双氢青蒿素金属多酚纳米前药及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，特别是涉及双氢青蒿素金属多酚纳米前药及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，临床治疗通常包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、抗her2靶向治疗及免疫治疗等。不同分子分型乳腺癌的生物学行为和治疗反应差异较大，其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，tnbc）缺乏雌激素受体、孕激素受体及her2有效治疗靶点，侵袭性强、复发转移风险高，是乳腺癌治疗中的难点之一。

2、免疫检查点抑制剂为乳腺癌，尤其是部分tnbc患者提供了新的治疗方向。pd-1/pd-l1通路阻断能够解除肿瘤细胞对t细胞免疫杀伤的抑制，使效应t细胞恢复增殖、细胞因子分泌和肿瘤杀伤功能。然而，乳腺癌总体免疫原性不如黑色素瘤等肿瘤，部分患者存在肿瘤浸润淋巴细胞不足、树突状细胞活化不充分、抗原递呈效率低、免疫抑制性细胞富集、肿瘤细胞对免疫杀伤不敏感等问题，导致单用pd-1/pd-l1抑制剂的应答率有限。

3、因此，亟需开发能够同时提高肿瘤细胞免疫原性、诱导免疫原性细胞死亡、重塑肿瘤免疫微环境，并与pd-l1免疫检查点抑制剂协同的治疗策略。该类策略有望将免疫浸润不足或免疫应答较弱的“冷肿瘤”转化为更易被免疫系统识别和清除的“热肿瘤”，从而提高乳腺癌免疫治疗效果。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供双氢青蒿素金属多酚纳米前药及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。在乳腺癌肿瘤微环境或乳腺癌细胞内，本发明提供的双氢青蒿素金属多酚纳米前药可在高gsh条件下发生二硫键断裂并释放dha，同时消耗gsh；fe3+被还原为fe2+后与dha内过氧桥发生类fenton反应，促进ros产生、脂质过氧化和铁死亡。铁死亡及dha相关氧化应激可进一步诱导icd标志信号，包括crt暴露、atp释放和hmgb1释放，从而促进树突状细胞成熟和t细胞抗肿瘤免疫应答。

2、铁死亡（ferroptosis）是一种以铁依赖性脂质过氧化累积为核心特征的调控性细胞死亡方式，其发生通常与细胞内亚铁离子积累、活性氧生成、谷胱甘肽（glutathione，gsh）耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4（gpx4）活性降低以及膜脂质过氧化产物增加有关。与凋亡、坏死性凋亡等死亡方式相比，铁死亡在形态学、生化指标和免疫效应上具有独特性。

3、乳腺癌细胞，尤其是部分高侵袭性或耐药性乳腺癌细胞，常存在铁代谢重编程、氧化还原稳态异常和脂质代谢改变。通过诱导肿瘤细胞铁死亡，可突破部分传统细胞死亡通路耐受，并可能增强肿瘤抗原释放、炎症信号暴露和免疫细胞浸润。因此，铁死亡诱导剂与免疫检查点抑制剂联合，是乳腺癌治疗中具有开发价值的方向。

4、但单纯补铁或单一诱导ros的方式容易受到肿瘤细胞高gsh、高抗氧化能力及药物递送效率不足的限制。理想的铁死亡诱导纳米体系应同时具备肿瘤微环境响应性、铁源供给、gsh消耗、ros放大、脂质过氧化增强及免疫激活能力。

5、免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，icd）是指肿瘤细胞在特定治疗刺激下发生死亡并伴随免疫激活信号释放的过程。典型icd标志包括细胞表面钙网蛋白（calreticulin，crt）暴露、atp释放和高迁移率族蛋白b1（hmgb1）释放。上述损伤相关分子模式可促进树突状细胞募集、吞噬肿瘤抗原、成熟及抗原递呈，从而激活cd8+t细胞介导的抗肿瘤免疫应答。

6、在乳腺癌中，icd诱导可增加肿瘤抗原可及性和抗原递呈信号，但肿瘤微环境中的pd-l1表达仍可通过pd-1/pd-l1通路抑制t细胞效应功能。因此，将能够诱导icd和铁死亡的纳米前药与pd-l1抑制剂联合，有望实现“先增强抗原释放与免疫启动，再解除t细胞抑制”的协同治疗。

7、双氢青蒿素（dihydroartemisinin，dha）是青蒿素类化合物的重要活性衍生物，分子中含有内过氧桥结构。该结构可在铁离子参与下发生裂解并产生自由基或活性氧相关中间体，从而引发氧化损伤、线粒体功能障碍、脂质过氧化及细胞死亡。已有研究提示dha具有一定抗肿瘤潜力，且可与肿瘤细胞铁代谢异常相结合。

8、然而，游离dha存在水溶性和稳定性有限、体内分布缺乏选择性、肿瘤部位有效暴露不足、系统给药后难以充分利用肿瘤微环境特征等不足。若仅将dha物理包载于常规载体中，可能出现载药量有限、提前泄漏、载体本身无治疗贡献以及制备过程复杂等问题。因此，有必要将dha设计为可响应肿瘤细胞内高gsh环境的前药结构，并进一步构建具有治疗功能的金属多酚架构。

9、金属-多酚网络（metal-phenolic networks，mpns）是由多酚配体与金属离子通过配位作用自组装形成的纳米架构，具有制备条件温和、结构可调、表面功能化方便、生物相容性较好、可作为药物递送平台等特点。多巴胺（dopamine，da）含有邻苯二酚结构，能够与fe3+形成配位结构，并可作为构建含铁纳米前药的多酚配体。

10、肿瘤细胞内gsh水平通常高于正常组织。利用二硫键作为连接臂，可实现还原响应性断裂和药物释放；同时gsh消耗会削弱肿瘤细胞抗氧化防御，促进脂质过氧化和铁死亡。fe3+在gsh等还原性物质作用下可转化为fe2+，进一步与dha内过氧桥发生反应，放大ros生成和铁死亡信号。

11、现有技术中，dha递送体系、铁基纳米材料、金属多酚纳米结构和免疫检查点抑制剂联合治疗均有不同程度研究，但仍缺乏一种将dha、gsh响应二硫键、多巴胺邻苯二酚配体、fe3+金属多酚架构及pd-l1免疫检查点阻断有机整合的乳腺癌治疗方案。尤其缺少能够通过gsh消耗释放dha，还能通过fe3+/fe2+转化来引起类fenton反应，使机体发生铁死亡-icd-pd-l1阻断的连续放大的纳米治疗体系。

12、基于此，本发明提供了如下方案：

13、本发明提供一种双氢青蒿素金属多酚纳米前药的制备方法，包括以下步骤：

14、通过二硫键连接臂将双氢青蒿素与多巴胺共价相连，得到dha-s-s-da前药；

15、将所述dha-s-s-da前药、多酚和fe3+进行混合反应，通过配位自组装形成所述双氢青蒿素金属多酚纳米前药。

16、进一步地，所述dha-s-s-da前药的制备方法包括以下步骤：将双氢青蒿素与3,3’-二硫代二丙酸在催化剂作用下发生酯化反应，得到双氢青蒿素-二硫键中间体；将所述双氢青蒿素-二硫键中间体与盐酸多巴胺在催化剂作用下发生酰胺化反应，得到所述dha-s-s-da前药。

17、进一步地，所述多酚为单宁酸。

18、进一步地，所述dha-s-s-da前药、所述多酚和所述fe3+的摩尔比为12:8:5。

19、本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的双氢青蒿素金属多酚纳米前药。

20、本发明还提供一种治疗乳腺癌的组合物，包括pd-l1抑制剂和上述的双氢青蒿素金属多酚纳米前药。

21、本发明还提供上述的双氢青蒿素金属多酚纳米前药或组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

22、进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

23、本发明还提供一种治疗乳腺癌的药物，包括上述的双氢青蒿素金属多酚纳米前药和药学上可接受的辅料。

24、进一步地，所述药物还包括pd-l1抑制剂。

25、本发明公开了以下技术效果：

26、本发明提供一种双氢青蒿素金属多酚纳米前药。该纳米前药以dha为治疗活性片段，以含二硫键的连接臂作为gsh响应单元，以da作为多酚配位片段，先合成dha-s-s-da前药分子，再利用da结构中的邻苯二酚基团与fe3+配位，自组装形成双氢青蒿素金属多酚纳米前药（命名为fdssd）。本发明具有如下优势：

27、1. 本发明通过二硫键将dha与da连接，构建gsh响应型前药纳米体系，克服了传统dha物理包载易泄漏、稳定性差、靶向性弱、生物利用度低的缺陷。该体系可响应肿瘤高gsh微环境，实现特异性释药，降低正常组织毒副作用，提升药物靶向治疗性能。

28、2. 本发明利用da邻苯二酚基团与fe3+配位自组装，制备得到结构稳定、参数可控的金属多酚纳米材料。体系中fe3+既可参与纳米结构形成，又可在肿瘤还原环境中转化为fe2+，为肿瘤铁死亡治疗提供反应的重要铁源，实现结构构建与治疗功能一体化。

29、3. 本发明纳米体系可同步实现肿瘤内dha释放、gsh耗竭和fe2+生成。通过消耗gsh破坏肿瘤抗氧化防御体系，同时fe2+与dha过氧桥发生类fenton反应放大ros积累，诱导肿瘤细胞脂质过氧化、抑制gpx4活性，高效激活铁死亡通路，单药抑瘤效果显著优于游离dha。

30、4. 本发明将铁死亡与icd有机结合，纳米体系诱导的氧化应激与脂质过氧化可促进肿瘤细胞crt外翻、atp及hmgb1释放，有效提升低免疫原性乳腺癌的抗原暴露水平，促进树突状细胞成熟与免疫细胞浸润，抑制m2型巨噬细胞极化，有效逆转肿瘤免疫抑制微环境。

31、5. 本发明提供的fdssd可与pd-l1抑制剂协同联用，依托fdssd介导的icd效应启动抗肿瘤免疫、改善肿瘤冷微环境，同时通过阻断pd-1/pd-l1免疫逃逸通路，逆转cd8+t细胞耗竭，增强t细胞肿瘤杀伤功能，有效解决单一免疫检查点抑制剂治疗乳腺癌应答率低、疗效有限的技术难题，显著提升联合治疗效果。

32、6. 本发明提供的fdssd生物相容性好、可肿瘤特异性降解，无长期蓄积毒性，具备优异的体内安全性。本发明实现dha老药新用，适配三阴性乳腺癌、低免疫浸润及免疫治疗耐药等难治性乳腺癌，为乳腺癌铁死亡和免疫联合靶向治疗提供了新的可行的纳米技术方案，临床转化前景广阔。