一种融合VAE序列扩增、AI进化和分子仿真模拟的天蚕素AD智能优化设计方法

本发明属于生物医药与抗菌肽分子设计，涉及一种融合vae序列扩增、ai进化和分子仿真模拟的天蚕素ad智能优化设计方法，尤其涉及一种结合变分自编码器序列扩增、ai进化优化、双模型抗菌潜力预测、分子动力学模拟筛选及宿主细胞生长验证的天蚕素ad优化方法。

背景技术：

1、抗菌肽是一类广泛存在于动物、植物和微生物中的天然免疫活性分子，通常由较短的氨基酸序列组成，具有阳离子性、两亲性和膜作用能力等特征。与传统抗生素主要依赖特异性分子靶点发挥作用不同，许多抗菌肽能够通过静电吸附、膜表面富集、插入脂质双层、诱导膜缺陷或破坏膜完整性等方式发挥抗菌作用。因此，抗菌肽在应对细菌耐药性、开发新型抗感染药物、食品防腐剂、饲料添加剂及农业病原菌防控等方面具有重要应用潜力。

2、天蚕素（cecropins）是瑞典科学家boman等首先从天蚕蛹中提取分离得到的一类抗菌肽，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞以及免疫调节等生物活性。目前，已被发现的天蚕素类抗菌肽有天蚕素a、b、c、d、e、p以及一些类似物。其中，天蚕素ad是一种由天蚕素a和天蚕素d序列片段组合形成的杂合抗菌肽，其n端主要来源于天蚕素a，c端主要来源于天蚕素d。该类杂合设计旨在结合不同天蚕素分子的优势片段，使其同时具备较强的正电性、两亲性和膜相互作用能力。天蚕素ad通常通过其带正电荷的氨基酸残基与细菌膜表面的阴离子磷脂、脂多糖或其他带负电基团发生静电吸引，并进一步通过疏水氨基酸区域与膜脂双层发生相互作用，从而引起膜结构扰动甚至膜破坏。然而，现有的天蚕素ad序列仍可能存在抗菌活性有限、稳定性不足、选择性不理想或进一步优化空间不明确等问题。因此，对天蚕素ad进行序列优化，以获得膜作用能力更强、抗菌潜力更高的突变体，具有重要意义。

3、目前，抗菌肽优化通常依赖人工经验、定点突变、氨基酸替换规则或实验高通量筛选等方式。传统人工突变方法通常根据氨基酸电荷、疏水性、两亲性、螺旋倾向等性质进行设计，虽然具有一定可解释性，但能够探索的序列空间有限，难以系统发现多位点协同突变带来的性能提升。实验高通量筛选虽然可以直接评价抗菌活性，但成本较高、周期较长，且不适合在早期阶段对大量候选序列进行快速筛除。

4、近年来，ai技术逐渐应用于抗菌肽设计领域。基于深度学习、强化学习和蛋白质语言模型的序列优化方法能够根据已有抗菌肽数据学习序列特征，并生成具有较高预测抗菌潜力的候选序列，在一定程度上提高了抗菌肽设计效率。然而，现有ai进化模型大多以单一天然序列为起点，通过局部氨基酸替换进行迭代优化，其生成序列通常局限于原始序列附近的局部搜索空间，容易陷入局部最优，难以充分探索更加丰富的序列多样性。同时，不同ai预测模型采用的数据集、网络结构及评价标准存在差异，不同模型之间可能产生预测结果不一致的问题，从而影响候选序列的筛选可靠性。

技术实现思路

1、针对现有天蚕素抗菌肽优化过程中存在的候选突变体生成效率低、序列空间探索不足、单纯人工经验难以评价多位点协同突变效果、单纯ai预测缺乏膜作用机制评价以及计算结果缺少实验支撑等问题，本发明旨在提供一种融合vae序列扩增、ai进化和分子仿真模拟的天蚕素ad智能优化设计方法。该方法以天蚕素ad为初始模板序列，通过变分自编码器（vae）构建与模板长度一致且突变位点数受限的序列，获得初始序列库，执行一次独立ai进化流程生成候选突变抗菌肽，并结合抗菌潜力预测、革兰氏阴性细菌膜体系md模拟以及大肠杆菌表达验证，对候选序列进行综合评价，从而筛选得到具有进一步开发潜力的天蚕素ad突变体。

2、本发明采用以下技术方案实现：

3、一种融合vae序列扩增、ai进化和分子仿真模拟的天蚕素ad智能优化设计方法，包括以下步骤：

4、1）以天蚕素ad的氨基酸序列作为初始模板序列，利用变分自编码器对该初始模板序列进行改造，提供多个与初始模板类似的五个氨基酸突变以内的氨基酸序列，作为初始序列库；

5、2）利用ai进化模型对所述初始序列库进行多轮突变生成，获得若干候选天蚕素ad突变序列；

6、3）利用两种不同的抗菌肽活性预测模型对所述候选天蚕素ad突变序列进行活性评分，还可进一步结合理化性质约束（如候选序列的整体正电性）进行筛选，获得初筛候选序列；

7、4）基于所述初筛候选序列分别构建多肽-革兰氏阴性细菌膜模拟体系，进行md模拟，并对每组md设置多个独立重复；

8、5）基于md模拟轨迹，计算候选天蚕素ad突变体的肽-膜质心距离、肽正电-膜负电原子对数和肽-膜原子接触数；

9、6）根据步骤5）所述指标，对候选序列的膜接近或插入程度、静电吸附能力和膜接触稳定性进行综合评价，筛选得到相较于天蚕素ad原始序列具有优化潜力的突变抗菌肽序列；

10、7）将步骤6）获得的候选序列编码基因构建于大肠杆菌表达载体中进行大肠杆菌表达验证：以天然天蚕素ad编码基因为对照，比较不同表达构建体对应宿主的比生长速率，分析候选天蚕素 ad 相较于天然天蚕素 ad 对宿主大肠杆菌生长的抑制程度，并结合质粒测序结果对候选肽可能产生的宿主细胞生长抑制进行验证。基于验证结果即可筛选得到具有开发潜力的天蚕素ad突变体。

11、具体地，步骤2）中所述ai进化模型为ampainter-1模型。步骤3）中所述ai进化模型和抗菌肽活性预测模型包括ampainter-1模型和amp-potency-prediction模型中的一种或两种。两种模型均为现有的、基于可解释深度学习的抗菌肽序列打分和进化模型。ampainter-1评分越高、amp-potency-prediction预测值越低，表示预测抗菌潜力越强。

12、在一些实施方式中，步骤2）中所述多轮突变生成包括以下步骤：在初始序列库序列的一个或多个氨基酸位点引入替换突变；对突变后序列进行抗菌潜力预测；保留满足预设阈值（具体可根据天然天蚕素ad对应的活性评分设定）的序列；将保留序列作为下一轮进化输入；重复上述过程，直至达到预设进化轮数，将所有进化轮数获得的序列作为候选突变序列。

13、优选地，步骤3）中所述初筛候选序列需在至少两个抗菌肽预测模型中均表现出相较于天蚕素ad原始序列大幅优化的预测评分，方可进入后续md模拟筛选。

14、在一些实施方式中，步骤4）中所述多肽-革兰氏阴性细菌膜模拟体系包括磷脂、带负电脂质、脂多糖或其他阴离子膜组分中的一种或多种。所述md模拟包括能量最小化、平衡模拟和生产模拟。同时，每条序列进行3组独立重复md模拟，以提高筛选结果的稳定性和可靠性。

15、具体地，步骤5）中，肽-膜质心距离用于表征候选肽接近或进入膜区域的程度，数值越小表示候选肽与膜中心越接近；肽正电-膜负电原子对数用于表征阳离子残基与阴离子膜组分之间的静电接触强度；肽-膜原子接触数用于表征候选肽与膜之间的接触面积和结合稳定性。上述指标结合多个独立重复模拟的平均值和离散程度进行评价。

16、在一些实施方式中，步骤7）所述大肠杆菌表达验证包括：将天然天蚕素ad编码基因cad2（天然肽）及候选突变体编码基因cad3至cad7（候选肽1至5）分别连接于含sumo融合标签的表达载体中，并由强启动子p00869或p01902驱动表达，得到多个表达构建体；将所得表达构建体导入大肠杆菌宿主，测定宿主比生长速率μ；当候选构建体对应宿主的μ低于天然天蚕素ad对照构建体，且质粒测序确认编码框完整时，可将其作为候选肽可能具有较强抑制宿主细胞生长的证据。对于出现移码、提前终止或其他失活突变的构建体，应将其视为可能存在宿主选择压力的间接线索，而不单独作为候选肽抗菌活性提高的确定性证据。

17、本发明还提供一系列天蚕素ad优化序列，所述优化序列采用上述方法得到，其氨基酸序列如seq id no.1-5所示。

18、本发明的有益效果为：

19、与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

20、1）本发明以天蚕素ad为初始模板序列，利用变分自编码器对该初始模板序列改造，提供多个与初始模板类似的五个氨基酸突变以内的氨基酸序列，作为初始序列库。利用ai进化模型进行候选突变序列生成，能够在较大序列空间内快速获得预测亲和力或预测抗菌潜力提高的候选突变体，提高了天蚕素ad突变体的生成效率，减少了传统人工经验设计对突变位点选择的依赖。

21、2）本发明采用多种ai模型对天蚕素ad进行独立优化与预测筛选，可从不同模型角度评价候选突变序列的优化潜力，降低单一预测模型偏差对候选序列筛选结果的影响，提高初筛候选序列的可靠性。

22、3）本发明将md模拟引入天蚕素ad突变体筛选流程，通过构建革兰氏阴性细菌膜模拟体系，实现对候选肽与细菌膜之间动态相互作用过程的进一步评价，提高了候选突变体筛选过程的机制可解释性。

23、4）本发明进一步引入大肠杆菌表达及宿主细胞比生长速率测定，可将计算筛选结果与初步细胞表型相连接。对表达构建体进行测序，可区分候选肽具有潜在宿主毒性并伴有阅读框移码、翻译提前终止等构建异常，增强候选序列评价的实验可解释性。

24、5）本发明不仅适用于天蚕素ad的序列优化，也可推广应用于天蚕素a、天蚕素d及其他阳离子两亲性抗菌肽的候选突变体生成、计算筛选和表达验证。