一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的HPLC分析方法与流程

本发明涉及药物分析，更具体地说，本发明涉及一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法。

背景技术：

1、曲伏前列素（travoprost）滴眼液是一种广泛用于治疗开角型青光眼和高眼压症的药物，其主要作用是通过增加眼内房水流出，从而有效降低眼压。作为一种需要长期使用的药品，确保其质量、安全性和稳定性至关重要。然而，在药品质量控制中，对曲伏前列素滴眼液中的杂质进行分析是一项技术难度较高的工作。

2、其挑战主要体现在两个方面。首先是包材浸出物的干扰问题。药品在储存和使用期间，其直接接触的包装材料（如塑料滴眼液瓶）中可能会有微量化学物质迁移到药液中，这些物质被称为“包材浸出物”。根据国家药品监管的要求，这些潜在的浸出物是必须进行严格监控的质量控制项目。在分析过程中，这些包材浸出物产生的色谱峰很容易与药物自身的降解产物（即有关物质）的色谱峰发生重叠或相互干扰，导致无法准确定量。此外，另一大挑战来自于药品自身，即曲伏前列素在生产或储存过程中可能产生多种结构相关的杂质，例如5,6-反式异构体和15-酮基衍生物等。其中，5,6-反式异构体作为曲伏前列素的一种空间异构体，两者的化学结构和极性都极为相似，这使得在色谱分离上将它们完全分开变得异常困难。

3、现有的曲伏前列素滴眼液杂质分析方法较复杂，例如美国药典采用不同的方法对其有关物质a和降解产物分别进行分析，无法对包材浸出物进行检测，并且不同批次色谱柱保留时间有差异；采用缓冲盐流动相及高流速，易损耗色谱柱，降低柱效。进口注册标准(jx20170195)采用超高压液相色谱（uplc），成本较高、不方便普及，供试品浓度不宜过大，浓度稍高，出现过载现象，导致主峰与相邻杂质峰之间分离度不符合规定。专利cn202110053317.1采用普通hplc法同时分离检测多种有关物质，但曲伏前列素主峰与5,6-反式异构体分离度并不高，且无法同时分析包材浸出物。

4、因此，目前需要建立一种更完善的分析方法。这种新方法应当能够同时对曲伏前列素滴眼液中的各类有关物质和包材浸出物进行检测。同时，该方法还应具备操作简便、稳定可靠、经济成本较低的优点，以全面改善现有分析方法的不足之处，更好地保障患者的用药安全。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其核心在于采用苯基-己基色谱柱，并配合使用ph3.5的磷酸盐缓冲液与乙腈作为流动相进行梯度洗脱。该特定组合利用色谱柱对不同化学结构杂质选择性的差异，并在特定酸性条件下调控各组分保留行为，显著提升分离度，从而实现对目标物的检测。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，采用高效液相色谱法同时检测曲伏前列素滴眼液中的有关物质和包材浸出物，所述方法包括以下步骤：

4、步骤s1，将样品进样至苯基-己基色谱柱；

5、步骤s2，采用流动相进行梯度洗脱分离，所述流动相由流动相a和流动相b组成，流动相a为磷酸盐缓冲液，流动相b为乙腈；

6、步骤s3，采用紫外检测器对分离后的各组分进行检测。

7、作为本发明进一步的方案，所述梯度洗脱包括分离程序、清洗程序和平衡程序，总时长为86分钟，包括：分离程序：0-65分钟，流动相a的比例为58-62%，流动相b的比例为42-38%；清洗程序：68-76分钟，流动相a的比例为28-32%，流动相b的比例为72-68%；平衡程序：77-86分钟，流动相a的比例为58-62%，流动相b的比例为42-38%。

8、作为本发明进一步的方案，所述有关物质包括5,6-反式异构体和15-酮基衍生物，所述包材浸出物包括四[β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸]季戊四醇酯和硫代二丙酸双十二醇酯，通过一次进样实现对曲伏前列素、5,6-反式异构体、15-酮基衍生物、四[β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸]季戊四醇酯和硫代二丙酸双十二醇酯的同时检测。

9、作为本发明进一步的方案，所述流动相a为0.1%的磷酸溶液，以1mol/l氢氧化钠调节ph值至3.5。

10、作为本发明进一步的方案，所述紫外检测器的检测波长为222nm。

11、作为本发明进一步的方案，所述色谱柱的柱温设置为35℃。

12、作为本发明进一步的方案，所述流动相的流速设置为0.6ml/min。

13、作为本发明进一步的方案，所述高效液相色谱法的进样量为100μl。

14、作为本发明进一步的方案，所述色谱柱的规格为150x3.0mm，填充剂粒径为3µm。

15、作为本发明进一步的方案，曲伏前列素与5,6-反式异构体的分离度大于1.0，15-酮基衍生物、四[β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸]季戊四醇酯、硫代二丙酸双十二醇酯之间的分离度均大于1.5。

16、与现有技术相比，本发明一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法的有益效果在于：

17、本发明通过采用苯基-己基色谱柱，并结合优化的流动相体系及梯度洗脱程序，将流动相a的ph值精确控制在3.5，并配合特定的梯度设置，解决了曲伏前列素与其极性相近的5,6-反式异构体难以分离的技术难题。相较于现有技术中同样采用hplc法但分离效果不佳的方案，本方法组合能够在使用常规、经济的色谱柱的条件下，实现对关键杂质的分离和定量，提高了方法的普适性和准确性。

18、本发明能够在一次分析中，同时对药物自身的有关物质及源于包装材料的浸出物进行有效分离检测。与现有技术相比，美国药典中的方法不仅需要采用不同方法分开检测有关物质，并且完全无法对包材浸出物进行检测。本方法可同时完成对所有目标物的全面监控，简化了质控流程，缩短了检测周期。

19、本发明基于普及率极高的普通高效液相色谱（hplc）平台，并设定了0.6ml/min的较低流速。对比需要昂贵且不易普及的超高压液相色谱（uplc）设备的进口注册标准，本方法降低了硬件门槛和运行成本。同时，相对于美国药典方法中易损耗色谱柱的高流速条件，本方法温和的流速设置有助于延长色谱柱这一关键耗材的使用寿命，进一步降低了长期分析成本。

1.一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，采用高效液相色谱法同时检测曲伏前列素滴眼液中的有关物质和包材浸出物，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括分离程序、清洗程序和平衡程序，总时长为86分钟，包括：分离程序：0-65分钟，流动相a的比例为58-62%，流动相b的比例为42-38%；清洗程序：68-76分钟，流动相a的比例为28-32%，流动相b的比例为72-68%；平衡程序：77-86分钟，流动相a的比例为58-62%，流动相b的比例为42-38%。

3.根据权利要求1所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，所述有关物质包括5,6-反式异构体和15-酮基衍生物，所述包材浸出物包括四[β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸]季戊四醇酯和硫代二丙酸双十二醇酯，通过一次进样实现对曲伏前列素、5,6-反式异构体、15-酮基衍生物、四[β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸]季戊四醇酯和硫代二丙酸双十二醇酯的同时检测。

4.根据权利要求1所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，所述流动相a为0.1%的磷酸溶液，以1mol/l氢氧化钠调节ph值至3.5。

5.根据权利要求1所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，所述紫外检测器的检测波长为222nm。

6.根据权利要求1所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温设置为35℃。

7.根据权利要求1所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，所述流动相的流速设置为0.6ml/min。

8.根据权利要求1所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的进样量为100μl。

9.根据权利要求1所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为150x3.0mm，填充剂粒径为3µm。

10.根据权利要求3所述的一种测定曲伏前列素滴眼液中杂质的hplc分析方法，其特征在于，曲伏前列素与5,6-反式异构体的分离度大于1.0，15-酮基衍生物、四[β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸]季戊四醇酯、硫代二丙酸双十二醇酯之间的分离度均大于1.5。