及核酸，其是克隆、限制和／或连接的一个或几个步骤的产物，并且其不同于天然存在的核酸。重组病毒颗粒包括重组核酸。

67、术语“基因表达”或“表达”，或术语“基因产物”，可指核酸（rna）的产生或肽或多肽的产生（也分别称为转录和翻译）的过程——及其产物——之一、或两者，或调节遗传信息的加工以产生多肽产物的任何中间过程。术语“基因表达”也可应用于rna基因产物，例如调节rna或结构（例如核糖体）rna，的转录和加工。如果表达的多核苷酸来源于基因组dna，则表达可包含在真核细胞中mrna的剪接。表达可在转录和翻译水平上进行测定，换句话说，mrna和／或蛋白质产物。

68、

抑制

69、在本说明书的上下文中，术语“抑制剂”涉及可用于与其指定靶标（磷脂酰肌醇4-激酶，特别是在本说明书的情况下pi4kb）相互作用并特异性干扰其指定靶标的生物活性的，任何药学上可接受的试剂或化合物。抑制剂包含小分子药物，其满足lipinski的五规则（所述药物满足以下规则中的至少三个：氢键供体数目≤5；氢键受体数目≤10；分子量<500da；辛醇/水分配系数≤5）。本文提及了此类抑制剂的具体实例。

70、在本发明的上下文中，术语“pi4kbk抑制剂”涉及可用于干扰磷脂酰肌醇4激酶β（pi4kb）的生物活性，即磷脂酰肌醇磷酸化以产生磷脂酰肌醇-4-磷酸的化合物。术语“pi4kbk抑制剂”包含请求保护的式1、2和3的化合物。pi4kb抑制剂的具体实例是ucb9608、bf738735和pik93：（ucb9608）、（bf738735）、（pik93）。

71、

治疗

72、如本文所用，术语“治疗”任何疾病或病症（例如nafld或nash）在一个实施方式中，指改善疾病或病症（例如减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展）。在另一个实施方式中，“治疗”指减轻或改善至少一种身体参数，包含患者可能无法辨别的那些。在另一个实施方式中，“治疗”指在身体上（例如，可辨别症状的稳定化）、在生理上（例如，身体参数的稳定化）或两者上调节疾病或病症。除非下文具体描述，否则评估疾病的治疗和／或预防的方法通常是本领域已知的。在本发明的上下文中，脂肪肝疾病的治疗特别涉及降低肝甘油三酯水平和／或预防单纯性肝脂肪变性引起的nash进展。

73、

有机化学

74、本说明书的化学式遵循有机化学惯例，不在碳骨架上示出氢原子。碳为四价，并且除非另外示出，否则假定未示出的键为氢。氢可与氘交换而不改变分子的本体化学性质；然而，在染料或药物分子的情况下，氢与氘的交换可能导致分子的光谱性质或受体相互作用的变化。除非本文另外明确说明，否则通过本段落的第一句中重述的惯例明确或隐含示出的化学式的公开内容涵盖其中一个或几个氢原子被氘交换的分子。

75、术语“(甲氧基)(甲基)苯基”涉及被甲氧基（-och3）和甲基（-ch3）取代基取代的苯基部分。类似地，“(甲基)(三氟甲氧基)苯基”涉及被甲基取代基和三氟甲氧基（-o-cf3）取代基取代的苯基部分。

76、术语“(甲氧基)(甲基)吡啶基”涉及被甲氧基（-och3）取代基和甲基（-ch3）取代基取代的吡啶基部分。类似地，“(乙基)(甲氧基)吡啶基”、“(乙氧基)(甲基)吡啶基”和“二甲氧基吡啶基”涉及分别被乙基（-ch2-ch3）、甲氧基（-och3）、乙氧基（-o-ch2-ch3）、甲基（-ch3）或两个甲氧基（-och3）取代的吡啶基部分。

77、术语“羟甲基”和“羟乙基”分别涉及-ch2-oh和-ch2-ch2-oh。

78、术语“卤素”指氟、氯、溴和碘中的一种。在特定实施方式中，此术语指氯、溴和碘的组的成员。在其它特定实施方式中，此术语指氯和溴的组的成员。

79、在本说明书的上下文中，术语“烷基”涉及饱和直链、支链或（部分或完全）环烃。特别是，术语“烷基”涉及饱和直链烃。

80、在本说明书的上下文中，术语“c1-c4烷基”涉及具有1、2、3或4个碳原子的饱和直链或支链烃。c1-c4烷基的非限制性实例是甲基、乙基、丙基、丙-2-烯基、正丁基、2-甲基丙基、叔丁基、环丁基、环丙基、甲基环丙基。在某些实施方式中，c1-c4烷基为甲基、乙基、丙基或丁基部分。

81、在本说明书的上下文中，“c1-c6烷基”涉及具有1、2、3、4、5或6个碳原子的饱和直链或支链烃。c1-c6烷基的非限制性实例包含上面给出的c1-c4烷基的实例，并还有正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、环戊基、环己基、甲基环戊基。在某些实施方式中，c5烷基为戊基或环戊基部分且c6烷基为己基或环己基部分。

82、当在化学式的上下文中使用时，可以使用下列缩写：“me”为甲基ch3，“et”为乙基-ch2ch3，“prop”为丙基-(ch2)2ch3（正丙基，

n-pr）或-ch(ch3)2（异丙基，

i-pr），“but”为丁基-c4h9、-(ch2)3ch3、-chch3ch2ch3、-ch2ch(ch3)2或-c(ch3)3。

83、如本文所用，术语“药物组合物”指本发明的化合物、或其药学上可接受的盐，连同至少一种药学上可接受的载体。在某些实施方式中，根据本发明的药物组合物以适于局部、肠胃外或可注射施用的形式提供。

84、如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包含本领域技术人员已知的任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂（例如抗菌剂、抗真菌剂）、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合（参见例如remington: the science and practice of pharmacy, isbn0857110624）。本发明还包括在“药学上可接受的载体”含义内的纳米颗粒、脂质体或细胞载体。