尿液样本中环境新污染物的非靶向高分辨筛查方法

本发明属于分析检测，具体涉及尿液样本中环境新污染物的非靶向高分辨筛查方法。

背景技术：

1、近年来，非靶向分析因为不受分析物信息和参考标准品有无的限制，成为生物分析、药物分析、食品分析及环境分析中越来越重要的手段。

2、环境新污染物的筛查主要依赖于液质或气质高分辨技术，该类技术具有灵敏度高、分辨率高，以及快速实现未知污染物定性筛查的优势。然而，人群样本基质极其复杂，含有大量蛋白质、氨基酸、碳水化合物等内源性物质，且环境新污染物在人体基质中含量极低，多为pg/ml-ng/ml级别。此外，人群样本的基质干扰现象易导致检测过程中出现假阳性结果，大幅降低谱库匹配的置信度，限制污染物筛查效能。因此，人体基质的前处理优化是环境新污染物筛查的关键环节，以实现环境污染物的分离、富集与基质净化，最大程度消除基质干扰，提升检测灵敏度和准确性等。

3、传统液液萃取多采用单一溶剂或简单混合溶剂，无法兼顾不同极性范围的（如极性、弱极性以及非极性）环境新污染物的全面萃取需求，会导致部分新型污染物萃取不完全，筛查覆盖面有限；固相萃取技术虽能提升基质净化效果，但设备成本高、操作繁琐，批量处理效率低，且对某些痕量环境新污染物的富集效果有限，不适合大范围高通量筛查；固相微萃取、分散液液微萃取等微萃取技术虽能减少溶剂用量、缓解乳化问题，但重现性差、富集倍数不足，难以满足人体基质样本中痕量新污染物的高灵敏度筛查需求；化学标记技术虽能提升检测灵敏度，但试剂昂贵、操作复杂，不适用于常规实验室高通量筛查。

4、针对人体基质环境新污染物筛查中前处理与联用检测的技术痛点，传统萃取结合高分辨筛查技术是现有技术的解决方案之一，该方案是目前应用最广泛的基础筛查方案，核心流程为：样品经冷藏离心去除沉淀后，调节ph值、加入盐析剂，采用固相小柱或单一溶剂（如正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯）或简单混合溶剂进行净化提取，浓缩后采用液质高分辨或气质高分辨技术进行筛查。该方法虽然操作简便、成本低廉，能实现批量样品处理，适用于常规实验室基础筛查；但单一溶剂无法兼顾不同极性环境新污染物的萃取需求，筛查覆盖面有限。

技术实现思路

1、针对现有人体样本基质中环境新污染物筛查覆盖面有限以及基质效应显著等技术痛点，本发明的核心目的是提供一种优化前处理技术的人体基质环境新污染物液质高分辨筛查技术，适配常规实验室高通量筛查需求，实现人体基质中痕量环境新污染物的高效、准确筛查，为环境新污染物人体暴露监测、健康风险评估提供可靠技术支撑。

2、尿液中环境新污染物的非靶向高分辨筛查方法，包括以下步骤：对尿液进行前处理后得到待测样，使用超高效液相色谱系统对待测样进行筛查；

3、所述前处理的步骤为：向尿液样本中加入内标物和β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，并在ph为4~5的条件下于36℃~38℃下孵育过夜，待样品冷却至22℃~25℃后，加入萃取溶液进行提取，提取后离心，取上清得到提取液，并重复此提取步骤三次，将三次得到的提取液混合并用氮气吹干至干燥状态，于甲醇中复溶得到待测样；

4、所述萃取溶液由乙酸乙酯与甲基叔丁基醚按5：1的体积比组成；

5、所述尿液样本与萃取溶液的体积比为1：2.5~3.5；

6、所述内标物是以吡虫啉-d4、三氯生-d3、双酚s-13c12、全氟辛烷磺酸-13c4和磷酸三苯酯-d15复配的混合内标物。

7、本发明的前处理流程适配全极性环境新污染物萃取，用乙酸乙酯与甲基叔丁基醚能同时高效萃取和定性样品中包括羟基/磺酸/羧酸基团丰富的酚类衍生物等强极性物质、尼泊金酯类物质为代表的中极性物质以及有机磷阻燃剂等弱极性有机污染物。

8、以吡虫啉-d4、三氯生-d3、双酚s-13c12、全氟辛烷磺酸-13c4、磷酸三苯酯-d15这五类具有不同结构、不同理化性质且为典型环境新污染物同位素标记物开展回收率考察，可全面验证本发明酶解预处理、复合溶剂萃取及全前处理工艺对农药类、抗菌剂类、双酚类、全氟类、有机磷酸酯类主流新型污染物的提取适用性与稳定性。

9、优选的，尿液样本、混合内标物、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶体积比为1ml：50μl：10μl。

10、优选的，所述超高相液相色谱系统中，色谱柱为acquity beh c18，色谱柱的填料‌颗粒粒径为1.7μm，色谱柱的‌内径×长度为2.1mm×100 mm。

11、优选的，所述超高相液相色谱系统中，流动相a为含5 mm乙酸铵的水-甲醇溶液，流动相b为含5 mm乙酸铵的甲醇-水溶液，流速为0.25 ml/min，进样量为10μl，总时间为19分钟。

12、优选的，所述超高相液相色谱系统中，色谱条件：溶剂梯度从10% b开始，1分钟内增加至40% b，5分钟内增加至90% b，5.1分钟内达到100% b，保持8.4分钟，0.1分钟内恢复至初始状态，再保持5.4分钟。

13、优选的，所述超高相液相色谱系统中，质谱仪以正离子和负离子模式运行，采用数据依赖式采集。

14、优选的，所述超高相液相色谱系统中，质谱参数如下：鞘气流量为35；辅助气流量为10，扫气流量为1；蒸发器温度为400℃；喷雾电压为3300/2000；离子传输管温度为352℃；扫描设置为90000/12000的分辨率；hcd冲击能量为30、50和70；一级质谱的扫描范围为50-1000 m/z；ddms2隔离窗口为0.7 m/z；扫描次数为10。

15、优选的，所述环境新污染物包括极性环境污染物和非挥发性环境污染物。

16、优选的，所述尿液为人体尿液。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、1、本发明的萃取溶剂体系解决传统前处理方法中易发生乳化、萃取效率低以及重现性差的技术问题，实现萃取过程分层快速，提升萃取效率和重现性，前处理体系对样品的萃取效率、重现性、基质净化效果均得到显著提升，且相较于传统尿液样本大剂量、多轮次有机溶剂萃取的常规前处理方法溶剂用量大幅减少，兼顾环保性与经济性。前处理流程适配全极性环境新污染物萃取，无需分批次处理，操作简便。基质净化步骤结合高分辨联用技术参数优化，降低样品基质效应，减少假阳性结果，提升未知环境新污染物的定性准确性。能同时高效萃取和定性样品中包括羟基/磺酸/羧酸基团丰富的酚类衍生物等强极性物质、尼泊金酯类物质为代表的中极性物质以及有机磷阻燃剂等弱极性有机污染物。

19、2、本发明样品基质效应显著降低，提升尿样样本中未知新型污染物的结构解析与定性识别水平。筛查覆盖面广，可检测样品各类极性环境新污染物，适用场景包括环境监测、流行病学调查、人体健康风险评估等。

20、3、实用性强，易于推广：设备要求低，与现有常规实验室的液质高分辨仪器适配，无需新增设备。操作简便、试剂成本低廉、操作人员易上手，批量处理效率高，适用于各级环境监测机构、科研院所的常规筛查，推广难度低。

21、4、稳定性与可靠性高：优化后的流程标准化程度高，平行样品检测的重现性好（rsd≤5%），检测结果稳定可靠，能满足环境监测、科研等领域对检测数据准确性的严格要求。