一种绞股蓝中皂苷类化合物的分离检测方法与流程

本发明涉及分析检测，尤其涉及一种绞股蓝中皂苷类化合物的分离检测方法。

背景技术：

1、中药材绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝（gynostemma pentaphyllum (thunb.)makino）的干燥全草，又名七叶胆、甘茶蔓、五叶参、公罗锅底，有南方人参和第二人参的美誉。《本草纲目》记载绞股蓝无毒，微甘、凉，归肺、脾、肾经，具有清热解毒、止咳清肺祛痰、养心安神、补气生精之功效。

2、皂苷类化合物是其绞股蓝中的主要有效化学成分，这些皂苷类化合物中的苷元部分基本都为达玛烷型四环三萜类，根据结构的不同，绞股蓝中的皂苷类化合物大致可分为人参皂苷和绞股蓝皂苷2大类，前者典型的代表化合物包括人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rb3和人参皂苷rd，后者主要包括绞股蓝皂苷a、绞股蓝皂苷xiii、绞股蓝皂苷xlix、绞股蓝皂苷 xlvi和绞股蓝皂苷xvii。现代药理研究表明，绞股蓝皂苷在抗肿瘤、神经保护、抗动脉粥样硬化、肝脏保护、肾脏以及心脏保护、治疗脓毒症、治疗骨代谢疾病、治疗视网膜病等方面药效显著。

3、随着绞股蓝相关健康产品的开发，亟需一种能够全面、准确检测绞股蓝中多种皂苷成分的方法，以满足原料筛选和产品质量控制的需求。

4、专利cn110231412b公开了一种绞股蓝中皂苷含量的检测方法，其中采用c18色谱柱，以乙腈-水体系作为梯度洗脱过程中的流动相，对绞股蓝提取液进行高效液相色谱检测，实现了绞股蓝中绞股蓝皂苷xlvi、绞股蓝皂苷lvi、人参皂苷rd和绞股蓝皂苷b的分离检测。该方法所能检测的成分较少，无法较为全面地反映绞股蓝中皂苷类化合物的情况。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，即现有的液相色谱方法只能实现绞股蓝中少数几种皂苷类化合物的同步检测，本发明提供了一种绞股蓝中皂苷类化合物的分离检测方法。采用本发明中的方法，能够实现绞股蓝中多种皂苷类化合物（包括人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3、人参皂苷rd、绞股蓝皂苷 xlix、绞股蓝皂苷 xlvi、绞股蓝皂苷a、绞股蓝皂苷xiii、长梗绞股蓝皂苷i和6''-o-乙酰基柴胡皂苷a）的同步检测。

2、本发明的具体技术方案为：

3、一种绞股蓝中皂苷类化合物的分离检测方法，步骤包括：对待测绞股蓝样品的提取液进行液相色谱检测得到色谱图，根据色谱图进行定性和/或定量分析；所述液相色谱检测的过程中，采用磷酸-磷酸二氢钾混合水溶液和乙腈作为流动相，按以下乙腈占比变化过程进行洗脱：第0min为22.5~23.5%v/v；渐变至第9.5~10.5min为29.5~30.5%v/v；渐变至第49.5~50.5min为33.5~34.5%v/v；渐变至第59.5~60.5min为41.5~42.5%v/v；渐变至第64.5~65.5min为66.5~67.5%v/v；渐变至第74.5~75.5min为92.5~93.5%v/v，维持至第84.5~85.0min；迅速变化至第85.1~85.3min为22.5~23.5%v/v，后续维持不变。

4、按照液相色谱中梯度洗脱程序的常规表示方式（下文各实施例和对比例中采用的均为这种表示方式），以上洗脱过程可表示如下：

5、

6、本发明在进行液相色谱检测的过程中，通过采用特定的流动相体系，并配合的洗脱程序，能够实现绞股蓝中多种皂苷类化合物的有效分离，同时能够避免杂质干扰，从而实现这些皂苷类化合物（包括以下11种皂苷类化合物：人参皂苷re，人参皂苷rb1，人参皂苷rb2，人参皂苷rb3，人参皂苷rd，绞股蓝皂苷 xlix，绞股蓝皂苷 xlvi，绞股蓝皂苷a，绞股蓝皂苷xiii，长梗绞股蓝皂苷i，6''-o-乙酰基柴胡皂苷a）的同步检测。

7、作为一种可选的实施方式，所述皂苷类化合物包括人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3、人参皂苷rd、绞股蓝皂苷 xlix、绞股蓝皂苷 xlvi、绞股蓝皂苷a、绞股蓝皂苷xiii、长梗绞股蓝皂苷i和6''-o-乙酰基柴胡皂苷a。

8、作为一种可选的实施方式，所述提取液的制备步骤包括：将粉碎的绞股蓝用三氯甲烷-甲烷混合液进行提取后，对所得药渣用乙醇-水饱和正丁醇混合液进行提取，滤过，取续滤液蒸干，将所得残渣溶于甲醇，滤过取续滤液，得绞股蓝提取液。

9、采用上述提取方法，能够从绞股蓝中有效提取出11种目标皂苷类化合物（人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3、人参皂苷rd、绞股蓝皂苷 xlix、绞股蓝皂苷 xlvi、绞股蓝皂苷a、绞股蓝皂苷xiii、长梗绞股蓝皂苷i和6''-o-乙酰基柴胡皂苷a），并实现较高的提取效率，为后续液相色谱检测中11种目标皂苷类化合物的同步检测提供基础。

10、作为一种可选的实施方式，所述三氯甲烷-甲烷混合液中，三氯甲烷与甲烷的体积比为8.5~9.5:1；所述乙醇-水饱和正丁醇混合液中，乙醇与水饱和正丁醇的体积比为1:2~3；粉碎的绞股蓝、三氯甲烷-甲烷混合液和乙醇-水饱和正丁醇混合液的质量体积比为1g:10~20ml:50~100ml。

11、作为一种可选的实施方式，用三氯甲烷-甲烷混合液进行提取的条件为：温度为60~70℃，时间为3~5h。

12、作为一种可选的实施方式，用乙醇-水饱和正丁醇混合液进行提取的条件为：采用超声提取法，功率为50~500w，频率为50~60khz，时间为0.2~2h。

13、作为一种可选的实施方式，所述磷酸-磷酸二氢钾混合水溶液中，磷酸浓度为0.01~0.5wt%，磷酸二氢钾浓度为3~8mmol/l，ph调节为2.0~2.5。

14、作为一种可选的实施方式，所述液相色谱检测的过程中，采用的色谱柱填充剂为agilent eclipse xdb-c18。

15、agilent eclipse xdb-c18具有以下特性：采用高密度键合c18链和双封端技术，能够有效屏蔽硅羟基活性位点，减少极性化合物（如皂苷）的次级相互作用（如氢键），从而降低拖尾并提高柱效；带有疏水性适中的极性嵌入基团，这种适度的疏水性可正好为本发明中的目标皂苷类化合物提供完美的平衡--足以保留其苷元部分，从而实现与其他极性杂质的分离，同时又不会因为保留过强而导致峰形拖尾或需要极高的有机相比例才能洗脱；对极性差异较小的化合物具有优异分辨能力。以上特性使agilent eclipse xdb-c18在与本发明中的流动相体系和洗脱程序配合后，能够实现绞股蓝中11种目标皂苷类化合物的有效分离，并避免杂质对检测的干扰。

16、作为一种可选的实施方式，所述液相色谱检测的过程中，检测波长为170~300nm，进样量为5~20µl，流速为0.5~3ml/min，柱温为15~45℃。

17、作为一种可选的实施方式，根据色谱图进行定性和/或定量分析的过程中：

18、定性分析为：依据各皂苷类化合物对照品在相同条件下的液相色谱检测结果，确定各皂苷类化合物对应的色谱峰保留时间，再根据待测绞股蓝样品测得设色谱图中色谱峰的保留时间，确定待测绞股蓝样品中所含皂苷类化合物种类；

19、定量分析为：依据各皂苷类化合物对照品在相同条件下的液相色谱检测结果，绘制各皂苷类化合物的浓度与色谱峰面积之间的线性关系曲线，再根据待测绞股蓝样品测得设色谱图中各皂苷类化合物的峰面积，确定相应皂苷类化合物的含量。

20、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

21、（1）本发明通过在液相色谱检测过程中，采用特定的流动相体系和洗脱程序，能够实现绞股蓝中11种目标皂苷类化合物的有效分离，并避免杂质对检测的干扰，从而实现11种目标皂苷类化合物的同步检测；

22、（2）本发明在制备待测绞股蓝样品的提取液时，依次采用三氯甲烷-甲烷混合液和乙醇-水饱和正丁醇混合液进行提取，能够实现绞股蓝中11种目标皂苷类化合物的高效提取，为后续液相色谱检测中这些目标皂苷类化合物的同步检测提供基础。