EuphebracteolatinA在制备治疗脑出血的药物中的应用

本发明属于医药，尤其是涉及一种euphebracteolatin a在制备治疗脑出血的药物中的应用。

背景技术：

1、脑出血（intracerebral hemorrhage, ich）是中枢神经系统最具破坏性的急重症之一，具有极高的致死率与致残率。其病理损伤机制复杂，主要涵盖血肿形成所致的原发性机械压迫，以及血液分解产物激发的继发性脑损伤（secondary brain injury, sbi）。在继发性损伤阶段，红细胞裂解释放的血红蛋白及hemin等产物可诱导神经元发生氧化应激、细胞凋亡及铁死亡，进一步加重脑组织损伤和神经功能障碍。因此，减轻脑出血后神经元损伤、抑制细胞凋亡及铁死亡已成为脑出血药物研发的重要方向。

2、月腺大戟（

euphorbia ebracteolata hayata）为大戟科植物，其干燥根在传统医学中用于散结、杀虫。现代研究表明，该植物富含二萜类活性成分，其中月腺大戟素a（euphebracteolatin a，结构如式（1）所示）作为一种特征性二萜化合物，已显示一定的抗肿瘤与抗炎潜力。

3、式（1）

4、中国专利申请cn122140792a公开了月腺大戟提取物用于制备sting抑制剂的用途及用于制备预防或治疗炎症性肠病药物的用途，提及sting介导的疾病包括炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病、器官纤维化疾病、心脑血管疾病、呼吸系统疾病、中枢神经系统疾病、癌症。其中所述炎性疾病包括炎症性肠病。所述月腺大戟提取物能够抑制炎性疾病受试者体内促炎细胞因子分泌以及炎性因子分泌。另如中国专利cn118121593b公开了包含（-）-驴食草酚与鼠尾草酚酮的组合物用于阿尔茨海默病的治疗。但是，迄今国内外尚未见euphebracteolatin a用于脑出血的相关报道，其是否能够改善脑出血后神经元损伤、抑制细胞凋亡及铁死亡亦缺乏研究。

技术实现思路

1、基于目前现有技术缺少euphebracteolatin a能否用于脑出血的相关研究，本发明提供euphebracteolatin a在制备治疗脑出血的药物中的应用。本技术方案的提出为临床解决脑出血后继发性神经损伤、减轻神经元损伤提供一种全新的小分子药物选择。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明提供euphebracteolatin a在制备治疗脑出血的药物中的应用。

4、在本发明的一个或多个实施方式中，提供euphebracteolatin a在制备减轻治疗脑出血后神经元损伤、抑制细胞凋亡及铁死亡的药物中的应用。

5、在本发明的一个或多个实施方式中，所述药物为改善脑出血后的神经功能评分、减小脑出血血肿面积、降低脑出血引起的脑组织含水量、减少出血区域的细胞凋亡、和/或抑制神经元铁死亡的药物。

6、在本发明的一个或多个实施方式中，所述药物为静脉注射制剂，即所述药物的给药方式为静脉注射。

7、在本发明的一个或多个实施方式中，所述药物，其单位剂量中含有euphebracteolatin a的量相当于1 mg/kg~2.5 mg/kg（基于受试者体重）。

8、在本发明的一个或多个实施方式中，所述药物在体外细胞实验中的有效浓度为10μm。

9、在本发明的一个实施方式中，所述euphebracteolatin a是月腺大戟中制备得到的，所述euphebracteolatin a的制备方法包括以下步骤：

10、（1）硅胶色谱纯化：将月腺大戟提取浓缩液通过硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯溶液进行洗脱，收集含有euphebracteolatin a的馏分并回收溶剂，得浸膏a1；将浸膏a1再次用硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯溶液洗脱，得浸膏a2；

11、（2）反相色谱纯化：将浸膏a2通过反相硅胶c18色谱分离，以甲醇-水溶液洗脱，收集馏分并回收溶剂，得浸膏a3；

12、（3）结晶纯化：将浸膏a3用乙酸乙酯溶解后加入正己烷，配制成乙酸乙酯-正己烷溶液，常温放置培养晶体，即得euphebracteolatin a。

13、在本发明的一个或多个实施方式中，步骤（1）中，所述石油醚-乙酸乙酯溶液的体积比为100：1~10：1。

14、在本发明的一个或多个实施方式中，步骤（2）中，所述甲醇-水溶液中甲醇的体积百分比为65%~90%。

15、在本发明的一个或多个实施方式中，步骤（3）中，所述乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯与正己烷的体积比为1：4；所述常温放置的时间为24~48小时。

16、在本发明的一个或多个实施方式中，步骤（1）中，所述月腺大戟提取浓缩液采用乙酸乙酯作为提取溶剂制备得到；和/或，所述月腺大戟提取浓缩液的浓度相当于生药0.08g/ml~0.09 g/ml。

17、在本发明的一个或多个实施方式中，步骤（1）所述硅胶色谱纯化中，浸膏样品与硅胶的重量比为1：25~1：80；和/或，步骤（2）所述反相色谱纯化中，浸膏样品与c18反相硅胶的重量比为1：25~1：40；和/或，步骤（3）所述结晶纯化中，样品与溶剂的重量比为1：50~1：100。

18、在本发明的一个或多个实施方式中，步骤（1）中，所述硅胶为100-200目、200-300目或300-400目。

19、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

20、1、本发明首次发现并验证了euphebracteolatin a在治疗脑出血中的显著药效。药效学实验表明：

21、在体内ich小鼠模型中：euphebracteolatin a能显著降低血肿面积与脑组织含水量、改善神经功能评分，并减少损伤区域的tunel染色阳性细胞数；

22、在体外hemin诱导的ht22神经元损伤模型中：euphebracteolatin a能够降低cleaved-caspase-3表达及bax/bcl-2比值，恢复gpx4和slc7a11蛋白表达，降低acsl4蛋白表达，表明其能够有效抑制神经元凋亡及铁死亡。

23、上述实验数据首次证实了euphebracteolatin a对脑出血后继发性脑损伤的干预作用，为其在制备治疗脑出血药物中的应用提供了坚实的实验依据。

24、2、本发明提供的euphebracteolatin a在治疗脑出血上的用途，属于一种新发现的用途，现有技术中未有体现：

25、虽然现有技术cn122140792a有提及“月腺大戟提取物用于中枢神经系统疾病的治疗”的方案，但是，该现有技术cn122140792a未涉及脑出血。虽然现有技术cn118121593b公开了包含（-）-驴食草酚与鼠尾草酚酮的组合物用于阿尔茨海默病的治疗。但是，同样该方案也并未公开脑出血（intracerebral hemorrhage，ich）作为治疗对象，也未涉及脑出血相关动物模型或细胞实验。现有技术中未有公开月腺大戟提取物（或euphebracteolatin a）能够用于脑出血治疗。

26、阿尔茨海默病、帕金森病属于慢性神经退行性疾病，其主要病理机制包括异常蛋白聚集、慢性神经炎症及神经元持续退变。而脑出血属于急性脑血管疾病，其病理过程包括血肿形成、血脑屏障破坏、血红蛋白及铁离子毒性、急性神经炎症及继发性脑损伤。两类疾病在发病机制、病理过程及治疗策略方面均存在明显区别。因此，本领域技术人员不能基于神经退行性疾病的治疗方案，合理预期其同样适用于脑出血。

27、另外，虽然，专利cn118121593b公开的鼠尾草酚酮与本技术euphebracteolatin a结构相近，但是这两种化合物并非同一种化合物，天然产物的生物活性通常与其具体化学结构、官能团及组成空间构型密切相关。虽然鼠尾草酚酮与euphebracteolatin a均属于天然来源的小分子化合物，但二者属于不同的具体化合物，其化学结构并不相同，因此不能仅依据结构相似即合理预期二者具有相同的药理作用。所以，该专利cn118121593b既未公开鼠尾草酚酮能够治疗脑出血，也未公开euphebracteolatin a具有脑出血治疗作用。

28、本技术通过脑出血相关药效学实验，证明了euphebracteolatin a能够改善脑出血后的脑损伤（改善神经功能评分、减少脑出血面积等）。上述技术效果在现有技术中均未公开。

29、本发明提供的euphebracteolatin a在制备治疗脑出血药物方面具有良好的应用前景。

30、3、本技术方案中还提供了一种工艺简便、纯度高、得率稳定的从月腺大戟中制备二萜类化合物euphebracteolatin a的方法，以解决现有天然产物提取过程中存在的提纯难度大、难以规模化制备的问题。

31、现有技术中，cn118702558a采用硅胶柱层析联合制备型hplc实现euphebracteolatin a的终纯化，虽可达纯度98.7%以上，但对设备依赖度高，规模化适用性受限。与之不同的是，本技术通过硅胶色谱纯化、反相硅胶c18色谱纯化及重结晶步骤，从月腺大戟提取物中获得高纯度euphebracteolatin a。本技术采用“两级硅胶柱层析、开放式反相c18柱色谱（φ50×800mm，甲醇-水梯度洗脱，tlc监测收集）、两次重结晶”的多级纯化路线，不依赖制备型hplc作为关键终纯化步骤。该工艺通过不同分离原理的逐级富集，在保证hplc纯度达92%以上的基础上，为euphebracteolatin a的制备提供了一种设备依赖性更低、更利于规模放大的替代方案。