基于CeO2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台及其构建方法和检测方法

本发明属于纸基比色分析，涉及一种基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台及其构建方法和检测方法。

背景技术：

1、纸基比色分析技术是微流控分析技术的重要发展方向之一。纸基材料具有便携性好、成本低廉、来源广泛、易于加工和废弃处理、生物相容性好等特点，其独特的多孔结构和毛细驱动特性为开发新型便携式分析检测器件提供了重要的材料基础。基于纸基材料构建的比色检测平台操作简便、对仪器依赖度低、无需专业人员操作且易于实现现场快速检测，特别适用于便携式分析器件的开发，在环境监测、食品安全和生物医学检测等领域具有广阔的应用前景。

2、然而，现有纸基比色检测平台在实际应用中仍面临一些技术挑战，限制了其检测性能和进一步推广应用。首先，液体样品在纸基材料中的铺展与干燥过程易受毛细作用、溶质迁移和非均匀蒸发等因素的影响，导致显色区域出现颜色分布不均及边缘富集（咖啡环效应）等现象，从而影响图像采集质量及后续定量分析的准确性和重复性。其次，在以ceo2磷酸酶模拟酶为催化剂进行有机磷底物水解反应时，生成的显色产物为黄色的对硝基苯酚，而ceo2磷酸酶模拟酶本身亦呈黄色。当催化反应区与显色区未实现有效分离时，反应结束后残留于纸基表面的ceo2磷酸酶模拟酶会产生背景颜色干扰，与目标显色信号发生重叠，影响检测灵敏度和定量分析准确性。此外，在碱性检测条件下，ceo2磷酸酶模拟酶、显色产物对硝基苯酚及滤纸纤维表面均带负电荷，三者之间存在静电排斥作用，不利于ceo2磷酸酶模拟酶在纸基反应区的高效负载，同时也不利于显色产物在显色区的富集与均匀分布。因此，现有检测平台仍存在催化剂负载效率低、催化反应与显色检测过程难以有效分离等问题，导致检测灵敏度、准确性和重复性受到限制。亟需开发一种新型纸基比色检测平台，通过优化纸基界面性质和反应体系设计，提高ceo2磷酸酶模拟酶在纸基材料上的负载效率，实现催化反应区与显色检测区的有效分离，减少背景颜色干扰，改善显色均匀性，增强比色信号强度，从而提高检测结果的灵敏度、准确性和重复性，为有机磷化合物的快速、便携和可靠检测提供新的技术方案。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有纸基比色检测平台存在的催化剂负载量低、显色背景干扰大、显示均匀性差及检测结果准确性不足等问题，本发明提供了一种基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台及其构建方法和检测方法。该平台利用ceo2磷酸酶模拟酶催化有机磷底物水解生成显色产物，并结合催化反应区与显色区的有效分离及表面电荷调控，提高ceo2磷酸酶模拟酶的负载量，降低背景颜色干扰，改善显色均匀性，提高检测灵敏度和重复性，实现有机磷化合物的快速、可视化、定量检测。

2、基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台，其主体为一个可对折的基板，折线两侧分别设有反应功能区和显色功能区；

3、所述的反应功能区和显色功能区均为圆形凹槽，且相对于折线相互对称；所述的基板及圆形凹槽表面为防水材料；

4、所述的比色检测平台还包括：与圆形凹槽相应的显色功能区滤纸片和反应功能区滤纸片；

5、所述的功能滤纸片为基于ceo2磷酸酶模拟酶的比色检测法的显色功能区滤纸片和反应功能区滤纸片；

6、所述的圆形凹槽每侧至少一排圆形凹槽，直径为5～15 mm，深度为0.60～0.88mm。

7、所述的反应功能区滤纸片是由下述方法制备：

8、1）制备ceo2磷酸酶模拟酶：

9、将27 mm、ph为8.0～12.0的ce(no3)4水溶液，在65～95℃下微波反应1～40 min，离心，去离子水洗涤三次，分散于ph=10的水中，配制成浓度为0.5～2 mg/ml的ceo2悬浮液。

10、2）将直径为5～15 mm的圆形滤纸片依次浸入pdda、pss、pdda的水溶液中，再浸入步骤1）制备的ceo2悬浮液，每次浸渍20 min，其间以超纯水洗涤；重复该循环数次，干燥，即得反应功能区滤纸片；

11、所述的pdda为含0.2～5 wt% pdda的0.5 m nacl溶液； pss为含1 wt% pss的0.5m nacl溶液；

12、所述的显色功能区滤纸片是由下述方法制备：

13、将直径为5～15 mm的圆形滤纸片按pdda溶液→pss溶液→pdda溶液→pss溶液→pdda溶液的顺序进行循环层层自组装，干燥；

14、所述的pdda为含1 wt% pdda的0.5 m nacl溶液； pss为含1 wt% pss的0.5 mnacl溶液。

15、本发明另一个目的是提供基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台的制备方法，

16、基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台的制备方法，包括：

17、1）取4张滤纸对折，形成折线，用打孔器打孔；

18、2）另取2张完整滤纸对折，形成折线后平铺；

19、3）将步骤1）所述的4张打过孔的滤纸平铺在步骤2）完整滤纸的上方，折线两侧形成对称的圆形凹槽；

20、4）将步骤3）所述的6张滤纸整体浸入熔融蜡液中，取出后清除凹槽内残余蜡液 ，再次对折，干燥后平铺；

21、5）在折线一侧的圆形凹槽内放入显色功能区滤纸片，另一侧放入反应功能区滤纸片。

22、本发明又一个目的是提供基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台的检测方法

23、所述的基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台的检测方法，包括：

24、1）基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台平铺，在折线一侧的圆形凹槽内放入显色功能区滤纸片，另一侧放入反应功能区滤纸片；

25、2）将样品加入反应功能区反应；

26、3）反应结束后，反应功能区侧向上折叠，反应功能区与显色功能区连通，反应液进入显色功能区，显色稳定后；

27、4）打开，对显色功能区颜色分析。

28、本发明所述的基于ceo2磷酸酶模拟酶的纸基比色检测平台具有以下优点：

29、1）本发明设计了具有“增容-限域”功能的凹槽式纸基检测结构，提高比色检测信号强度及定量分析准确性。所述反应区凹槽可增大待测样品溶液的容纳体积，提高显色产物的生成总量；所述显色区凹槽可增大液体容纳空间，使迁移至显色区的显色产物在限定区域内富集，增强颜色信号强度，提高后续图像采集及定量分析的准确性。

30、2）本发明采用折叠式三维液相传质结构，提高纸基平台中的液体输运效率并改善显色均匀性。通过折叠纸基主体连通反应区与显色区，利用重力驱动与滤纸芯吸作用促进显色产物迁移，相较于传统二维纸基检测中依赖单一毛细驱动的传输方式，可降低液体扩散过程中产生的不均匀迁移和浓度梯度现象，提高检测结果的稳定性。

31、3）本发明利用聚电解质层层自组装法提高ceo2磷酸酶模拟酶在滤纸上的负载量。由于ceo2在碱性检测条件下表面带负电，与带负电的纤维纸基材静电排斥，不利于ceo2的负载。本发明利用pdda和pss对反应区滤纸进行静电自组装改性，使滤纸表面形成有利于ceo2吸附的聚电解质修饰层，提高ceo2纳米酶的有效负载量。

32、4）本发明构建了基于静电富集作用的显色增强体系，抑制咖啡环效应，提高显色区域颜色均匀性。由于ceo2催化有机磷产物在检测环境中带负电，为克服其与滤纸间的静电排斥，本发明通过对显色区滤纸进行聚电解质修饰，使其表面带正电荷，以增强显色产物在检测区域内的吸附与固定，减少干燥过程中显色产物的边缘富集现象（咖啡环效应），提高比色信号的一致性。

33、5）本发明提供了一种功能滤纸可更换设计，实现平台主体重复利用，降低使用成本。所述反应区与显色功能区滤纸片均采用可拆卸嵌装结构，检测完成后仅需更换新的功能滤纸，即可重复使用纸基检测平台主体，操作简便，有效降低了使用成本，提高了检测平台的实际应用价值。

34、6）本发明具有多通道扩展能力，可满足多目标检测及高通量分析需求。所述纸基主体可根据检测需求设置多个反应子区和显色子区，各子区独立装配相应的功能滤纸，支持多通道并行检测，提高平台的检测通量和应用范围。