一种模块化肿瘤酸性微环境响应型毒素蛋白递送系统、构建方法及应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种模块化肿瘤酸性微环境响应型毒素蛋白递送系统、构建方法及应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤作为全球面临的重大公共卫生挑战，寻找新的治疗方法始终是现代生命科学与临床医学的核心研究内容。不可否认，化学疗法在肿瘤控制中发挥了重要作用，但由于其缺乏对肿瘤组织的靶向性，常导致全身毒副反应，例如骨髓抑制、心脏毒性及胃肠道损伤等相关副作用。同时，有限的治疗窗口及易诱导多药耐药性(multidrug resistance,mdr)等问题，严重制约了其临床疗效的进一步提升。随着分子生物学的发展及精准治疗理念的提出，构建兼具高效细胞毒活性与肿瘤靶向能力的新型抗肿瘤药物已成为研究热点。在此背景下， 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, adc)与重组免疫毒素(recombinant immunotoxins, rit)备受瞩目。这两类药物能够特异性识别肿瘤相关抗原，并在肿瘤细胞内释放强效毒性分子，进而高效诱导肿瘤细胞死亡。目前，adc与rit已成为大分子靶向抗肿瘤药物的重要研究方向。

2、毒素蛋白是一类来源于细菌、植物或动物的天然生物分子，其能够通过破坏细胞关键生命活动实现强烈的细胞毒性，此类毒素通常具有极高的催化酶活性，理论上只需单一或极少数分子成功进入细胞质，即可通过级联酶促反应使海量的核糖体或关键翻译延伸因子永久失活，其细胞毒性远超传统化学小分子药物，因此成为开发潜力最大的核心抗肿瘤机制。代表性毒素蛋白包括gelonin和白喉毒素。

3、gelonin属于i型核糖体失活蛋白，最早从植物gelonium multiflorum的种子中分离得到。能够通过特异性水解真核细胞核糖体28s rrna 亚基上的保守腺嘌呤残基，使核糖体失去结合延伸因子的能力，从而不可逆地抑制蛋白质翻译过程。由于gelonin本身缺乏细胞结合结构域，因此gelonin常被用于构建多种靶向毒素或免疫毒素体系。

4、与植物毒素不同，白喉毒素(diphtheria toxin)源于白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)是一种典型的细菌外毒素。白喉毒素由三个功能结构域组成，包括受体结合结构域、跨膜转运结构域和催化结构域。其催化结构域dta能够通过adp-核糖基化反应修饰延伸因子ef-2，从而阻断蛋白质翻译延伸过程，最终导致细胞死亡，因此dta有着巨大的运用潜力。

5、尽管这些毒素蛋白具有极强的细胞毒性，但其临床应用仍受到血液半衰期短、可溶表达困难、结构稳定性差、递送效率和选择性不足等问题的限制。因此，如何通过工程化手段实现毒素蛋白在肿瘤组织中的精准递送，成为当前研究的重要方向。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种模块化肿瘤酸性微环境响应型毒素蛋白递送系统、构建方法及应用，以植物毒素gelonin和细菌毒素白喉毒素a片段(dta)作为毒素蛋白，以spytag003/spycatcher003共价偶联体系为组装核心，将白蛋白结合域(albumin-binding domain, abd)、低ph插入肽(ph low insertion peptide, phlip)与spycatcher003整合成递送模块abd-phlip-sc (ap-sc)；分别将植物毒素gelonin和细菌毒素白喉毒素a片段(dta)与spytag003、弗林蛋白酶响应序列、内质网滞留信号肽kdel整合为st-rvrr-gelonin-kdel(st-rgk)与st-rvrr-dta-kdel (st-rdk)。经验证，st-rgk和 st-rdk均可与ap-sc在0.5h内快速偶联成完整递送系统aprgk和aprdk。体内和体外抗肿瘤研究结果表明，aprgk与aprdk能够特异性结合人血清及小鼠血清白蛋白，具备潜在的体内长循环与肿瘤富集能力，且能够显著延缓体内肿瘤生长。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供一种模块化肿瘤酸性微环境响应型毒素蛋白递送系统，所述递送系统包括靶向递送模块abd-phlip-sc和毒素效应模块st-rvrr- toxin -kdel；

4、其中，sc为spycatcher003，st为spytag003，toxin为毒素效应分子。

5、进一步的，所述毒素效应分子包括植物毒素gelonin或细菌毒素白喉毒素a片段。

6、进一步的，所述abd-phlip-sc的氨基酸序列如seq id no .1所示。

7、进一步的，所述毒素效应分子为植物毒素gelonin时，对应的毒素效应模块st-rvrr- gelonin -kdel的氨基酸序列如seq id no .2所示；

8、所述毒素效应分子为细菌毒素白喉毒素a片段时，对应的毒素效应模块st-rvrr-dta-kdel的氨基酸序列如seq id no .3所示。

9、进一步的，所述递送系统中，靶向递送模块与毒素效应模块的体积比为1:1。

10、另一方面，本发明还提供如前所述的一种模块化肿瘤酸性微环境响应型毒素蛋白递送系统的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

11、用含有同源臂的特异性引物扩增目的基因，随后使用特异性引物线性化载体，使用无缝克隆的方式构建重组表达菌株，所述目的基因包括abd-phlip-sc和st-rvrr- toxin-kdel，其中，sc为spycatcher003，st为spytag003，toxin为毒素效应分子；

12、重组表达菌株中模块蛋白表达和纯化，获取模块蛋白abd-phlip-sc和st-rvrr-toxin -kdel；

13、将模块蛋白abd-phlip-sc和st-rvrr- toxin -kdel进行连接。

14、进一步的，在扩增目的基因abd-phlip-sc时，退火温度为63℃，延伸时间为5s；在扩增目的基因st-rvrr- toxin -kdel时，退火温度为65℃，延伸时间为5s；线性化载体的退火温度为54℃，延伸时间为1min。

15、进一步的，将模块蛋白abd-phlip-sc和st-rvrr- toxin -kdel进行连接的具体操作包括：将abd-phlip-sc和st-rvrr- toxin -kdel进行等体积混合，4℃连接0.5h，即得毒素蛋白递送系统。

16、再一方面，本发明还提供如前所述的毒素蛋白递送系统在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。

17、再一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物，所述药物组合物包括如前所述的毒素蛋白递送系统，以及药物上可接受的辅料。

18、本发明的有益效果是：

19、1、本发明围绕毒素蛋白在抗肿瘤应用中面临的体内半衰期短、肿瘤靶向性不足以及多功能融合蛋白制备困难等关键问题，构建了一种基于spytag/spycatcher 的肿瘤酸性微环境响应型毒素蛋白递送系统。以植物毒素gelonin和细菌毒素白喉毒素a片段(dta)作为毒素蛋白，以spytag003/spycatcher003共价偶联体系为组装核心，将白蛋白结合域(albumin-binding domain, abd)、低ph插入肽(ph low insertion peptide, phlip)与spycatcher003整合成递送模块abd-phlip-sc (ap-sc)；分别将植物毒素 gelonin和细菌毒素白喉毒素a片段(dta)与spytag003、弗林蛋白酶响应序列、内质网滞留信号肽kdel整合为st-rvrr-gelonin-kdel(st-rgk)与st-rvrr-dta-kdel (st-rdk)。经验证，st-rgk和 st-rdk均可与ap-sc在0.5h内快速偶联成完整递送系统aprgk和aprdk。该构建方法实现了靶向递送模块与毒素效应模块在温和条件下的快速、高效组装，从而有效克服了传统基因串联融合蛋白在表达过程中易发生错误折叠及空间位阻干扰的问题，提高了多功能蛋白构建的灵活性与结构可控性。

20、2、在蛋白构建与功能表征方面，本研究成功获得了靶向递送模块ap-sc及毒素效应模块st-rgk和st-rdk，并证实它们能够组装形成完整的递送系统aprgk与aprdk。aprgk与aprdk能够特异性结合人血清及小鼠血清白蛋白，具备潜在的体内长循环与肿瘤富集能力。体外研究结果表明，借助phlip对肿瘤微酸性环境的特异性响应，该递送体系能够显著提高毒素构建体的细胞摄取效率，从而促进毒素进入胞质发挥翻译抑制作用。进一步的细胞功能实验显示，融合蛋白可明显抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡，其细胞毒效应与gelonin 对核糖体28s rrna的不可逆损伤密切相关，在酸性条件下表现出更为显著的杀伤活性。

21、3、本研究还通过ct26小鼠皮下移植瘤模型中验证了构建得到的毒素蛋白递送系统aprgk与aprdk在体内的疗效与安全性。结果证实，基于模块化策略构建的融合蛋白aprgk与aprdk均能凭借abd介导的长循环特性与优异的肿瘤靶向蓄积能力，显著延缓体内肿瘤生长。其中，aprgk通过强效阻断肿瘤细胞增殖并诱导其深度凋亡，展现出最为显著的抑瘤效果，使实验终点的肿瘤体积与重量均降至最低水平。同时，在整个治疗周期内，小鼠体重保持平稳，主要脏器指数及组织形态学观察未见异常，且反映心肌、肝脏及肾脏功能的血清生化指标均保持在正常生理范围内。

22、4、本研究从工程设计与功能验证两个层面系统证明了“白蛋白结合延长循环-酸性响应跨膜递送-胞内酶切释放-亚细胞定向滞留”的多级递送策略能够显著提升毒素蛋白的体内抗肿瘤疗效与靶向选择性。该模块化构建思路不仅为复杂多功能蛋白药物的理性设计提供了新的技术路径，也为开发高效、低毒的大分子肿瘤靶向治疗体系奠定了重要的实验基础与理论依据。