一种基于核磁共振靶向NAFLD的中草药筛选方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种利用核磁共振波谱技术检测细胞代谢物，进而筛选靶向非酒精性脂肪性肝病（nafld）有效中草药的方法。

背景技术：

1、非酒精性脂肪肝病（nafld）是一种以肝细胞脂肪变性及脂肪贮积为特征的病理综合征，全球患病率约为30%，并且随着生活方式的改变逐年上升，nafld已成为全球严重的公共卫生问题。nafld与肥胖、糖尿病、心脑血管疾病等多种代谢性疾病密切相关。nafld包括轻度肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（nash）、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。nafld生理表现为肝脏中脂质过度积累，临床上定义为肝脏甘油三酯含量超过肝脏总重量的5%。肝脏中脂质含量受脂质输送到肝脏和肝脏摄取、合成、氧化和分泌脂质之间复杂的相互作用调节。

2、在健康状态下，肝脏甘油三酯含量的60%来自脂肪组织脂解产生的游离脂肪酸，15-20%来自膳食脂肪酸，5-23%来自新生脂肪生成，其余来自其他途径，包括循环乳糜微粒和vldl颗粒。甘油三酯水平通过vldl颗粒的包装和分泌以及线粒体脂肪酸氧化而降低。高脂肪饮食、肥胖和胰岛素抵抗会导致肝脂质摄取增加和肝细胞内甘油三酯积累增加。在nafld患者肝脏中，线粒体氧化减少，脂肪分解、甘油三酯合成、新生脂肪生成和vldl分泌均增加从而导致甘油三酯水平异常升高。

3、目前针对nafld发展进程开发出多种抑制剂，大多数药物干预集中在脂肪酸合成途径、脂毒性和代谢应激、炎症和细胞凋亡以及纤维化上。大量药物处于不同的研究阶段，但由于临床实验表现为药效差、毒副作用大等原因，目前只有少数药物进入临床iii期实验，只有一种获批治疗中期肝纤维化的药物rezdiffra。所以寻找靶向nafld的药物新靶点并筛选作用于病程早期、疗效好、安全性高的抑制剂是当前临床和医药行业的热点问题。

4、现有的靶向脂质代谢药物筛选方法主要有两类，一类基于靶标的筛选，例如基于酶活/细胞活性的检测筛选方法，一类基于表型的筛选，例如对脂滴进行荧光成像。它们均有一定的优势，例如高通量、成本低、精确靶标，但是也有不足，例如假阳性多、动物/临床转化差。

5、在结构生物学技术中，核磁共振波谱（nmr）最适合获得关于配体与其靶标之间相互作用的原子级结构信息，更重要的是，nmr可以分析复杂和异质环境中的配体及大分子。此外，nmr无需分离样品可直接对细胞等复杂生物体系进行检测，是细胞水平药物筛选的强有力工具，同时有助于分析代谢通路，帮助明确靶标，提高药物筛选的效率。而细胞裂解物/提取物已用于接近天然条件下的nmr研究，为开发针对细胞靶标的更有效药物提供了潜在可能。

6、中药活性分子因其结构多样和靶点多样，是先导化合物的重要来源。多年来，中草药以多种形式被广泛应用于疾病治疗中。目前，调节脂肪酸代谢的中草药及其活性成分已被应用于治疗一些疾病，部分中草药已深入分子水平的实验研究和评价，但在应用方面仍基于临床经验，或局限于动物实验研究，尚缺乏临床试验依据。因此，在传承中医药理论基础上，筛选开发出临床上安全有效、机制明确的中草药作为nafld抑制剂，有望为nafld类疾病的治疗带来新突破。

技术实现思路

1、基于上述现有技术，本发明提供了一种基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，本发明利用核磁共振（nmr）技术检测细胞内脂肪酸代谢通路，建立了基于细胞体系的靶向nafld的中草药筛选技术。该技术以1-13c标记的棕榈酸作为示踪剂表征外源脂肪酸在肝细胞中的代谢过程，通过nmr对其代谢产物进行检测。以甘油三酯信号强度为指标评估中草药提取物对甘油三酯合成的抑制效果，建立了基于细胞体系的靶向nafld中草药筛选方法。

2、实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

3、一种基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，包括如下步骤：

4、s1、培养肝细胞，作为肝脂代谢模型；

5、s2、配制含同位素标记的脂肪酸的实验混合液；

6、s3、向肝脂代谢模型中加入实验混合液和待测中草药粗提物溶液，随后进行孵育，使肝细胞摄取并代谢所述同位素标记的脂肪酸；

7、s4、收集经过步骤s3处理的肝细胞，随后进行裂解处理，将获取的细胞裂解物作为实验样品；

8、s5、利用核磁共振技术检测实验样品中同位素标记的脂肪酸代谢产物，即同位素标记的甘油三酯的特征nmr信号并定量；

9、s6、向肝脂代谢模型中加入与实验混合液和待测中草药粗提物溶液等质量的提取待测中草药粗提物的溶剂，随后进行孵育，再按照步骤s4的方法进行处理，得到对照样品；

10、s7、将对照样品利用核磁共振技术进行检测，获取经同位素标记的甘油三酯的特征nmr信号并定量；

11、s8、将实验样品的同位素标记甘油三酯的特征nmr信号与对照样品的同位素标记甘油三酯的特征nmr信号进行比较，评估待测中草药粗提物对甘油三酯合成的抑制效果；

12、s9、若实验样品的同位素标记甘油三酯的特征nmr信号的信号强度显著低于对照样品的同位素标记甘油三酯的特征nmr信号，则待测中草药粗提物表现出对甘油三酯合成的抑制效果，将其鉴定为靶向nafld的有效中草药。

13、

14、进一步，所述的实验混合液需要加入牛血清白蛋白，示踪剂同位素标记的脂肪酸通过牛血清白蛋白递送至肝细胞。

15、进一步，所述同位素标记的脂肪酸为1-13c标记的棕榈酸。

16、进一步，所述的同位素标记的甘油三酯为1-13c标记的甘油三酯，在13c nmr谱图中，其特征nmr信号位于170-175 ppm区间内。

17、进一步，所述的1-13c标记的甘油三酯特征nmr信号位于172 ppm。

18、进一步，所述肝细胞为hepg2细胞。

19、进一步，所述中草药选自西洋参、甘草、葛根、三七或丹参。

20、进一步，所述的核磁共振技术包括1h nmr、13c nmr、1h-13c hsqc或1h-13c hmbc中的至少一种。

21、与现有技术相比，本发明的优点与有益效果在于：

22、1、本发明利用13c同位素标记，排除了内源性脂质干扰，特异性监测外源脂肪酸向甘油三酯的转化路径，该过程是nafld的关键病理环节，实现了外源脂肪酸高特异性代谢追踪。

23、2、本发明通过直接检测代谢终点（甘油三酯合成），能够大幅度降低基于靶点的筛选中出现假阳性的概率。

24、3、本发明基于nmr分析复杂和异质环境的能力使其适用于筛选抑制剂，包括来自中药粗提物等复杂来源的物质。

25、4、本发明通过对已知抑制剂的验证，证实此筛选方法具有可行性，并成功筛选出有效中草药。

26、5、本发明为药物筛选和代谢通路分析提供了一个强大的工具，有助于加速发现有效且安全的nafld抑制剂。

1.一种基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，其特征在于：所述的实验混合液需要加入牛血清白蛋白，示踪剂同位素标记的脂肪酸通过牛血清白蛋白递送至肝细胞。。

3.根据权利要求1所述的基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，其特征在于：所述同位素标记的脂肪酸为1-13c标记的棕榈酸。

4.根据权利要求1所述的基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，其特征在于：所述的同位素标记的甘油三酯为1-13c标记的甘油三酯，在13c nmr谱图中，其特征nmr信号位于170-175 ppm区间内。

5.根据权利要求4所述的基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，其特征在于：所述的1-13c标记的甘油三酯特征nmr信号位于172 ppm。

6.根据权利要求1所述的基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，其特征在于：所述肝细胞为hepg2细胞。

7.根据权利要求1所述的基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，其特征在于：所述中草药选自西洋参、甘草、葛根、三七或丹参。

8.根据权利要求1所述的基于核磁共振靶向nafld的中草药筛选方法，其特征在于：所述的核磁共振技术包括1h nmr、13c nmr、1h-13c hsqc或1h-13c hmbc中的至少一种。