一种PITC-HPLC柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法与流程

本发明涉及分析化学，具体涉及一种pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法。

背景技术：

1、丝素蛋白是从家蚕丝中提取的天然高分子蛋白，具有高效实现伤口止血，加速上皮细胞增殖与组织重塑，同时有效缓解局部炎症反应，为受损组织的修复愈合营造适宜的微环境，使其广泛应用与医用创面敷料领域。丝素蛋白作为医用敷料的核心有效成分，其含量直接决定产品的临床应用效果。目前，医用丝素蛋白产品中丝素蛋白含量的检测方法主要参考yy/t 1950-2024《组织工程医疗器械 丝素蛋白》中规定的凯氏定氮法，或《中国药典》四部通则0731蛋白质含量测定法中的比色方法，如双缩脲法，福林酚法等。凯氏定氮法通过测定样品总氮含量来推算蛋白质含量，试验过程操作简便，适用于配方中除丝素蛋白外，不含其他含氮物质的产品中的丝素蛋白含量的测定，然而，对于丝素蛋白医用敷料这类复杂基质制剂，其配方中常添加羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、卡波姆等高分子辅料，其中羧甲基壳聚糖、透明质酸钠结构中均含有氮元素，会干扰凯氏定氮法的测定结果，导致丝素蛋白含量测定结构偏高。无法反映样品中丝素蛋白的实际含量。比色法采用牛血清蛋白做为对照品，牛血清蛋白在结构上与丝素蛋白存在差异，会导致测定结构与实际结果存在偏差，虽然可以使用丝素蛋白原料作为对照品来克服这一不足，但是敷料中的其他敷料成分，如甘油，糖类也会干扰比色的结果的准确性。因此亟需一种能准确测定医用丝素蛋白中丝素蛋白含量的测定方法。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，旨在解决现有技术存在的缺陷：凯氏定氮法、比色法易受敷料中羧甲基壳聚糖、透明质酸钠等含氮辅料干扰，导致检测结果较真实值偏差大，比色法易受甘油、多元醇、缓冲盐、防腐剂等干扰，导致检测结果与真实值偏差大的问题，实现从含羧甲基壳聚糖、卡波姆、苯氧乙醇、甘油、透明质酸钠中的一种或多种的医用丝素蛋白中检测丝素蛋白含量。

2、为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：

3、一种pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，包括：

4、将医用丝素蛋白样品进行水解，所述医用丝素蛋白样品中包含羧甲基壳聚糖、卡波姆、苯氧乙醇、甘油、透明质酸钠中的一种或多种以及丝素蛋白；

5、将水解后的医用丝素蛋白样品进行pitc衍生；

6、采用高效液相色谱法测定pitc衍生后医用丝素蛋白样品中丙氨酸含量，换算得到丝素蛋白含量。

7、作为一种可实施方式，所述将医用丝素蛋白样品进行水解包括：将医用丝素蛋白样品置于6 mol/l盐酸体系中，110℃水解 24 h；水解液减压蒸干后，采用 0.1 mol/l 盐酸复溶定容，得到水解后的医用丝素蛋白样品，水解后的医用丝素蛋白样品中丝素蛋白浓度为 0.01~0.1 mg/ml。

8、作为一种可实施方式，所述将水解后的医用丝素蛋白样品进行pitc衍生包括：

9、取水解后的医用丝素蛋白样品，加入三乙胺乙腈溶液、异硫氰酸苯酯乙腈溶液混匀，室温衍生反应；加入正己烷萃取分层，取下层溶液作为pitc衍生后医用丝素蛋白样品。

10、作为一种可实施方式，所述三乙胺乙腈溶液的浓度为1mol/l，异硫氰酸苯酯乙腈溶液的浓度为0.1 mol/l，水解后的医用丝素蛋白样品与三乙胺乙腈溶液和异硫氰酸苯酯乙腈溶液的体积比为2:1:1；正己烷萃的加入量为水解后的医用丝素蛋白样品的4倍。

11、作为一种可实施方式，所述高效液相色谱法的色谱柱为waters xbridge shieldrp18，规格为5μm、4.6 mm×250 mm；流动相a为体积比为7:93的乙腈-0.1 mol/l醋酸钠溶液，ph为6.5；流动相b为体积比为80:20的乙腈-水；流速为1.0 ml/min，柱温为40 ℃，进样量为2μl。

12、作为一种可实施方式，所述高效液相色谱法的梯度洗脱程序为： 0～14 min，流动相a为100%至85%；14～29 min，流动相a为85%至66%；29～30 min，流动相a 为66%至0%；30～37 min，流动相a保持0%；37.1 min 切换为流动相a 为100%；37.1～45 min，流动相a保持100%。

13、作为一种可实施方式，所述医用丝素蛋白样品为丝素蛋白凝胶、丝素蛋白喷雾、丝素蛋白敷料贴中的至少一种。

14、作为一种可实施方式，所述高效液相色谱法的检测波长为254 nm，检测丙氨酸峰面积，以丙氨酸为特征氨基酸建立标准曲线，结合丝素蛋白原料确定的丙氨酸-丝素蛋白换算系数，计算得到样品中丝素蛋白含量。

15、作为一种可实施方式，所述方法的检测限为 0.4μg/g，定量限为 1μg/g。

16、本发明的有益效果在于：本方法选取丝素蛋白特征氨基酸丙氨酸作为定量指标，通过酸水解、pitc 柱前衍生结合高效液相色谱进行靶向检测，可有效规避样品中羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、甘油、糖类等含氮辅料及其他基质组分的干扰，从原理上解决了传统方法因辅料含氮、基质交叉反应导致检测结果偏高、偏差大的缺陷，测定结果能够真实反映医用敷料中丝素蛋白的实际含量。本方法检测限可达0.4 μg/g，定量限为1 μg/g，检出能力优异。本检测方法不受产品剂型限制，可应用于丝素蛋白凝胶、喷雾、敷料贴等不同类型医用丝素蛋白样品的含量检测。同时该检测思路可延伸应用至其他含蛋白质的医用制品、敷料的蛋白含量测定，拓展空间大。

1.一种pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，所述将医用丝素蛋白样品进行水解包括：将医用丝素蛋白样品置于6 mol/l盐酸体系中，110℃水解 24 h；水解液减压蒸干后，采用 0.1 mol/l 盐酸复溶定容，得到水解后的医用丝素蛋白样品，水解后的医用丝素蛋白样品中丝素蛋白浓度为 0.01~0.1 mg/ml。

3.根据权利要求2所述的pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，所述将水解后的医用丝素蛋白样品进行pitc衍生包括：

4.根据权利要求3所述的pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，所述三乙胺乙腈溶液的浓度为1mol/l，异硫氰酸苯酯乙腈溶液的浓度为0.1 mol/l，水解后的医用丝素蛋白样品与三乙胺乙腈溶液和异硫氰酸苯酯乙腈溶液的体积比为2:1:1；正己烷萃的加入量为水解后的医用丝素蛋白样品的4倍。

5.根据权利要求4所述的pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱柱为waters xbridge shield rp18，规格为5μm、4.6 mm×250mm；流动相a为体积比为7:93的乙腈-0.1 mol/l醋酸钠溶液，ph为6.5；流动相b为体积比为80:20的乙腈-水；流速为1.0 ml/min，柱温为40 ℃，进样量为2μl。

6.根据权利要求5所述的pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的梯度洗脱程序为： 0～14 min，流动相a为100%至85%；14～29 min，流动相a为85%至66%；29～30 min，流动相a 为66%至0%；30～37 min，流动相a保持0%；37.1min 切换为流动相a 为100%；37.1～45 min，流动相a保持100%。

7.根据权利要求6所述的pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，所述医用丝素蛋白样品为丝素蛋白凝胶、丝素蛋白喷雾、丝素蛋白敷料贴中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测波长为254 nm，检测丙氨酸峰面积，以丙氨酸为特征氨基酸建立标准曲线，结合丝素蛋白原料确定的丙氨酸-丝素蛋白换算系数，计算得到样品中丝素蛋白含量。

9.根据权利要求8所述的pitchplc柱前衍生法测定丝素蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法的检测限为 0.4μg/g，定量限为 1μg/g。