用于辅助伴有糖尿病CKD分期的代谢标志物组合及应用、方法与流程

本发明属于疾病分期鉴别，具体涉及一种用于辅助伴有糖尿病ckd分期的代谢标志物组合及应用、方法，也即用于伴有糖尿病ckd分期鉴别的代谢标志物组合及其应用、模型构建方法。

背景技术：

1、慢性肾脏病（chronic kidney disease, ckd）是一种以肾功能逐渐丧失为特征的慢性进展性疾病，约占比全球10%的人口，近年来由于糖尿病、高血压等代谢性疾病持续攀升其发病率不断增高，且早期ckd具有典型的隐匿性，容易出现低的早诊率，有发展为终末期肾病的风险。目前临床上对ckd的诊断与分期主要依赖于血清肌酐（scr）、尿白蛋白/肌酐比（acr）、估算肾小球滤过率（egfr）、肾活检等方式，然而这些指标在早期诊断ckd分型及鉴别分期方面，存在敏感性较低的不足，肾活检作为病理诊断的金标准，有创的操作，无法作为常规筛查的普适性手段。

2、代谢紊乱是ckd发生发展过程的典型病理生理特征之一，反映机体在废物排泄、能量稳态和内分泌功能等方面的系统性改变。氨基酸、糖、脂肪酸等是人体内的常见代谢产物，广泛存在于人的血液、尿液等体液中。在代谢分析平台方面，传统的液相-色谱质谱和核磁共振技术需要繁琐的色谱分离、长的预处理时间和复杂的波谱分析，而基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（maldi-tof ms）作为一种软电离生物质谱技术，其具有样品制备简单、分析速度快和检测灵敏度高等优势。近年来纳米增强的maldi-tof ms技术通过结构优势选择性捕获复杂生物样本中的小分子代谢物，获得高通量的代谢指纹图谱，为传统代谢分析提供强有力的替代方案。因此采用增强的maldi-tof ms技术分析ckd的血清和尿液样本，建立高效能的分型诊断和分期鉴别的代谢标志物组合具有重要潜力。

3、然而，目前还没有针对ckd血清和尿液双流体代谢指纹图谱的报道，因此，基于纳米增强的maldi-tof ms技术构建ckd的分型诊断及分期鉴别模型，筛选双流体样本生物代谢物组合，推动临床ckd的精准分型和分期，最终达到提高ckd早诊率的目的。

4、需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本发明的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种用于辅助伴有糖尿病ckd分期的代谢标志物组合及应用、方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

2、第一方面，本发明提供了一种用于辅助伴有糖尿病ckd分期的代谢标志物组合，所述代谢标志物组合包括第一代谢物组合、第二代谢物组合和第三代谢物组合；

3、所述第一代谢物组合包含血清代谢物二十碳五烯酸乙酯、十四碳烯肉碱、胆绿素和尿液代谢物胍基琥珀酸盐、石松碱、3-棕榈酰-sn-甘油，用于伴有糖尿病ckd 1-2期与伴有糖尿病ckd 3-4期的辅助分期；

4、所述第二代谢物组合包含血清代谢物吲哚乳酸、乙酰肉碱、l-色氨酸和尿液代谢物l-亮氨酸、胍基琥珀酸盐、石松碱、l-辛酰基肉碱，用于伴有糖尿病ckd 1-2期与伴有糖尿病ckd 5期的辅助分期；

5、所述第三代谢物组合包含血清代谢物乙酰肉碱、正丁基苯磺酰胺和尿液代谢物l-亮氨酸、5-羟基吲哚-3-乙酸、橙皮素，用于伴有糖尿病ckd 3-4期与伴有糖尿病ckd 5期的辅助分期。

6、第二方面，本发明提供了一种检测上述代谢标志物组合的试剂在制备辅助伴有糖尿病ckd分期的试剂盒中的应用。

7、第三方面，本发明提供了一种用于辅助伴有糖尿病ckd分期的模型构建方法，包括以下步骤：

8、s1、获取伴有糖尿病ckd 1-2期、伴有糖尿病ckd 3-4期和伴有糖尿病ckd 5期的离体血清样本和尿液样本；

9、s2、采用多维碳基复合材料增强基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对各个所述血清样本和尿液样本进行检测，获得血清代谢指纹图谱峰和尿液代谢指纹图谱峰；

10、s3、采用maldiquant包对所述血清代谢指纹图谱峰和所述尿液代谢指纹图谱峰进行基线矫正、峰提取、谱线平滑和归一化预处理，获得每个血清样本对应的

m/z特征的血清代谢图谱集和每个尿液样本对应的

m/z特征的尿液代谢图谱集；

11、s4、基于所述血清代谢图谱集和所述尿液代谢图谱集，筛选上述代谢标志物组合；

12、s5、基于所述代谢标志物组合，采用机器学习算法，分别构建用于伴有糖尿病ckd1-2期和伴有糖尿病ckd 3-4期的第一分期鉴别模型，用于伴有糖尿病ckd 1-2期和伴有糖尿病ckd 5期的第二分期鉴别模型，及用于伴有糖尿病ckd 3-4期和伴有糖尿病ckd 5期的第三分期鉴别模型。

13、在本发明的一个实施例中，步骤s2包括：

14、获取多维碳基复合材料，并将所述多维碳基复合材料溶解于乙醇溶液中，获得基质溶液；

15、将所述基质溶液滴加至靶板上，干燥后添加血清样本或尿液样本，再次干燥后形成共结晶层；

16、在正离子模式下，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，分别获得血清代谢指纹图谱峰和尿液代谢指纹图谱峰。

17、在本发明的一个实施例中，所述多维碳基复合材料为一维碳纳米管、二维石墨烯和三维碳纳米球中的一种。

18、在本发明的一个实施例中，步骤s4包括：对所述血清代谢图谱集和所述尿液代谢图谱集中的

m/z特征进行t检验，按照

p <0.05且score>0.7，筛选所述代谢标志物组合；

19、其中，筛选所述代谢标志物组合包括：分别筛选用于伴有糖尿病ckd 1-2期与伴有糖尿病ckd 3-4期的辅助分期的第一代谢物组合，用于伴有糖尿病ckd 1-2期与伴有糖尿病ckd 5期的辅助分期的第二代谢物组合，用于伴有糖尿病ckd 3-4期与伴有糖尿病ckd 5期的辅助分期的第三代谢物组合；

20、所述第一代谢物组合包括第一血清代谢物组和第一尿液代谢物组；所述第一血清代谢物组包括二十碳五烯酸乙酯、十四碳烯肉碱、胆绿素，所述第一尿液代谢物组包括胍基琥珀酸盐、石松碱、3-棕榈酰-sn-甘油；

21、所述第二代谢物组合包括第二血清代谢物组和第二尿液代谢物组；所述第二血清代谢物组包括吲哚乳酸、乙酰肉碱、l-色氨酸，所述第二尿液代谢物组包括l-亮氨酸、胍基琥珀酸盐、石松碱、l-辛酰基肉碱；

22、所述第三代谢物组合包括第三血清代谢物组和第三尿液代谢物组；所述第三血清代谢物组包括乙酰肉碱、正丁基苯磺酰胺，所述第三尿液代谢物组包括l-亮氨酸、5-羟基吲哚-3-乙酸、橙皮素。

23、在本发明的一个实施例中，步骤s5中，所述第一分期鉴别模型的构建过程包括：

24、获取第一数据集，所述第一数据集为伴有糖尿病ckd 1-2期样本和伴有糖尿病ckd3-4期样本，在所述第一血清代谢物组和第一尿液代谢物组中代谢物标志物

m/z处的质谱响应信号强度；将第一数据集中的75%～85%作为第一训练集，剩余作为第一验证集；

25、基于所述第一训练集，采用lasso回归机器学习构建第一分期鉴别模型，采用第一验证集对第一分期鉴别模型进行验证。

26、在本发明的一个实施例中，步骤s5中，所述第二分期鉴别模型的构建过程包括：

27、获取第二数据集，所述第二数据集为伴有糖尿病ckd 1-2期样本和伴有糖尿病ckd5期样本，在所述第二血清代谢物组和第二尿液代谢物组中代谢物标志物

m/z处的质谱响应信号强度；将所述第二数据集中的75%～85%作为第二训练集，剩余作为第二验证集；

28、基于所述第二训练集，采用lasso回归机器学习构建第二分期鉴别模型，采用第二验证集对第二分期鉴别模型进行验证。

29、在本发明的一个实施例中，步骤s5中，所述第三分期鉴别模型的构建过程包括：

30、获取第三数据集，所述第三数据集为伴有糖尿病ckd 3-4期样本和伴有糖尿病ckd5期样本，在所述第三血清代谢物组和第三尿液代谢物组中代谢物标志物

m/z处的质谱响应信号强度；将所述第三数据集中的75%～85%作为第三训练集，剩余作为第三验证集；

31、基于所述第三训练集，采用lasso回归机器学习构建第三分期鉴别模型，采用第三验证集对第三分期鉴别模型进行验证。

32、与现有技术相比，本发明的有益效果有：

33、1、本发明通过多维碳基复合材料增强maldi-tof ms技术获取ckd合并糖尿病患者的血清和尿液代谢指纹图谱，筛选伴有糖尿病ckd 1-2期和伴有糖尿病ckd 3-4期、伴有糖尿病ckd 1-2期和伴有糖尿病ckd 5期、伴有糖尿病ckd 3-4期和伴有糖尿病ckd 5期的代谢标志物组合，采用lasso回归机器学习方法在训练集进行模型训练并在测试集中验证，获得分期鉴别模型。

34、2、本发明采用lasso回归算法构建的ckd分型诊断模型auc值达到1.00。另外，本发明进一步构建血清和尿液双流体代谢标志物组合鉴别ckd合并糖尿病分期的auc值（最低auc = 0.736，最高auc = 1.00）高于单独血清（最低auc = 0.43，最高auc = 0.97）或单独尿液（最低auc = 0.63，最高auc = 0.97），为实现临床ckd的精准分型诊断及分期鉴别提供可靠的技术方案。

35、3、本发明以多维碳基复合材料作为新型maldi-tof ms的无机纳米基质，该材料具有不同维度的曲率结构和丰富的c、o、n杂原子，具有强的内建电场和光热转化效率，在正离子模式下，可高效离子化氨基酸、葡萄糖等代谢标准品，实现对血清和尿液中代谢物的高通量（每芯片384个样本）、快速（20 s/样本）分析。

36、以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。