一种多重生物分子TR-FRET检测平台及其制备方法与使用方法与流程

本发明涉及生物医学检测，具体的，涉及一种多重生物分子tr-fret检测平台及其制备方法与使用方法。

背景技术：

1、多重生物分子的精准、高通量检测是临床疾病早期诊断、生物医学基础研究及药物研发的核心技术支撑，其中时间分辨荧光共振能量转移（tr-fret）技术凭借其背景干扰低、灵敏度高的优势，已成为生物分子定量检测的主流技术路线。目前主流的商业化检测平台如珀金埃尔默delfia、赛默飞htrf等，多采用稀土螯合物作为荧光供体，虽具备一定的检测性能，但存在稀土资源依赖、试剂成本高昂、专用设备投入大等问题，难以满足基层医疗与大规模筛查的应用需求。

2、中国发明专利cn113720818b公开了一种基于微流控芯片的荧光免疫检测系统，该系统通过集成样本池、反应池、清洗池与检测区的一体化芯片结构，结合嵌入式控制模块实现了多指标联检的自动化操作，有效简化了检测流程并缩小了设备体积。然而该技术采用传统有机荧光染料作为标记物，荧光寿命仅为纳秒级，无法通过时间门控技术消除生物基质自发荧光的干扰，检测灵敏度受到影响；且识别元件依赖单克隆抗体，开发周期长达6-15个月，批次一致性变异系数大、热稳定性不佳；同时该系统为单通道荧光检测模式，多重检测能力受限，3种以上靶标同时检测时光谱串扰率显著升高，且需配套专用检测设备，无法兼容实验室通用标准酶标仪，限制了其规模化推广应用。因此，开发兼具高灵敏度、低成本、强多重检测能力且设备兼容性好的检测平台成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明第一方面提供了一种多重生物分子tr-fret检测平台，包括固相芯片、检测探针和tr-fret检测系统；所述固相芯片包括石英基底、磷光供体和darpin（锚蛋白重复序列蛋白）识别分子；所述磷光供体包括zn-mof（锌-对苯二甲酸配位聚合物）封装氮硼共掺杂碳点复合材料；所述检测探针包括cdse/zns（硒化镉/硫化锌）核壳量子点和双正交蛋白自组装的树枝状聚合物信号载体。

2、现有tr-fret检测技术普遍存在供体材料寿命短、量子产率低、识别分子批次一致性差且信号载体组装不可控的核心缺陷，导致检测灵敏度不足、成本高昂且难以实现高通量多靶标并行检测。本发明提供的多重生物分子tr-fret检测平台通过材料体系、识别单元与信号载体的协同机理创新实现性能突破：zn-mof的刚性三维多孔框架对氮硼共掺杂碳点（cds）进行限域封装，利用mof致密晶体结构抑制碳点分子振动和非辐射跃迁、降低氧气渗透速率避免三重态激子淬灭，同时借助zn2+金属中心的重原子效应增强自旋-轨道耦合、提高系间窜越效率，再结合氮、硼元素共掺杂对碳点电子结构的调控作用稳定三重态能级，最终获得磷光寿命＞700ms、量子产率＞50%的高性能磷光供体；检测灵敏度10-100pg/ml、动态范围3-4个数量级、单次检测时间20-40min、试剂成本15-25元/次、且同时支持多靶标并行检测。

3、所述darpin识别分子用于生成kd（解离常数）＜100nm、tm（熔解温度）＞70℃的靶标特异性darpin识别分子。

4、所述双正交蛋白自组装的树枝状聚合物信号载体采用spytag003/spycatcher003与snooptag/snoopcatcher两套正交序列体系，包含主链骨架、二级骨架链和终端功能单元。

5、进一步研究发现，基于两套正交蛋白相互作用体系构建的三级树枝状聚合物信号载体，通过分步分级组装实现darpin识别分子与cdse/zns核壳量子点的空间有序排布，彻底避免传统化学偶联导致的识别位点遮蔽和量子点局部聚集淬灭问题，每个载体可稳定负载3-5个量子点单元，使整体信号强度较单点负载方式提升3-8倍，且粒径分布指数＜0.3、组装效率＞90%，为信号放大和模块化扩展提供了精准可控的分子支架；同时，ai驱动设计的darpin识别分子通过对非保守区域的定向优化，获得了结合亲和力kd＜100nm、热稳定性tm＞70℃、批次一致性变异系数＜15%的优异性能，解决了传统单克隆抗体开发周期长、热稳定性差和批次波动大的问题，为多靶标检测提供了可快速定制的高特异性识别元件；当待测样品中存在靶标分子时，靶标分子同时与固相芯片上的darpin识别分子和检测探针上的darpin识别分子结合形成“供体-靶标-受体”三元复合物，在365nm紫外光激发下，磷光供体产生的超长寿命磷光通过共振能量转移方式激发cdse/zns量子点受体，通过启用延迟100ns的时间门控采集策略，可完全滤除样品中短寿命的自发荧光背景，使背景抑制能力较传统稳态检测提升10倍以上，最终实现10-100pg/ml的高灵敏度检测，同时结合量子点多色编码与固相芯片空间编码的双重机制，天然支持多靶标并行检测，且固相芯片模式使供体材料可重复使用，将单次检测成本控制降低，检测时间缩短。

6、所述双正交蛋白自组装的树枝状聚合物信号载体以proteina（金黄色葡萄球菌a蛋白）作为主链骨架，在其5个结构域之间交替插入spytag003序列，使主链能够与任意携带spycatcher003的蛋白模块发生共价结合；主链末端进一步共表达snooptag，用于引入携带snoopcatcher的二级骨架链，从而实现载体的层级扩展。

7、所述cdse/zns核壳量子点尺寸为2.7-4.8nm。

8、所述双正交蛋白自组装的树枝状聚合物信号载体的尺寸为10-100nm。

9、所述zn-mof封装氮硼共掺杂碳点复合材料是以zn-mof为限域框架封装氮硼共掺杂碳点得到的磷光供体材料。

10、所述检测平台兼容标准酶标仪，检测灵敏度为10-100pg/ml，单次检测时间20-40min。

11、所述zn-mof封装氮硼共掺杂碳点复合材料的磷光寿命＞700ms，绝对量子产率＞50%；在pbs缓冲液中室温保存30天后磷光强度保留率＞90%。

12、本发明第二方面提供了一种多重生物分子检测平台的制备方法，包括以下步骤：

13、s1：通过靶标结构解析、可变位点定义、初始突变数据构建、多模型ai训练、序列设计与实验验证，获得darpin识别分子；

14、s2：分别表达纯化主链骨架、二级骨架链和终端功能单元，通过分步组装形成双正交蛋白自组装的树枝状聚合物信号载体；

15、s3：以硝酸锌六水合物、对苯二甲酸为mof前驱体，4-氨甲酰基苯硼酸与尿素为碳点前驱体，通过水热原位反应合成zn-mof封装氮硼共掺杂碳点复合材料；

16、s4：对石英基底进行活化处理，喷涂zn-mof封装氮硼共掺杂碳点复合材料沉积形成涂层，共价固定darpin识别分子，集成固相芯片；

17、s5：将cdse/zns核壳量子点与双正交蛋白自组装的树枝状聚合物信号载体偶联，得到检测探针。

18、所述darpin工程化识别分子制备单元采用单点突变扫描和随机多点突变构建初始训练数据集，通过线性基线模型与深度学习序列模型集成预测，生成候选darpin序列，经实验验证获得批次一致性变异系数＜15%的识别分子。

19、所述涂层采用喷涂法制备，厚度为5-20μm。

20、所述 darpin识别分子通过edc/nhs活化-酰胺化策略进行共价固定。

21、所述步骤s3中所述水热原位反应的条件为：反应温度180-220℃，反应时间4-8h；反应结束后经dmf与无水乙醇洗涤，真空低温干燥获得复合粉末。

22、所述步骤s4中所述石英基底活化处理包括：依次经丙酮、异丙醇超声清洗各15min，等离子体处理5-10min引入羟基；所述喷涂过程中控制喷枪口径0.3-1mm，工作气压0.2-0.3mpa，基底温度70-90℃，喷涂3-5次。

23、本发明第三方面提供了一种多重生物分子检测平台的使用方法，包括以下步骤：将待测样品与检测探针混合，使样品中的靶标分子与检测探针结合，并加入芯片池孵育，使靶标分子在固相芯片上形成三元复合物；去除未结合组分后，使用tr-fret检测系统进行检测，采集各检测位点的fret（福斯特共振能量转移）信号强度，通过数据分析获得靶标分子浓度。

24、所述检测系统参数设置为：以365nm光照射5-10s激发，延迟100-200ns开始采集fret信号，积分时间1.5-2.5s。

25、有益效果

26、1.本发明提供的多重生物分子tr-fret检测平台，具备检测灵敏度10-100pg/ml、动态范围3-4个数量级、单次检测时间20-40min、试剂成本15-25元/次且同时支持多靶标并行检测。

27、2.本发明双正交蛋白自组装的树枝状聚合物信号载体通过逐级自组装方式实现识别分子、蛋白支架与量子点信号单元的有序整合，从根本上解决了传统随机化学偶联方式中构型混乱、空间遮挡与信号衰减等问题。

28、3.本发明载体尺寸可在10-100 nm范围内精准调控，每个载体可稳定负载3-5个量子点信号单元，整体信号强度相比传统单点负载方式提升3-8倍，批次间信号变异系数控制在15%以内。

29、4.本发明darpin识别分子用于生成kd（解离常数）＜100nm、tm（熔解温度）＞70℃的靶标特异性darpin识别分子。

30、5.本发明cdse/zns核壳量子点通过调控量子点尺寸处于2.7-4.8nm，实现发射波长510-610nm的多色光谱编码，为不同检测靶标提供清晰可区分的光谱标识，解决了传统有机荧光染料多重检测中光谱重叠严重的核心缺陷。

31、6.本发明使用的zn-mof封装氮硼共掺杂碳点复合材料，具备磷光寿命超过700ms、量子产率高于50%的超长寿命磷光特性，在固相条件下仍能保持稳定强烈的信号输出，为时间门控背景抑制和高灵敏fret检测提供了可靠供体材料。

32、7.本发明检测平台可用于临床诊断（多靶标细胞因子检测、肿瘤标志物联合检测）、生物医学研究（蛋白互作高通量筛查、药物靶点验证）、体外诊断产品（ivd）开发以及基层医疗机构的快速多重筛查领域。