同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法与流程

本发明涉及化学分析，具体涉及一种同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法。

背景技术：

1、复方氨基酸注射液是临床上广泛使用的肠外营养药物，其中含有色氨酸、苯丙氨酸等9~20种成分。在氨基酸的生产、储存过程中，色氨酸和苯丙氨酸易发生氧化、高温降解等反应，产生多种相关杂质。色氨酸的已知杂质主要包括5-羟色胺、2-羟基色氨酸、5-羟基色氨酸、3-苯基氨基丙氨酸、二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、甲酰犬尿氨酸，共七种，此外还可能存在其他未知杂质；苯丙氨酸的主要杂质为苯乙胺。

2、上述杂质若超过《ichq3b（r2）：新药制剂中的杂质》中规定的界定阈值，可能具有一定的毒性，从而影响药品的安全性和有效性。因此，需要对氨基酸注射液中的相关杂质进行检测和控制。

3、目前，为了同时测定复方氨基酸注射液中多个杂质，大多是采用高效液相-质谱联用（lc-ms）进行测定，主要是因为复方氨基酸注射液的组分通常由9~20种成分构成，基质非常复杂，且氨基酸本身的结构决定了大部分组分无紫外吸收，其降解产物亦无吸收，导致采用常规的分析仪器如hplc、uv或时差检测器无法满足检测要求。然而，lc-ms虽然具有较高的灵敏度和较好的选择性，但仪器设备昂贵、运行成本高、方法开发复杂，不适合作为常规质量控制方法。

4、高效液相色谱法作为一种常用的杂质检测方法，在复方氨基酸注射液的杂质检测中已有应用，但是，当前通过高效液相色谱法对复方氨基酸注射液中的杂质进行检测时，大多是针对某一种或类似的几种杂质进行检测。对于复方氨基酸注射液中色氨酸和苯丙氨酸的相关杂质，现有的高效液相色谱法难以对这些杂质进行同时测定。

5、有鉴于此，有必要基于高效液相色谱法，开发一种简便、经济、准确且能够同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法。

技术实现思路

1、鉴于背景技术中存在的技术问题，本申请提供了一种同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，通过开发新的流动相体系，采用多波长检测策略，并针对共出峰的杂质建立波长校正法，简便、经济、准确地实现了对复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的同时测定。

2、本申请实施例提供了一种同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，包括如下步骤：

3、取待测的复方氨基酸注射液，加水稀释并定容，得到供试品溶液；

4、取色氨酸对照品，加水溶解并定量稀释，得到对照品溶液；

5、取杂质对照品贮备液，加水定量稀释，得到混合对照品溶液；所述杂质对照品贮备液中，含有甲酰犬尿氨酸、5-羟色胺、2-羟基色氨酸、5-羟基色氨酸、3-苯基氨基丙氨酸、二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、苯乙胺；

6、将所述供试品溶液、所述对照品溶液和所述混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中进行检测，记录色谱图，并计算各杂质的含量；

7、其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件包括：

8、以甲酸铵缓冲液-甲醇为流动相a，以乙腈-流动相a作为流动相b，进行梯度洗脱。

9、在一些实施例中，所述高效液相色谱仪的色谱条件还包括：

10、以dad作为检测器，检测波长包括210nm、250nm、270nm、324nm。

11、在一些实施例中，当检测波长为250nm时，所述混合对照品溶液的色谱图中，二氧吲哚丙氨酸存在两个色谱峰，甲酰犬尿氨酸和2-羟基色氨酸共出峰，相邻的色谱峰的分离度不低于1.5。

12、在一些实施例中，采用外标法，以峰面积计算所述各杂质的含量；

13、各杂质中，2-羟基色氨酸的峰面积采用波长校正法进行计算。

14、在一些实施例中，所述2-羟基色氨酸的峰面积的计算公式如下：

15、

16、式中，ac，250nm表示检测波长为250nm时，2-羟基色氨酸的峰面积；aa+c,250nm表示检测波长为250nm时，2-羟基色氨酸与甲酰犬尿氨酸的共洗脱峰的峰面积；aa，324nm表示检测波长为324nm时，甲酰犬尿氨酸的峰面积；f为波长校正因子，取值范围为2.60~2.65。

17、在一些实施例中，所述甲酸铵缓冲液包括甲酸铵溶液和ph调节剂；

18、所述甲酸铵缓冲液的ph值为3.1~4.5；

19、所述甲酸铵溶液中甲酸铵的浓度为18~22mmol/l；

20、所述ph调节剂包括磷酸、盐酸、甲酸中的一种。

21、在一些实施例中，所述流动相a中，所述甲酸铵缓冲液与所述甲醇的体积比为96:4~98:2；所述流动相b中，所述乙腈与所述流动相a的体积比为25:75~35:65。

22、在一些实施例中，所述梯度洗脱采用如下表所示的线性梯度进行洗脱：

23、

24、上表中，时间由上至下依次递加；同一时间下，所述流动相a与所述流动相b之和为100%。

25、在一些实施例中，所述高效液相色谱仪的色谱条件还包括：

26、采用c18色谱柱或效能相当的色谱柱；

27、柱温为38~52℃；

28、进样盘温度为3~10℃；

29、进样体积为10~50μl；

30、洗脱流速为0.9~1.1ml/min。

31、在一些实施例中，所述对照品溶液中，所述色氨酸的浓度为5μg/ml；

32、所述混合对照品溶液中，甲酰犬尿氨酸、5-羟色胺、2-羟基色氨酸、5-羟基色氨酸、3-苯基氨基丙氨酸、二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸的浓度为2μg/ml，苯乙胺的浓度为1μg/ml。

33、本申请的有益效果包括：

34、本申请提供的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，通过开发新的流动相体系，在保证各杂质良好分离的同时，具有更好的峰形和更低的背景干扰；在此基础上，本申请根据各杂质的紫外吸收特性，设置了四个检测波长，能够对复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质进行全面检测；并且，针对共出峰的杂质，本申请建立了波长校正法，有效解决了共出峰条件下难以对不同杂质进行定量测定的技术问题，提高了测定结果的可靠性。

35、通过上述方式，本申请实现了同一hplc方法中对复方氨基酸注射液中色氨酸的七种已知杂质（5-羟色胺、2-羟基色氨酸、5-羟基色氨酸、3-苯基氨基丙氨酸、二氧吲哚丙氨酸、犬尿氨酸、甲酰犬尿氨酸）、色氨酸的未知杂质以及苯丙氨酸的杂质苯乙胺的同时测定，且本申请提供的方法对仪器设备的要求较低、运行成本较低、灵敏度高、不易受干扰，能够适用于各种含有色氨酸、苯丙氨酸的复方氨基酸注射液，具有较好的实际应用前景。

36、上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了能够更清楚了解本申请的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本申请的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本申请的具体实施方式。

1.一种同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的色谱条件还包括：

3.根据权利要求2所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，当检测波长为250nm时，所述混合对照品溶液的色谱图中，二氧吲哚丙氨酸存在两个色谱峰，甲酰犬尿氨酸和2-羟基色氨酸共出峰，相邻的色谱峰的分离度不低于1.5。

4.根据权利要求3所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，采用外标法，以峰面积计算所述各杂质的含量；

5.根据权利要求4所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，所述2-羟基色氨酸的峰面积的计算公式如下：

6.根据权利要求1所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，所述甲酸铵缓冲液包括甲酸铵溶液和ph调节剂；

7.根据权利要求1所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，所述流动相a中，所述甲酸铵缓冲液与所述甲醇的体积比为96:4~98:2；所述流动相b中，所述乙腈与所述流动相a的体积比为25:75~35:65。

8.根据权利要求1所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，所述梯度洗脱采用如下表所示的线性梯度进行洗脱：

9.根据权利要求1所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的色谱条件还包括：

10.根据权利要求1所述的同时测定复方氨基酸注射液中色氨酸、苯丙氨酸相关杂质的方法，其特征在于，所述对照品溶液中，所述色氨酸的浓度为5μg/ml；