黄芪多糖抑制肺癌髓源性抑制细胞增殖调节肿瘤免疫微环境的应用

本发明涉及生物医疗，具体为黄芪多糖抑制肺癌髓源性抑制细胞增殖调节肿瘤免疫微环境的应用。

背景技术：

1、原发性支气管肺癌(简称肺癌)目前是全球癌症发病率第二，死亡率第一的恶性肿瘤。目前肿瘤免疫治疗已成为肺癌治疗的新方向，它是通过激活机体免疫系统产生抗肿瘤作用的一种治疗方式，但其疗效存在明显的个体差异，越来越多的证据将这种治疗结果的差别归于肿瘤微环境的异质性。

2、髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，mdscs)作为肿瘤微环境中重要的免疫调节细胞，与肿瘤细胞、其他免疫活性细胞及其产生的各种细胞因子通过不同机制相互共同作用于肿瘤的进展，被认为是肿瘤免疫逃逸机制的关键。

3、mdscs是一群异质性的髓系细胞，是被阻止分化为成熟髓系细胞的活化的未成熟的髓系细胞(immature myeloid cells，imc)，具有抑制免疫细胞应答的能力，在小鼠和人类的研究中均发现，mdscs可分为两个不同的亚群：粒细胞样mdscs(g-mdscs)和单核细胞样mdscs(m-mdscs)。小鼠的mdscs表型分别为cd11b+ly6g+ly6clow/int(g-mdscs)和cd11b+ly6g-ly6chigh(m-mdscs)人类的mdscs表型分别被定义为cd11b+cd33+cd15+cd66+hla-drlo/-(g-mdscs)和cd11b+cd33+cd14+hla-drlo/-(m-mdscs)。在病理条件下，多种炎性介质、细胞因子及趋化因子可通过驱动mdscs的增殖、募集和活化，促进肿瘤细胞的增殖和转移，第一类是由肿瘤细胞产生、介导骨髓细胞的分化并促进mdscs扩增、募集的分子，如血管内皮生长因子(vegf)、前列腺素e2(pge2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、il-6、il-10等；第二类是由肿瘤间质细胞及活化的t细胞产生的具有促进mdscs活化的可溶性因子，包括ifn-γ、tgf-β、il-4、il-13。mdscs可通过多种机制介导肿瘤免疫逃逸，发挥免疫抑制功能，从而抑制抗瘤免疫应答。如mdscs富含精氨酸酶-1(arg-1)、诱导性一氧化氮合酶(inos)与活性氧(ros)，前两者可消耗精氨酸，抑制t细胞的增殖和免疫功能，inos产生一氧化氮(no)促进t细胞凋亡，而且no与ros均可破坏t细胞抗原受体，影响抗原识别；此外肿瘤微环境中的含有大量由肿瘤细胞及肿瘤间质细胞分泌的各种细胞因子，它们除了作用于各种免疫效应细胞如t、b细胞外，也通过作用于mdscs的增殖及活化过程影响mdscs对肿瘤发生发展的作用。

4、与mdscs相关的关键信号通路有jak/stat、il-1β/nf-κb、pi3k/akt/mtor、pge2/cox2及ras。其中，jak/stat通路的激活在免疫逃逸中起重要作用，尤其是信号传导及转录激活因子3(stat3)。因此，目前国内外对stat家族在肺癌方面的研究主要集中在stat3。大量研究显示，在肺癌细胞中发现有stat3的过度表达及持续激活，导致肺癌组织中stat3的表达明显高于癌旁组织。磷酸化的stat3主要通过上调细胞周期蛋白d1、促生长基因myc、凋亡抑制基因bcl-xl等促进mdsc的扩增和存活，stat3还可以增加tgf-β、il-6、il-10和vegf等抑制性细胞因子的表达，还能被这些细胞因子所激活，增强其自身活性，此外stat3通过抑制dc成熟，促进treg聚集，诱导免疫抑制性微环境，同时还抑制nk细胞、中性粒细胞介导的杀伤作用，共同促进肿瘤细胞免疫逃逸。

5、免疫抑制状态是影响肺癌治疗效果的重要原因，mdscs可作为一种新的治疗靶点，应对mdscs的主要策略可概括为清除、钝化其功能及干预mdscs增殖分化。zheng等研究发现西咪替丁可通过诱导mdscs表达fas及fasl引起其凋亡，导致肿瘤部位mdscs数量减少、功能降低，从而控制肿瘤。sawant等联合使用吉西他滨与超氧化物歧化酶模拟物显著降低肺癌微环境中mdscs的免疫抑制作用，从而提高cd8+t细胞及记忆细胞数量和免疫功能，不仅减少肿瘤负荷，还能防止复发与再次攻击，延长生存期。

6、由于中草药多糖具有多种药理活性、毒性低、制备方便等优点，其生物学性质的研究呈指数增长。黄芪多糖来源于中药黄芪干根中的含量最高的主要生物活性成分。黄芪多糖具有抗癌、调节免疫力、抗氧化、抗病毒、抗衰老等作用。研究表明，黄芪多糖抗肺癌作用机制主要是通过抑制增殖、抑制侵袭与转移、调节免疫、抑制骨髓干细胞、调控自噬、协同药物等方面。

7、研究表明，中药及其活性成分能够调控mdsc的表达，在机体调节免疫、改变肿瘤微环境等中起到重要作用。比如，三叶青提取物三叶青黄酮能抑制荷lewis瘤肺癌小鼠体内il-6表达，降低荷瘤小鼠骨髓内mdscs的比例，从而通过改善肿瘤微环境的免疫抑制状态发挥抗肿瘤作用。梅庆男、刘素霞在对肺癌患者外周循环mdscs的研究中发现，黄芪多糖能够有效降低nsclc患者外周循环中mdscs水平，改善免疫功能，提高临床治疗总有效率。柴旺等发现黄芪多糖能够降低荷瘤小鼠脾脏中的mdscs水平，抑制荷瘤鼠黑色素瘤的生长。

8、然而，目前尚缺乏黄芪多糖对肺癌肿瘤免疫微环境中mdscs作用及其机制的研究，故而本发明利用体内外实验验证黄芪多糖对肺癌肿瘤免疫微环境肿瘤mdscs作用及其机制。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种黄芪多糖抑制肺癌髓源性抑制细胞增殖调节肿瘤免疫微环境的应用。

3、(二)技术方案

4、优选的，所述黄芪多糖抗肿瘤，通过下调il-6/jak/stat3信号通路抑制mdscs增殖调节非小细胞肺癌免疫微环境。

5、优选的，所述黄芪多糖抑制肿瘤生长。

6、优选的，所述黄芪多糖增加瘤体组织cd8+t、cd4+t细胞比例，减少瘤体组织mdsc细胞比例。

7、优选的，所述黄芪多糖增加小鼠血清细胞因子ifn-γ和tnf-α的水平，减少小鼠血清细胞因子il-10、tgf-β1和vegf的水平。

8、优选的，所述黄芪多糖降低瘤体组织il-6、p-stat3和p-jak2蛋白表达水平。

9、优选的，磁珠法分离荷瘤c57bl/6小鼠脾脏来源的mdscs。

10、优选的，流式细胞术(flow cytometry，fcm)检测mdscs比例，鉴定mdscs的纯度。

11、优选的，cck8实验筛选黄芪多糖用药浓度。

12、优选的，实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time pcr，qpcr)检测stat3和il-6mrna表达水平。

13、优选的，蛋白质印迹(western blotting)实验检测相关蛋白表达水平。

14、(三)有益的技术效果

15、黄芪多糖能够显著抑制肿瘤生长，具有剂量依赖性。

16、黄芪多糖在治疗肿瘤的过程中作用温和，无明显毒副作用。

17、黄芪多糖能够显著增加瘤体组织cd8+t、cd4+t、nk、mdsc细胞比例，效果具有剂量依赖性。

18、黄芪多糖治疗能够显著增加小鼠血清细胞因子ifn-γ和tnf-α的水平，显著减少小鼠血清细胞因子il-10、tgf-β1和vegf的水平，具有剂量依赖性。

19、黄芪多糖治疗能够显著降低瘤体组织il-6、p-stat3和p-jak2蛋白表达水平。

20、加入黄芪多糖和转染stat3-sirna后mdsc细胞活率均降低，转染stat3-sirna后加黄芪多糖mdsc细胞活率降低。

21、加入黄芪多糖后mdsc细胞凋亡水平显著升高，mdscs细胞转染stat3-sirna后细胞凋亡水平均显著升高；与转染stat3-sirna组相比，转染stat3-sirna后加黄芪多糖mdsc细胞凋亡水平显著升高。

22、加入黄芪多糖后il-6、p-jak2和p-stat3蛋白水平表达降低，mdscs细胞转染stat3-sirna后stat3和p-stat3蛋白水平表达降低；与转染stat3-sirna组相比，转染stat3-sirna后加黄芪多糖il-6、p-jak2和p-stat3蛋白水平表达降低。