靶向肿瘤干细胞与瘤内具核梭杆菌的时空序贯纳米递药系统及应用

本发明属于生物医药，具体涉及靶向肿瘤干细胞与瘤内具核梭杆菌的时空序贯纳米递药系统及应用。

背景技术：

1、结直肠癌（colorectal cancer, crc）是全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤。以奥沙利铂（oxa）、氟尿嘧啶（5-fu）等为基础的化疗是crc治疗的重要基石，但超过50%的患者会出现化疗耐药。一旦发生耐药，患者预后显著恶化：5年无复发生存率从90.5%骤降至58.5%，远处转移率则从6.9%显著升至26.5%。因此，化疗耐药是导致crc治疗失败的核心瓶颈。

2、近年研究揭示，化疗耐药的形成与维持主要源于肿瘤干细胞（csc）与瘤内具核梭杆菌（f.n）的协同驱动。csc是具有自我更新与多向分化潜能的细胞亚群，被视为肿瘤发生、发展与复发的“种子”。它们通常处于细胞周期静止状态，对常规化疗药物具有天然抵抗能力，且在化疗压力下会进一步富集，这使其成为化疗耐药形成的内在根源。f.n是一种在结直肠癌中高度富集的革兰氏阴性厌氧菌，其持续存在已被证明与不良治疗反应和高复发率显著相关。研究表明，f.n主要通过两种机制介导耐药：其一，激活固有免疫信号通路，诱导肿瘤细胞发生保护性自噬，直接削弱奥沙利铂等药物的细胞毒性；其二，通过抑制nk细胞、招募髓源性抑制细胞等，塑造免疫抑制微环境，间接破坏化疗诱导的抗肿瘤免疫应答。这些机制使f.n成为维持并促进耐药的关键外因。更为关键的是，csc与f.n形成了相互促进的恶性循环：f.n及其代谢产物（如甲酸）可直接增强肿瘤细胞的干性特征，从而巩固csc群体；同时，csc驱动的肿瘤快速生长会加剧瘤内乏氧，为f.n这类厌氧菌的定植与增殖创造有利条件。因此，联合干预csc与f.n是逆转crc化疗耐药的关键。

3、尽管已证明临床药物全反式维甲酸（atra）可分化csc、甲硝唑（mtz）可清除f.n，两药在体内联用仍面临空间与时序上的双重壁垒：空间上，靶点分布特殊，药物靶向困难。csc特异性富集于肿瘤深部缺氧区。f.n则主要定植于结直肠癌细胞外间隙，然而，csc所在的肿瘤深部，atra因无法穿透致密的间质屏障而难以抵达；f.n所在的间隙区域，mtz也因缺乏微环境的主动响应而难以富集。时序上，须先清除f.n、后分化csc。已有研究报道f.n可通过ly6a/rps14信号轴增强csc增殖及干性。若在未清除f.n的情况下直接分化csc，疗效将显著受限。然而，常规的两药联用，无法在肿瘤区域精准控制这一关键干预顺序。

4、综上所述，如何在肿瘤组织中实现针对csc与f.n的协同干预，同时精准满足空间靶向分布与先后时序递送的双重需求，是本领域亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了靶向肿瘤干细胞与瘤内具核梭杆菌的时空序贯纳米递药系统及应用，所述纳米递药系统的外壳为负载硝基咪唑类抗菌药物的阴离子透明质酸，内核为irgd肽修饰的负载全反式维甲酸的阳离子脂质体。所述纳米递药系统的外壳在肿瘤腔隙首先响应高表达的透明质酸酶发生降解，优先释放硝基咪唑类抗菌药物清除腔隙瘤内具核梭杆菌，随后暴露的内核借助irgd肽（cas号：1392278-76-0）穿透至深部缺氧区，释放全反式维甲酸诱导肿瘤干细胞分化。该系统通过时空序贯的药物释放与递送，应对干预肿瘤干细胞与瘤内具核梭杆菌所面临的时空壁垒，为逆转结直肠癌化疗耐药提供解决方案。

2、为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：

3、本发明第一方面提供了靶向肿瘤干细胞与瘤内具核梭杆菌的时空序贯纳米递药系统，所述递药系统的粒径为100 nm~300 nm，zeta电位为-20 mv至-40 mv。

4、所述递药系统具有核-壳结构，外壳为负载硝基咪唑类抗菌药物的阴离子透明质酸，内核为irgd肽修饰的负载全反式维甲酸的阳离子脂质体，所述外壳通过静电作用包覆于所述内核表面；所述外壳能够在肿瘤微环境中响应透明质酸酶降解而释放硝基咪唑类抗菌药物，所述内核能够穿透肿瘤深部缺氧区并释放全反式维甲酸。

5、进一步地，所述递药系统由以下步骤制备得到：

6、将1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-3-三甲基铵基丙烷、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-irgd和全反式维甲酸溶于有机溶剂，经薄膜分散、水化、超声及聚碳酸酯膜挤压，得到irgd肽修饰的负载全反式维甲酸的阳离子脂质体；

7、将硝基咪唑类抗菌药物与透明质酸溶于pbs缓冲液，得到含有硝基咪唑类抗菌药物的透明质酸溶液；

8、将所述阳离子脂质体与所述含有硝基咪唑类抗菌药物的透明质酸溶液混合，通过静电自组装使透明质酸包覆于阳离子脂质体表面，即得。

9、进一步地，所述1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-3-三甲基铵基丙烷、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-irgd和全反式维甲酸的质量比为4~12：4~12：0~4：0.25~2：0.5~3：1。

10、进一步地，所述硝基咪唑类抗菌药物为甲硝唑。

11、进一步地，所述含有硝基咪唑类抗菌药物的透明质酸溶液中甲硝唑的浓度为1mg/ml~2mg/ml，透明质酸的浓度为4mg/ml~6mg/ml。

12、进一步地，所述阳离子脂质体与所述含有硝基咪唑类抗菌药物的透明质酸溶液混合的体积比为1:0.95~1.05。

13、进一步地，所述混合为4℃条件下搅拌30分钟。

14、进一步地，所述透明质酸的分子量为20 kda。

15、本发明第二方面提供了一种所述时空序贯纳米递药系统在制备逆转实体瘤化疗耐药药物中的应用。

16、进一步地，所述药物与奥沙利铂和/或氟尿嘧啶联合使用。

17、进一步地，所述实体瘤化疗耐药为结直肠癌化疗耐药。

18、进一步地，所述药物通过时空序贯方式先清除瘤内具核梭杆菌、后诱导肿瘤干细胞分化，从而逆转结直肠癌化疗耐药。

19、进一步地，所述结直肠癌化疗耐药是由肿瘤干细胞与瘤内具核梭杆菌协同驱动所致。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

21、本发明提供了一种靶向肿瘤干细胞与瘤内具核梭杆菌的时空序贯纳米递药系统及应用。该系统通过构建“外壳-内核”双层响应型纳米结构，实现了mtz与atra在肿瘤微环境中的空间差异化分布与时序可控性释放，从而有效打破csc与f.n相互促进的恶性循环。具体而言：

22、时空序贯纳米系统ha/mtz-l-irgd@atra外壳（负载mtz的透明质酸）在肿瘤腔隙首先响应高表达的透明质酸酶发生降解，优先释放mtz清除腔隙f.n，随后暴露的内核（irgd肽修饰的负载atra阳离子脂质体）借助irgd肽穿透至深部缺氧区，释放atra诱导csc分化。该系统通过时空序贯的药物释放与递送，解决了干预csc与f.n所面临的空间壁垒与时序壁垒，为开发逆转结直肠癌化疗耐药提供解决方案，可用于制备逆转结直肠癌化疗耐药的药物。