一种用于线粒体microRNA成像的纳米材料

本发明属于生物传感器，涉及一种检测线粒体mito mir-340的传感器构建。

背景技术：

1、线粒体作为细胞能量代谢与程序性死亡调控的核心枢纽，其功能异常与恶性肿瘤发生、发展及转移密切相关。mito mir通过调控线粒体基因组稳定性、oxphos及凋亡信号通路发挥致癌关键作用。由于线粒体膜屏障效应及其低丰度特性，mito mir的亚细胞定位原位检测始终面临技术瓶颈。因此，突破亚细胞器水平检测技术壁垒，通过设计线粒体靶向的纳米载体，能够成功实现活细胞mito mir的高时空分辨精准成像。当前研究热点转向亚细胞精度的诊疗，通过融合动态亚细胞成像技术与线粒体多模态靶向调控，着力突破tnbc异质性诊疗瓶颈。

技术实现思路

1、为了解决检测线粒体mito mir-340的亚细胞定位原位检测技术瓶颈的问题，本发明提出了高时空高分辨和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于荧光技术检测线粒体mitomir-340的传感器。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

3、一种用于线粒体microrna成像的纳米材料，简称为zm，为包裹smd探针的zif-90纳米颗粒；所述smd探针由sd1链、sd2链和substrate链杂交获得；

4、所述sd1链、sd2链和substrate链的核苷酸序列如seq id no:1-3所示，且sd1链的第12位核苷酸修饰荧光基团fam，sd2链的第17为核苷酸修饰荧光基团tamra，substrate链的第14位为核糖腺苷。

5、所述smd探针通过将等摩尔的sd1链、sd2链和substrate链在溶液中热变性后退火获得。

6、一种上述纳米材料的制备方法，包括以下步骤：将锌盐、2-甲醛-咪唑（2-ica）和smd探针在n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中混合，然后加入三辛胺（toa）至ph 6.0-7.0，搅拌反应后分离固体，即为纳米材料zm。

7、所述锌盐中锌离子和2-ica的摩尔比为1:2-4。

8、所述smd探针和锌盐中锌离子的摩尔比为1:100-200。

9、一种上述基于纳米材料zm制备的试剂盒。

10、上述的纳米材料zm试剂盒可用于检测线粒体microrna 340。

11、一种进行线粒体的成像方法，包括以下步骤：

12、将待测活细胞与所述纳米材料共孵育，然后进行荧光成像；

13、所述荧光成像通过检测fret效应实现，fret信号强度与线粒体microrna的含量正相关。

14、一种治疗肿瘤的药物，所述药物的有效成分为上述纳米材料。所述肿瘤细胞mir340过表达。

15、所述肿瘤为线粒体mitomir-340过表达的三阴性乳腺癌细胞，该类细胞同时具备线粒体atp浓度显著高于正常乳腺细胞、高表达葡萄糖转运蛋白glut1、线粒体膜电位偏负可靶向富集zif-90纳米材料的特征。

16、本发明的检测原理如图1所示，其中各核酸元件的序列如下：

17、substrate：

18、5’-tgc acc tca t/ra/g gcc tcg ct-3’；

19、sd 1：

20、5’-aat cag tct ca/i6famdt/cgg tcg aaaatg agg tgc a-3’；

21、sd 2：

22、5’-agc gag gcctcc gag c/itamradt/tt gct tta taa-3’；

23、含有上述核酸元件的材料，sd 1和sd 2的下划线部分分别和substrate的两端分别互补，形成smd；与zn2+和2-ica原位合成包裹smd探针的zif-90纳米颗粒（zm）；

24、上述纳米颗粒可发生如下反应：

25、在无靶标mito mir-340时，封装于zif-90内的smd探针中，sd1链上的fam基团与sd2链上的tamra基团距离较远，无法发生fret；当该传感器与细胞接触时，zif-90外壳在肿瘤微酸性环境（ph约6.5-6.8）中表面带正电荷，带正电的zm纳米颗粒，会与带负电的细胞膜通过静电吸附作用被细胞高效内吞，形成内体；随后，在溶酶体的强酸性环境（ph 4.5-5.0）中，zif-90框架发挥质子海绵效应，持续吸收质子导致溶酶体膜破裂，实现溶酶体逃逸；线粒体表面附近极高的atp会与zif-90中的zn2+竞争性结合，使得逃逸后的zm被动趋向并接触线粒体。当zm进入细胞并靶向至线粒体后，线粒体内高浓度的atp作为“引燃剂”与zif-90骨架中的zn2+竞争配位，导致zif-90解体，可控释放出smd探针；当体系中存在靶标mito mir-340时，smd探针中的sd1、sd2链与mito mir-340结合，使分裂的dnazyme在空间上相互靠近，同时使fam与tamra基团距离缩短，发生高效的荧光共振能量转移（fret）效应，现为供体fam的荧光猝灭、受体tamra的荧光信号增强，实现信号的“关-开”调控；

26、空间上靠近的dnazyme在zn2+辅助下，特异性识别并切割底物链substrate包含的核糖腺嘌呤位点（ra），ra位点发生断裂后，smd探针原有结构被破坏，荧光基团与淬灭基团空间距离显著增大，分子间荧光淬灭效应大幅解除，体系恢复并释放明显荧光信号；通过荧光信号强弱变化实现对mir-340的定性与定量检测；

27、substrate被切割后的释放aso1和aso2，靶向glut 1 mrna，从而完成对其rna干扰实现细胞凋亡，完成治疗过程。

28、在正常细胞中，组织胞外ph为7.3-7.4中性环境，zm质子化程度低、表面正电荷弱，与细胞膜静电吸附及内吞效率远低于ph 6.5-6.8弱酸性肿瘤微环境；其次正常细胞线粒体内atp浓度显著低于三阴性乳腺癌细胞，不足以竞争破坏zif-90配位骨架，smd探针无法释放，且正常乳腺细胞线粒体mitomir-340呈低表达状态，少量进入细胞的zm也无法启动fret信号变化、dnazyme剪切及后续治疗级联，因此zm可实现肿瘤细胞特异性靶向成像与干预治疗。

29、本发明具有以下优点：

30、本发明提供的生物传感器利用zif-90的线粒体靶向和atp响应特性，实现了对活细胞线粒体的精准定位和内源性刺激响应释放；利用dnazyme的靶标识别与自组装特性，实现了对mitomir-340的特异性识别；利用fret技术，实现了高信噪比的信号输出。该传感器具有操作简单、反应速度快、成像对比度高、特异性强等优点，可以弥补现有线粒体microrna成像方法的缺陷与不足，实现对其高时空分辨的精准成像。

1.一种用于线粒体microrna成像的纳米材料，其特征在于，纳米材料为包裹smd探针的zif-90纳米颗粒；所述smd探针由sd1链、sd2链和substrate链杂交获得；

2.一种如权利要求1所述的纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将锌盐、2-甲醛-咪唑和smd探针在n,n-二甲基甲酰胺中混合，然后加入三辛胺至ph 6.0-7.0，搅拌反应后分离固体，即为纳米材料。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述锌盐中锌离子和2-甲醛-咪唑的摩尔比为1:2-4；所述smd探针和锌盐中锌离子的摩尔比为1:100-200。

4.一种包含如权利要求1所述的纳米材料的试剂盒。

5.一种线粒体的成像方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测活细胞与权利要求1所述的纳米材料共孵育，然后进行荧光成像。

6.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物的有效成分为权利要求1所述的纳米材料。

7.根据权利要求6所述的治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述肿瘤细胞mir340过表达。

8.根据权利要求7所述的治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述肿瘤为三阴性乳腺癌细胞。