检测抗脂质抗体的方法和装置与流程

本公开总体上涉及例如可用于检测抗脂质抗体和/或诊断疾病（如梅毒）的方法和免疫测定装置。

背景技术：

1、梅毒是一种由螺旋体细菌梅毒螺旋体（t. pallidum）引起的性传播疾病。梅毒中的免疫应答包括产生(i) 梅毒螺旋体抗体，和(ii) 抗脂质抗体。

2、抗脂质抗体检测（有时称为“非梅毒螺旋体检测”）通常基于天然存在的心磷脂、卵磷脂和胆固醇。梅毒螺旋体检测基于源自梅毒螺旋体的抗原，包括梅毒螺旋体颗粒凝集试验（tp-pa）、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（fta-abs）和免疫测定。非梅毒螺旋体检测被认为是监测治疗或检测再感染的更佳选择，因为抗脂质抗体滴度随着梅毒的治疗而降低，最终在大多数患者中消失，而梅毒螺旋体抗体滴度会保持高水平数年甚至终生。非梅毒螺旋体检测和梅毒螺旋体检测的组合可用于梅毒筛查和诊断目的。

3、仍然需要一种快速、即时检测的抗脂质抗体检测方法，并且长期以来，需要一种易于使用、快速、即时检测且能够同时检测非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体抗体的检测方法。

技术实现思路

1、本公开的发明人发现，由至少心磷脂和磷脂酰胆碱（也称为“卵磷脂”）构成的抗脂质抗原可以可靠地附着到固体基质（例如微孔膜）上，而无需使用介质如蛋白类载体，同时保持抗脂质抗原对抗脂质抗体的抗原性和特异性。本公开的发明人进一步发现，较高量的脂质抗原附着到固体基质上有助于保持抗脂质抗原对抗脂质抗体的抗原性和特异性。如本文所公开的侧向层析测定装置还能够检测来自梅毒感染受试者的指尖血中的抗脂质抗体，并满足用于梅毒poct检测的who目标产品概况。

2、因此，在一个方面，本公开提供了一种用于确定生物样品中抗脂质抗体的存在或量的侧向层析测定装置。此类装置包括具有抗脂质抗体捕获区的基质，所述抗脂质抗体捕获区包含脂质抗原，所述脂质抗原包含心磷脂和卵磷脂，并且所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分已经或基本上附着于所述基质上而并非经由蛋白类载体。

3、在另一个方面，本公开因此提供了一种用于确定生物样品中抗脂质抗体的存在或量的侧向层析测定装置，其包含具有抗脂质抗体捕获区的基质，其中所述抗脂质抗体捕获区包含脂质抗原，所述脂质抗原包含心磷脂和卵磷脂，所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分已经或基本上附着于所述基质上，并且所述抗脂质抗体捕获区每mm2所述抗脂质抗体捕获区包含至少约0.01 μg的心磷脂和/或至少约0.01 μg的卵磷脂。

4、在另一个方面，本公开提供了一种用于确定生物样品中抗脂质抗体的存在或量中的至少一者的侧向层析测定装置，其包含抗脂质抗体捕获区，所述抗脂质抗体捕获区包含心磷脂和卵磷脂，其中所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分已经或基本上附着于所述基质上而并非经由蛋白类载体，并且所述抗脂质抗体捕获区每mm2所述抗脂质抗体捕获区包含至少约0.01 μg的心磷脂和/或至少约0.01 μg的卵磷脂。

5、本文所述的装置可用于例如快速、现场检测非梅毒螺旋体抗体。在一些实施方案中，本文公开的侧向层析测定装置还包含梅毒螺旋体抗原，所述抗原被梅毒螺旋体抗体特异性识别，使得该装置能够方便且同时检测非梅毒螺旋体（即抗脂质）和梅毒螺旋体（即抗梅毒螺旋体）抗体。

6、从以下详细描述中，前述及其他特征和优点将变得更加明显。

7、详细描述

8、在一个方面，本文公开了免疫测定装置（例如侧向层析测定装置），其包含具有抗脂质抗体捕获区的基质，其中所述抗脂质抗体捕获区包含脂质抗原，所述脂质抗原包含心磷脂和卵磷脂，并且所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分已经或基本上附着于（例如基本上固定至）所述基质上而并非经由蛋白类载体或并非经由肽类（例如多肽）载体。在一些进一步的实施方案中，所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分已经或基本上附着于（例如基本上固定至）所述基质上而并非经由额外的化学部分如接头或锚定抗体。

9、在一些进一步的实施方案中，所述心磷脂和卵磷脂组分已经直接基本上附着于（例如基本上固定至）所述基质上，例如通过物理吸附（例如通过氢键、疏水相互作用和静电机制）。

10、在一些进一步的实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区可包含：(i) 每mm2所述抗脂质抗体捕获区至少约0.01 μg、至少约0.02 μg、至少约0.03 μg、至少约0.04 μg、至少约0.05 μg、至少约0.06 μg、至少约0.07 μg、至少约0.08 μg、至少约0.09 μg、至少约0.1 μg、至少约0.15 μg、至少约0.2 μg、至少约0.3 μg、至少约0.4 μg、至少约0.5 μg、至少约0.6 μg、至少约0.7 μg、至少约0.8 μg、至少约0.9 μg、至少约1 μg、约0.01至约1 μg、约0.02至约0.5 μg、约0.03至约0.25 μg、约0.04至约0.2 μg、约0.05至约0.15 μg、约0.06至约0.12 μg、或约0.08至约0.11 μg的心磷脂，和/或 (ii) 每mm2所述抗脂质抗体捕获区至少约0.01μg、至少约0.02 μg、至少约0.03 μg、至少约0.04 μg、至少约0.05 μg、至少约0.06 μg、至少约0.07 μg、至少约0.08 μg、至少约0.09 μg、至少约0.1 μg、至少约0.15 μg、至少约0.2 μg、至少约0.3 μg、至少约0.4 μg、至少约0.5 μg、至少约0.6 μg、至少约0.7 μg、至少约0.8μg、至少约0.9 μg、至少约1 μg、至少约1.5 μg、至少约2 μg、约0.01至约2 μg、约0.02至约1.5 μg、约0.03至约1 μg、约0.04至约0.8 μg、约0.05至约0.5 μg、约0.06至约0.4 μg、约0.07至约0.3 μg、约0.08至约0.2 μg、约0.09至约0.15 μg、或约0.1至约0.12 μg的卵磷脂。

11、在一些进一步的实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区中心磷脂和卵磷脂组分的重量比为约1:16至约8:1、约1:15至约7.5:1、约1:14至约7:1、约1:13至约6.5:1、约1:12至约6:1、约1:11至约5.5:1、约1:10至约5:1、约1:9至约4.5:1、约1:8至约4:1、约1:7至约3.5:1、约1:6至约3:1、约1:5至约2.5:1、约1:4至约2:1、约1:3至约1.5:1、或约1:2至约1:1。

12、在一些进一步的实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区每mm2所述抗脂质抗体捕获区可包含 (i) 至少约0.05 μg的心磷脂和 (ii) 至少约0.05 μg的卵磷脂，并且所述抗脂质抗体捕获区中心磷脂和卵磷脂组分的重量比为约1:12至约6:1，例如约1:10至约6:1、约1:8至约4:1、约1:6至约2:1、约1:4至约1:1、或约1:2。在一些进一步的实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区每mm2所述抗脂质抗体捕获区可包含 (i) 至少约0.06 μg的心磷脂和(ii) 至少约0.06 μg的卵磷脂（例如约0.06 μg至约0.5 μg的心磷脂和约0.06 μg至约1.5μg的卵磷脂、约0.08 μg至约0.4 μg的心磷脂和约0.1 μg至约1 μg的卵磷脂、约0.1 μg至约0.25 μg的心磷脂和约0.2 μg至约0.5 μg的卵磷脂、或约0.1 μg的心磷脂和约0.2 μg的卵磷脂），并且所述抗脂质抗体捕获区中心磷脂和卵磷脂组分的重量比为约1:8至约4:1、约1:4至约1:1、或约1:2。

13、在另一方面，本文公开了免疫测定装置（例如侧向层析测定装置），其包含具有抗脂质抗体捕获区的基质，其中所述抗脂质抗体捕获区包含脂质抗原，所述脂质抗原包含心磷脂和卵磷脂，并且所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分已经或基本上附着于（例如基本上固定至）所述基质上，并且所述抗脂质抗体捕获区每mm2所述抗脂质抗体捕获区包含至少约0.01 μg的心磷脂和/或至少约0.01 μg的卵磷脂。

14、在一些进一步的实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区可包含：(i) 每mm2所述抗脂质抗体捕获区至少约0.01 μg、至少约0.02 μg、至少约0.03 μg、至少约0.04 μg、至少约0.05 μg、至少约0.06 μg、至少约0.07 μg、至少约0.08 μg、至少约0.09 μg、至少约0.1 μg、至少约0.15 μg、至少约0.2 μg、至少约0.3 μg、至少约0.4 μg、至少约0.5 μg、至少约0.6 μg、至少约0.7 μg、至少约0.8 μg、至少约0.9 μg、至少约1 μg、约0.01至约1 μg、约0.02至约0.5 μg、约0.03至约0.25 μg、约0.04至约0.2 μg、约0.05至约0.15 μg、约0.06至约0.12 μg、或约0.08至约0.11 μg的心磷脂，和/或 (ii) 每mm2所述抗脂质抗体捕获区至少约0.01μg、至少约0.02 μg、至少约0.03 μg、至少约0.04 μg、至少约0.05 μg、至少约0.06 μg、至少约0.07 μg、至少约0.08 μg、至少约0.09 μg、至少约0.1 μg、至少约0.15 μg、至少约0.2 μg、至少约0.3 μg、至少约0.4 μg、至少约0.5 μg、至少约0.6 μg、至少约0.7 μg、至少约0.8μg、至少约0.9 μg、至少约1 μg、至少约1.5 μg、至少约2 μg、约0.01至约2 μg、约0.02至约1.5 μg、约0.03至约1 μg、约0.04至约0.8 μg、约0.05至约0.5 μg、约0.06至约0.4 μg、约0.07至约0.3 μg、约0.08至约0.2 μg、约0.09至约0.15 μg、或约0.1至约0.12 μg的卵磷脂。

15、在一些进一步的实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区中心磷脂和卵磷脂组分的重量比为约1:16至约8:1、约1:15至约7.5:1、约1:14至约7:1、约1:13至约6.5:1、约1:12至约6:1、约1:11至约5.5:1、约1:10至约5:1、约1:9至约4.5:1、约1:8至约4:1、约1:7至约3.5:1、约1:6至约3:1、约1:5至约2.5:1、约1:4至约2:1、约1:3至约1.5:1、或约1:2至约1:1。

16、在一些进一步的实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区每mm2所述抗脂质抗体捕获区可包含 (i) 至少约0.05 μg的心磷脂和 (ii) 至少约0.05 μg的卵磷脂，并且所述抗脂质抗体捕获区中心磷脂和卵磷脂组分的重量比为约1:12至约6:1，例如约1:10至约6:1、约1:8至约4:1、约1:6至约2:1、约1:4至约1:1、或约1:2。在一些进一步的实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区每mm2所述抗脂质抗体捕获区可包含 (i) 至少约0.06 μg的心磷脂和(ii) 至少约0.06 μg的卵磷脂（例如约0.06 μg至约0.5 μg的心磷脂和约0.06 μg至约1.5μg的卵磷脂、约0.08 μg至约0.4 μg的心磷脂和约0.1 μg至约1 μg的卵磷脂、约0.1 μg至约0.25 μg的心磷脂和约0.2 μg至约0.5 μg的卵磷脂、或约0.1 μg的心磷脂和约0.2 μg的卵磷脂），并且所述抗脂质抗体捕获区中心磷脂和卵磷脂组分的重量比为约1:8至约4:1、约1:4至约1:1、或约1:2。

17、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分未经受过化学修饰，例如，未经受过氧化或与另一部分（例如化学部分）缀合。在一些进一步的实施方案中，所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分是天然的或合成的。

18、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分通过将心磷脂和卵磷脂组分的醇溶液（例如乙醇溶液）施加（例如包被）到基质上然后干燥所述醇溶液，例如通过加热至高于室温的温度（例如最高37℃）干燥，而固定在基质上。

19、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述基质是微孔基质，例如微孔膜，如硝酸纤维素膜。

20、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述基质可包含硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯（pvdf）、聚碳酸酯、聚酯、聚醚砜、醋酸纤维素、混合纤维素酯、尼龙或其组合。

21、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述侧向层析测定装置还可包含样品施加区和从样品施加区到抗脂质抗体捕获区的流动路径。所述样品施加区与所述抗脂质捕获区处于流体连续接触，使得置于样品施加区中的流体样品可以流经或沿着基质（例如微孔膜）（例如通过毛细作用或层析流动）到达抗脂质抗体捕获区。

22、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述侧向层析测定装置还可包含梅毒螺旋体捕获区，其包含：(a) 能够被抗梅毒螺旋体抗体特异性结合的固定化梅毒螺旋体抗原，或 (b) 能够被可移动的梅毒螺旋体抗原特异性结合的固定化抗梅毒螺旋体抗体。在这些实施方案中，施加在样品施加区中的流体样品可以流经或沿着基质（例如微孔膜）到达抗脂质抗体捕获区和到达梅毒螺旋体捕获区。

23、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述抗脂质抗体捕获区可以是一条或多条测试线、点或其他形状的形式。在一些进一步的实施方案中，所述一条或多条测试线可具有约0.5 mm至约2 mm（例如1 mm或1.5 mm）的宽度和/或约2 mm至约6 mm（例如约3mm至约6 mm，或约3.5 mm至约5 mm）的长度。

24、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述基质可具有最高约20 μm，例如最高约15 μm、最高约12 μm、最高约10 μm、最高约8 μm、最高约6 μm、约0.01 μm至约12μm、约0.1 μm至约10 μm、约0.22 μm至约5 μm、或约1 μm至约2 μm的孔径。

25、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述侧向层析测定装置还可包含位于流动路径中的缀合物垫，其中所述缀合物垫包含特异性针对人抗体fc部分的可移动或可被移动的检测试剂。在一些实施方案中，所述检测试剂是经标记的蛋白a、fc特异性蛋白g或抗人抗体。在一些实施方案中，标记物是酶、胶体金颗粒、银颗粒、铁颗粒、铜颗粒、硒颗粒、硫颗粒、碲颗粒、碳颗粒、化学发光剂或荧光剂。在一些实施方案中，所述检测试剂包含金缀合的蛋白a、金缀合的fc特异性蛋白g或金缀合的fc特异性抗人抗体。

26、所述缀合物垫可包含针对抗脂质抗体的可移动或可被移动的检测试剂，使得液体流经垫子将检测试剂移动到抗脂质抗体捕获区。检测试剂、抗脂质抗体和固定化脂质抗原之间形成的复合物提供了生物样品中抗脂质抗体存在的可见或其他方式可检测的指示。在替代实施方案中，检测试剂不提供在缀合物垫中，而是施加到基质上。

27、在一些进一步的实施方案中，所述缀合物垫还包含特异性针对所述抗梅毒螺旋体抗体或所述可移动的梅毒螺旋体抗原的可移动或可被移动的检测试剂。在一些仍进一步的实施方案中，特异性针对抗梅毒螺旋体抗体的检测试剂包含金缀合的蛋白a、金缀合的fc特异性蛋白g或金缀合的fc特异性抗人抗体，或者用于可移动的梅毒螺旋体抗原的检测试剂包含金标记的抗梅毒螺旋体抗原抗体。

28、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，所述脂质抗原不包含胆固醇或不包含心磷脂和卵磷脂以外的磷脂。

29、在另一方面，本公开提供了一种用于确定生物样品中抗脂质抗体的存在或量中的至少一者的侧向层析测定装置，其包含：

30、微孔膜；

31、样品施加区；

32、抗脂质抗体捕获区，其包含脂质抗原，其中所述脂质抗原包含心磷脂和卵磷脂，并且所述脂质抗原的心磷脂和卵磷脂组分已经例如通过物理吸附直接固定在基质上，并且所述抗脂质抗体捕获区每mm2所述抗脂质抗体捕获区包含至少约0.05 μg的心磷脂和/或至少约0.05 μg的卵磷脂；和

33、从样品施加区到抗脂质抗体捕获区的流动路径；其中通过检测抗脂质抗体与固定化心磷脂和卵磷脂之间复合物的形成来确定生物样品中抗脂质抗体的存在或量。

34、在本公开的每一个和每个方面的一些实施方案中，固定化心磷脂和卵磷脂保持抗脂质抗原对抗脂质抗体的抗原性和/或特异性，例如针对来自梅毒感染受试者的生物样品中存在的抗脂质抗体。

35、在另一方面，本公开提供了一种包含本文公开的侧向层析测定装置的试剂盒。还公开了用于诊断梅毒的试剂盒。这些试剂盒可包括如本文所公开的装置以及用于将生物样品施加到样品施加区或装置的说明书。所述试剂盒还可包括用于解读测试结果的说明书。

36、在另一方面，本公开提供了一种用于检测受试者中抗脂质抗体的方法，其包括：将来自受试者的生物样品施加到如本文所公开的侧向层析测定装置或试剂盒上；以及检测生物样品中存在的抗脂质抗体与固定化心磷脂和卵磷脂之间复合物的形成，其中所述复合物的形成指示受试者中存在抗脂质抗体。

37、在一些实施方案中，检测抗脂质抗体用于诊断受试者的梅毒。

38、在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、皮肤溃疡渗出液、尿液、唾液、痰液、耳垢或脑脊液。在一些实施方案中，生物样品是全血、指尖血、血清或血浆。

39、在另一方面，本公开提供了一种用于诊断受试者中梅毒的方法，其包括：将生物样品施加到如本文所公开的侧向层析测定装置或试剂盒上；在抗脂质抗体捕获区中检测生物样品中存在的抗脂质抗体与固定化心磷脂和卵磷脂之间第一复合物的形成；以及在梅毒螺旋体捕获区中检测以下两者之间第二复合物的形成：(a) 生物样品中存在的抗梅毒螺旋体抗体与固定化梅毒螺旋体抗原，或 (b) 生物样品中存在的梅毒螺旋体抗原与固定化抗梅毒螺旋体抗体；其中检测到第一复合物和第二复合物的形成用于诊断受试者中的梅毒。在一些实施方案中，生物样品是人血液样品，例如全血或血清。

40、术语

41、除非另有说明，技术术语根据常规用法使用。

42、在本技术中，术语“约”用于表示某个值包括测量或定量方法的固有误差变异。

43、词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包容性或开放式的，不排除额外的、未列举的元素或方法步骤。

44、装置、试剂盒或其使用方法可以“包含”、“基本上由……组成”或“由……组成”本说明书全文公开的任何组件或步骤。“基本上由”任何公开的组件或步骤组成的装置、试剂盒和方法将权利要求的范围限制为不实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的指定材料或步骤。

45、如本文所用，术语“抗脂质抗体”可指具有针对脂质抗原的特异性的抗体（例如igm或igg或iga）。在某些情况下，抗脂质抗体是受试者（例如人）的免疫系统响应于疾病状态（例如微生物（例如细菌）感染）而产生的。例如，该术语涵盖人受试者中因梅毒螺旋体感染而产生的抗脂质抗体。

46、如本文所用，术语“捕获区”是指免疫测定装置（例如侧向层析装置）上固定有捕获试剂（例如包含心磷脂和卵磷脂的脂质抗原）的区域。免疫测定装置可以具有多于一个捕获区，例如“初级捕获区”、“二级捕获区”等，它们在基质上可以相对于彼此具有任何取向；例如彼此位于远端或近端，或者相互垂直。

47、如本文所用，术语“抗脂质抗体捕获区”是指其中固定有能够被抗脂质抗体特异性结合的脂质抗原（例如包含心磷脂和卵磷脂的脂质抗原）作为捕获试剂的捕获区。

48、如本文所用，术语“脂质抗原”是指包含（但不限于）心磷脂、卵磷脂和/或胆固醇的抗原，其能够被抗脂质抗体特异性结合，例如，如本公开所用的包含心磷脂和卵磷脂的抗原。

49、如本文所用，术语“微孔膜”是指具有微观尺寸孔洞的薄膜或结构。微孔膜至少允许流体及其中的分析物沿着或穿过膜移动，例如通过毛细作用。膜由多种材料或复合材料制成，包括例如硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纤维素、混合纤维素酯和/或聚偏二氟乙烯。非限制性的合适孔径可以是最高约0.22微米、约0.22微米至约0.45微米、约0.22微米至约0.65微米、约0.22微米至约0.8微米、约0.22微米至约1.2微米、约0.65微米至约3微米、约0.65微米至约5微米、约0.65微米至约8微米、约5微米至约10微米、或约5微米至约20微米。特定情况下，孔径可以是约0.22微米、约0.45微米、约0.65微米、约0.8微米、约1.2微米、约3微米、约5微米、约8微米、约10微米或约20微米。本领域普通技术人员认为适用于侧向层析装置的任何膜均涵盖在术语“微孔膜”的范围内。

50、如本文所用，术语“蛋白类载体”或“肽类载体”可指蛋白质或肽（例如多肽）性质的物质，其可以是天然的或合成的，并用作将脂质抗原（例如包含心磷脂和卵磷脂的抗原）附着到基质（例如微孔膜）上的介质，使得脂质抗原不直接附着于或固定在基质上。

51、除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。除非上下文明确指示，否则单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。下面描述了适用于所公开主题的实践或测试的合适方法和材料；然而，这些材料和方法仅是说明性的，并不意图是限制性的。也可以使用与本文描述的那些相似或等同的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入，在适用的规则允许的范围内。在冲突的情况下，以本说明书（包括术语解释）为准。

52、心磷脂

53、心磷脂是二磷脂酰甘油（具体为1,3-二磷脂酰甘油），其骨架由三个甘油分子通过两个磷酸二酯桥连接组成。心磷脂外部甘油部分的四个羟基各自用饱和或不饱和脂肪酸链（通常长度为14至18个碳）酯化。如本文所用，术语“心磷脂”涵盖具有任何脂肪酸侧链分布的1,3-二磷脂酰甘油。因此，心磷脂的四条脂肪酸侧链可以在长度（例如，约14至约25个碳、约14至约22个碳、约14至约20个碳、约14至约18个碳、或约14至约16个碳）和/或不饱和度（例如，从完全饱和到具有约6个双键、从完全饱和到具有约4个双键、或从完全饱和到具有约2个双键）上独立变化。如本文所设想的心磷脂的示例性脂肪酸侧链包括肉豆蔻酰基（14:0）；棕榈酰基（16:0）；硬脂酰基（18:0）；油酰基（18:1）；肉豆蔻烯酰基（14:1）；棕榈油酰基（16:1）；岩芹酰基（18:1）；亚油酰基（18:2）；亚麻酰基（18:3）；二十碳烯酰基（20:1）；花生四烯酰基（20:4）；芥酰基（22:1）；dha（22:6）；或神经酰基（24:1）。

54、在一些实施方案中，心磷脂是天然存在形式的心磷脂。天然存在的心磷脂的脂肪酸组成通常根据多种天然存在的脂肪酸如棕榈酰基（16:0）、硬脂酰基（18:0）、油酰基（18:1）和亚油酰基（18:2）分布。天然存在形式的心磷脂中最丰富的脂肪酸分子种类是亚油酸（90%），其次是油酸（5%）和棕榈酸（1%）。在其他实施方案中，心磷脂是非天然存在的形式（也称为“合成心磷脂”）。合成心磷脂的非限制性实例包括例如四肉豆蔻酰心磷脂、四油酰心磷脂、四肉豆蔻酰-双-(l-[α]-甘油基)磷酸、双(二棕榈酰 d,l-[α]-甘油基磷酰基)-1,3甘油苄基醚二钠盐、双(二棕榈酰 d,l-[α]-甘油基磷酰基)-1,5戊二醇二钠盐、双(二棕榈酰 d,l-[α]-甘油基磷酰基)-1,3丙二醇二钠盐、双(二棕榈酰 d,l-[α]-甘油基磷酰基)-1,4丁二醇二钠盐、双(二棕榈酰 d,l-[α]-甘油基磷酰基)-1,2乙二醇二钠盐、双(二棕榈酰 d,l-[α]-甘油基磷酰基)-甲二醇二钠盐、双(二棕榈酰 d,l-[α]-甘油基磷酰基)-1,3甘油二钠盐、双(苄基磷酰基)-1,3-丙二醇二钠盐、或d,l-[α]-二棕榈酰双磷脂酸。

55、卵磷脂

56、卵磷脂是磷脂酰胆碱的通用名称，它是一种甘油磷脂。如本文所用，术语“卵磷脂”涵盖具有任何脂肪酸侧链分布的磷脂酰胆碱。因此，心磷脂的两条脂肪酸侧链可以在长度（例如，约14至约25个碳、约14至约22个碳、约14至约20个碳、约14至约18个碳、或约14至约16个碳）和/或不饱和度（例如，从完全饱和到具有约6个双键、从完全饱和到具有约4个双键、或从完全饱和到具有约2个双键）上独立变化。如本文所设想的卵磷脂的示例性脂肪酸侧链包括肉豆蔻酰基（14:0）；棕榈酰基（16:0）；硬脂酰基（18:0）；油酰基（18:1）；肉豆蔻烯酰基（14:1）；棕榈油酰基（16:1）；岩芹酰基（18:1）；亚油酰基（18:2）；亚麻酰基（18:3）；二十碳烯酰基（20:1）；花生四烯酰基（20:4）；芥酰基（22:1）；dha（22:6）；或神经酰基（24:1）。

57、在一些实施方案中，卵磷脂是天然存在形式的卵磷脂。天然存在的卵磷脂的脂肪酸组成包括棕榈酰基（16:0）、棕榈油酰基（16:1）、亚油酰基（18:2）、硬脂酰基（18:0）、花生四烯酰基（20:4）、肉豆蔻酰基（14:0）、油酰基（18:1）和亚麻酰基（18:3）。天然存在的卵磷脂中脂肪酸的相对百分比因卵磷脂的来源而异。例如，据报道人胆囊胆汁中的卵磷脂约为45%16:0、4% 16:1、4% 18:0、16% 18:1、23% 18:2、4% 20:4，并含有痕量18:3和14:0；据报道人血浆中的卵磷脂约为35% 16:0、1% 16:1、14% 18:0、17% 18:1、17% 18:2、14% 20:4，并含有痕量18:3和14:0。在其他实施方案中，卵磷脂是非天然存在的形式（也称为“合成卵磷脂”）。

58、将脂质抗原固定到基质上

59、本文公开的固定脂质抗原的方法可用于任何基质，只要固定化心磷脂和卵磷脂在接触流体样品（如生物样品）时以基本上抵抗脱离的方式附着。所公开的免疫测定装置的优选固体支持物实施方案涉及微孔膜，例如硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯（pvdf）、聚醚砜、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纤维素、混合纤维素酯、尼龙或其组合。在一些实施方案中，脂质抗原基本上附着于或基本上固定在基质上，其中当基质与流体样品接触足够长的时间以使流体样品润湿基质（例如，足够长的时间以使流体样品沿着膜条迁移并接触附着或固定有包含心磷脂和卵磷脂的脂质抗原的区域）时，不超过约1%、不超过约2%、不超过约5%、不超过约10%或不超过约25%的附着或固定的心磷脂和卵磷脂从基质上脱离。

60、将包含心磷脂和卵磷脂的脂质抗原直接附着或固定到固体支持物如基质上，同时保持抗脂质抗原对抗脂质抗体的抗原性和特异性，可以通过物理吸附实现，例如通过离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。

61、可以选择合适的基质，因为其具有吸引和固定捕获试剂（例如包含心磷脂和卵磷脂的脂质抗原）的内在能力。或者，固相可以具有能够吸引和固定捕获试剂（例如包含心磷脂和卵磷脂的脂质抗原）的因素。该因素可以包括带电荷的物质，该物质与例如包含心磷脂和卵磷脂的脂质抗原带相反电荷。

62、除非受到物理限制，基质可以以任何合适的形状使用，例如薄膜、片材、条带或板，或者可以包被在或粘合或层压到适当的惰性载体上，例如纸、玻璃、塑料薄膜或织物。

63、侧向层析测定装置

64、侧向层析测定装置是本领域公知的。简而言之，侧向层析测定装置是一种分析装置，其核心是测试条，疑似含有目标分析物的测试样品流体通过该测试条流动。测试流体和任何悬浮的分析物可以沿着条带流动到检测区（例如捕获区），在检测区中分析物（如果存在）与捕获剂和检测剂相互作用以指示分析物的存在、不存在和/或量。

65、已经公开了许多侧向层析测定装置，包括美国专利号4,313,734；4,703,017；4,740,468；4,806,312；4,855,240；4,943,522；4,945,042；4,496,654；5,126,241；5,451,504；6,555,390；和6,368,876中所示的那些，每篇均通过引用并入。

66、侧向层析装置的结构和设计在本领域中是公知的，例如描述于schleicher&schuell, easy to work with bioscience, products and protocols 2003, pp. 73-98, 2003，其通过引用以其整体并入本文。

67、侧向层析装置具有多种物理形式，这些同样在本领域中是公知的。任何以适当功能关系支持和/或容纳侧向层析装置基本组件的物理形式都被本公开所涵盖。

68、特定实施方案的侧向层析装置的示例性基本组件可包括细长外壳，其容纳基本上延伸外壳整个长度的吸收性侧向层析条。侧向层析条分为位于样品引入口下方的近端样品施加垫、中间的测试结果膜和远端吸收垫。层析条被含有标记的缀合物（例如金缀合的蛋白a、金缀合的蛋白g、金缀合的抗人抗体）的缀合物垫中断。沿着层析条的流动路径从近端垫开始，穿过缀合物垫，进入测试结果膜，最终在吸收垫中被收集。选择性捕获剂（例如包含心磷脂和卵磷脂的脂质抗原）位于测试结果膜的近端测试线上。质控线设置在测试结果膜中，略位于测试线的远端。

69、样品垫是侧向层析装置的可选组件，用于最初接收样品，并且可以用于去除样品中的颗粒物。样品垫可以用一种或多种释放剂处理，例如缓冲液、盐、蛋白质、去污剂和表面活性剂。此类释放剂可用于例如促进缀合物垫组分的再溶解，以及封闭侧向层析装置其他组件（如硝酸纤维素膜）中的非特异性结合位点。

70、缀合物垫可用于除其他外容纳检测试剂。在一些实施方案中，检测试剂可以例如从显影剂瓶外部施加，在这种情况下侧向层析装置不需要包含缀合物垫。

71、包含在缀合物垫中的检测试剂在施加测试样品后释放到溶液中。缀合物垫可以用各种物质处理以影响检测试剂向溶液中的释放。例如，缀合物垫可以用pva或pvp（0.5%至2%）和/或triton x-100（0.5%）处理。

72、在侧向层析装置中使用吸收垫是可选的。吸收垫用于增加进入装置的样品的总体积。多种材料可用于制备吸收垫。在一些装置实施方案中，吸收垫可以是纸（即纤维素纤维）。本领域技术人员可以基于例如其厚度、可压缩性、可制造性和床体积均匀性来选择纸吸收垫。

73、试剂盒

74、本文公开了用于检测样品（例如生物样品）中抗脂质抗体的试剂盒。此类试剂盒也可用于例如诊断抗脂质抗体的存在是疾病症状的疾病（例如梅毒）。所公开试剂盒的某些实施方案通常是便携式的，并提供简单、快速和/或经济有效的方式来检测抗脂质抗体和/或诊断疾病（如梅毒），而无需实验室设施，例如在即时检测设施中。

75、示例性试剂盒可包括一种或多种如本文公开的免疫测定装置和载体手段，例如盒子、袋子或其他容器。在一些实例中，试剂盒组件将被封装在单个包装单元（例如盒子或其他容器）中，该包装单元可具有可以放置试剂盒的一个或多个组件的隔室。在其他实例中，试剂盒包括一个或多个容器，例如小瓶、管等，其可以容纳例如一种或多种待测试的生物样品、阳性和/或阴性对照样品或溶液（例如，含有抗脂质或梅毒螺旋体抗体的阳性对照血清），和/或稀释剂（例如磷酸盐缓冲液或盐水缓冲液）、检测试剂（例如，用于外部施加到试剂盒装置）。

76、在一些实施方案中，所公开的试剂盒可包括用于使用如本文所述的免疫测定装置的说明书。说明书可以提供关于如何将样品施加到测试装置、等待结果显现所需或建议的时间量以及如何阅读和解释测试结果的细节。此类说明书还可包括标准，例如用于比较测试结果的标准表格、图表或图片。这些标准可任选地包括使用测试装置量化分析物所需的信息，例如将信号强度或信号线数量与样品中存在的分析物量相关联的标准曲线。

77、实施例

78、包括以下实施例以说明某些特定的特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本发明限制于所描述的特定特征或实施方案。本领域技术人员根据本公开应当理解，可以在所公开的具体实施例中进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。

79、实施例1 侧向层析测定装置（lfa装置）的制备

80、仪器与材料

81、1. 仪器：xyz平台精密点样仪、可编程切条机、组装滚压机、恒温转筒烘干箱。

82、2. 材料：梅毒金标抗原tp96、梅毒金标抗原tp58、梅毒蛋白t1、牛心来源心磷脂溶液、蛋黄来源卵磷脂、小鼠抗人igg、绵羊抗鸡igy、鸡igy、抗rbc抗体。

83、3. 耗材：硝酸纤维素膜、玻璃纤维、聚酯膜、塑料卡壳、吸水纸、胶体金颗粒等。

84、制备过程

85、1. 梅毒金标抗原tp96的制备：用磷酸盐缓冲液将tp96抗原稀释至0.45mg/ml，备用。

86、2. 磷脂原料制备

87、1) 使用移液器吸取适量心磷脂溶液作为储备液a。

88、2) 称取适量卵磷脂固体原料，将其完全溶解于乙醇溶液中并混合均匀，制备卵磷脂溶液作为储备液b。

89、3) 使用乙醇溶剂，将心磷脂储备液a和卵磷脂储备液b按不同质量比混合，并充分混匀，制备磷脂混合抗原。

90、3. 绵羊抗鸡igy原料的制备

91、用磷酸盐缓冲液将绵羊抗鸡igy稀释至适当浓度，备用。绵羊抗鸡igy的浓度为1.5mg/ml。

92、4. 将步骤1和3制备的材料点样到硝酸纤维素膜上的相应位置，点样体积为1 μl/cm，条带宽度为0.35 cm。

93、1) c（质控）线位置：抗鸡igy原料，即在0.35 cm的c线上包被0.525 μg的抗鸡igy，单位面积包被量为0.15 μg/mm2。

94、2) nt（非梅毒螺旋体）线位置：磷脂（心磷脂和卵磷脂）混合抗原原料，包被在nt线位置的混合抗原（心磷脂和卵磷脂）的量如下表1所示：

95、表1

96、

97、5. 将包被好材料的硝酸纤维素膜置于37℃烘箱中干燥16-18小时。取出后存放在干燥环境中（温度15-25℃；湿度≤40%）。

98、6. 胶体金标记

99、6.1 梅毒蛋白t1和梅毒抗原tp58的标记

100、1) 取10 ml 0.04%胶体金（4 od/ml），在搅拌下加入120 µl 0.2m k2co3，搅拌5分钟后加入100 µg t1蛋白，继续搅拌5分钟，加入100 µl 10% bsa（水溶液）终止，缓慢搅拌5分钟；

101、2) 将步骤1)所得混合物在10,000 rpm下离心10分钟，收集沉淀，用金标稀释液复溶至1 ml（40 od/ml），然后加入5 μg tp58，混匀放置30分钟，将所得混合物记录为t1-tp58-au（40 od/ml）；

102、3) 使用前用金标复溶液将t1-tp58-au稀释至6 od/ml，将稀释后的t1-tp58-au喷涂在聚酯膜上，干燥16-18小时，将喷涂后的膜置于干燥环境（温度15-25℃；湿度≤40%）中保存，备用。

103、6.2 小鼠抗人igg和鸡igy的标记

104、1) 分别取两份10 ml 0.04%胶体金（4 od/ml），分别在搅拌下加入120 µl 0.2mk2co3，搅拌5分钟，然后分别加入100 µg小鼠抗人igg和鸡igy，继续搅拌5分钟，加入100 µl10% bsa（水溶液）终止，缓慢搅拌5分钟；

105、2) 将步骤1)所得混合物在10,000 rpm下离心10分钟，收集沉淀，用金标稀释液复溶至1 ml（40 od/ml），混匀放置30分钟，将所得混合物分别记录为小鼠抗人igg-au（40 od/ml）和鸡igy-au（40 od/ml）。

106、3) 使用前用金标复溶液将小鼠抗人igg-au（40 od/ml）和鸡igy-au（40 od/ml）稀释至6 od/ml，将稀释后的抗人igg-au（40 od/ml）和鸡igy-au（40 od/ml）分别喷涂在聚酯膜上，干燥16-18小时，将喷涂后的膜置于干燥环境（温度15-25℃；湿度≤40%）中保存，备用。

107、7. 切条、组装，由制备好的硝酸纤维素膜、玻璃纤维、聚酯膜等制备检测试纸条。

108、实施例2 人血清中抗脂质抗体的检测

109、1. 将实施例1制备的lfa装置平衡至室温，取出测试卡平放在水平实验台上，分别测试空白缓冲液、阴性临床样品和梅毒患者阳性样品。

110、2. 加入10μl人血清样品，随后加入60μl缓冲液，等待15-20分钟，读取测试卡上线条的颜色强度，与标准比色卡比较，并记录实验结果。

111、3. 使用实施例1制备的lfa装置检测阴、阳性样品和空白缓冲液，相应的颜色强度结果如表2所示。

112、表2：颜色强度结果

113、

114、注：标准比色卡的评分范围（等级）为g1至g10，其中g1至g10值表示相应红色条带（测试线）显色强度递增。当评分

115、2. 实验结果

116、本实施例证明，通过使用具有抗脂质抗原（包含心磷脂和卵磷脂，且固定到基质上而不使用蛋白类或肽类载体）的侧向层析测定装置，可以检测梅毒血清中的抗脂质抗体。

117、实施例3. 同时检测非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体抗体的临床性能评估

118、为了评估同时检测非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体抗体的临床性能，使用实施例1中制备的lfa装置（1 mg/ml心磷脂和1 mg/ml卵磷脂，即心磷脂/卵磷脂浓度 = 1:1）、以及商品化trust试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）和商品化tppa试剂盒（珠海丽珠试剂股份有限公司），检测了120份患者血清样品（每份20μl）中的抗梅毒螺旋体和抗非梅毒螺旋体（抗脂质）抗体。

119、在lfa装置测试中，遵循上述实施例2的步骤检测样品，并记录非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体抗体测试结果。

120、传统的trust和tppa测试根据制造商提供的使用说明书进行。

121、lfa装置与tppa和trust检测方法在120名患者群体中测试的性能特征如下表3所示。

122、表3.

123、

124、从表3可以看出，lfa装置检测抗梅毒螺旋体抗体的灵敏度为98.4%，特异性为100%，而lfa装置在1:1、1:2、1:4和1:8不同滴度下检测抗非梅毒螺旋体（抗脂质）抗体的灵敏度分别为91.8%、97.7%、100%和100%，特异性为97.2%。

125、实施例4. 指尖血中同时检测非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体抗体的临床性能评估

126、先前的血清学检测使用从患者抽取的静脉血，需要患者前往医疗机构。然而，许多患者由于对性传播感染的隐私顾虑和所涉及的繁琐程序而不愿寻求医疗护理，导致梅毒检测延迟或错过机会。为了促进梅毒筛查，本研究旨在评估本公开的lfa装置在检测指尖血中梅毒螺旋体和非梅毒螺旋体抗体的临床性能。该研究将评估指尖血检测的有效性，为家庭梅毒自检提供临床证据。

127、使用实施例1中制备的lfa装置（1 mg/ml心磷脂和1 mg/ml卵磷脂，即心磷脂/卵磷脂浓度 = 1:1）、以及商品化梅毒快速血浆反应素（rpr）试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）和商品化tppa试剂盒（珠海丽珠试剂股份有限公司），检测了89份指尖血样品（每份40μl）中的抗梅毒螺旋体和抗非梅毒螺旋体（抗脂质）抗体。

128、在lfa装置测试中，遵循上述实施例2的步骤检测样品，并记录非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体抗体测试结果。

129、传统的rpr和tppa测试根据制造商提供的使用说明书进行。

130、lfa装置与tppa和rpr检测方法的性能特征如下表4所示。

131、表4.

132、

133、从表4可以看出，lfa装置检测抗梅毒螺旋体抗体的灵敏度为98.08%，特异性为97.30%，而lfa装置在1:1、1:2、1:4和1:8不同滴度下检测抗非梅毒螺旋体（抗脂质）抗体的灵敏度分别为97.37%、100%、100%和100%，特异性为96.08%。

134、实施例5. 储存稳定性

135、将实施例1制备的lfa装置（1 mg/ml心磷脂和1 mg/ml卵磷脂，即心磷脂/卵磷脂浓度 = 1:1）在45℃下进行加速稳定性测试95天。对阴性血清样品、nt弱阳性血清样品、tp弱阳性血清样品以及nt/tp中阳性血清样品进行了测试。结果表明，与第0天相比，加速前后c/t/n线的颜色强度变化在一个色度等级范围内。据此估计，lfa装置可在2-35℃下储存，保质期至少为18个月。

136、实施例6. 高滴度样品检测验证和钩状效应评估

137、本实施例旨在证明本公开的lfa装置能够准确检测滴度为1:128的临床样品，并确认在显著更高浓度下不会发生高剂量钩状效应，确保结果可靠性。

138、按照实施例3的测定方法，使用lfa装置检测了滴度为1:128的梅毒患者血清样品中的抗梅毒螺旋体和抗非梅毒螺旋体（抗脂质）抗体。结果显示，抗梅毒螺旋体和抗非梅毒螺旋体（抗脂质）抗体的测试线清晰可见，颜色强度评分>g8。

139、结果表明，lfa装置能有效检测滴度为1:128的临床样品，产生强阳性信号，颜色强度大于g8。此外，没有信号衰减表明lfa装置在测试滴度范围内是稳健的，没有高剂量钩状效应，确保了高滴度梅毒病例中的准确检测。

140、与用于梅毒poct检测试剂盒的who目标产品概况的比较

141、上述实施例中的结果已证明，本公开的lfa装置满足所有who poct目标产品概况，如下表5所示：

142、表5

143、

144、本技术中提到的所有文件均通过引用以其整体并入本文。此外，应当理解，本领域技术人员可以在所附权利要求的范围内作出各种修改和改变。