一种食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的检测方法与流程

本发明属于食品分析，具体涉及一种食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的检测方法。

背景技术：

1、随着食品产业多元化发展，功能性食品、代餐食品、养生预制食品品类持续扩充，部分商家为追求产品功效、口感及保质期优势，违规添加各类功能性糖苷、糖类物质，导致食品质量安全隐患频发。巴豆苷、阿卡波糖、乳果糖是三类理化性质、功能特性差异显著的糖类及糖苷类物质，均可通过非法添加或原料残留存在于各类食品中，过量摄入会对人体消化系统、代谢系统造成不同程度损伤，因此，实现食品中三种物质的精准、同步检测，是把控食品质量安全、保障公众饮食健康的关键。

2、巴豆苷是巴豆中核心活性及毒性成分，属于吲哚类糖苷化合物，具备较强的药理毒性。我国明确禁止将巴豆及巴豆苷添加至普通食品中，但目前部分养生食品、草本代餐、祛湿养生茶饮等小众食品中，存在违规添加巴豆提取物以宣称“排毒、减脂”功效的乱象。人体过量摄入巴豆苷后，会强烈刺激胃肠道黏膜，引发剧烈腹痛、腹泻、呕吐等急性肠胃反应，长期微量摄入还会损伤肠道菌群平衡，影响肝肾功能代谢，严重危害人体健康。

3、阿卡波糖是临床常用的降糖药物，属于α-葡萄糖苷酶抑制剂，仅适用于糖尿病患者临床治疗，严禁作为食品添加剂使用。近年来，多款宣称“无糖降糖、减脂控重”的网红食品、代餐饼干、冲调饮品中，多次检出非法添加阿卡波糖的情况。普通人群无指征摄入阿卡波糖，会引发腹胀、排气增多、腹泻等胃肠道不适，长期滥用会导致人体糖代谢紊乱、低血糖、营养不良等问题，尤其对青少年、老年人的代谢系统造成不可逆损伤。

4、乳果糖是一种人工合成的双糖，常被作为甜味剂、保湿剂应用于部分加工食品，同时也是临床缓泻药物。食品中适量乳果糖对健康人群无明显危害，但过量添加或长期摄入，易引发肠胃胀气、渗透性腹泻，对于肠胃敏感人群、婴幼儿及老人，不良反应更为显著。目前部分乳制品、烘焙食品、功能性饮品存在乳果糖超量添加、未标注添加信息的问题，且现有食品检测标准中，缺乏精准的乳果糖批量筛查检测方法，难以有效管控其添加量合规性。

5、目前，针对上述三种物质的食品检测技术仍存在诸多短板，难以满足食品安全批量筛查、精准溯源的检测需求。现有检测手段多为单一物质靶向检测，仅能单独检测巴豆苷、阿卡波糖或乳果糖中的一种组分，尚无成熟的可同步检测三种差异化糖苷、糖类物质的一体化检测方法，检测流程繁琐、检测效率低下，检测成本高，无法适配食品批量抽检、市场常态化监管的场景需求。

6、具体而言，现有巴豆苷检测多集中于中药材、中药制剂领域，食品基质复杂，含大量蛋白质、淀粉、油脂、色素等干扰杂质，中药材靶向检测方法应用于食品检测时，抗干扰能力弱、回收率低、检测精度差，易出现假阳性、假阴性结果。阿卡波糖的检测多针对药品原料及制剂，食品中微量非法添加的阿卡波糖难以被精准检出，常规色谱检测方法灵敏度不足，无法实现痕量筛查。乳果糖现有检测方法多适用于乳制品、口服液等单一简单基质，对多品类、复杂基质食品的适配性差，且检出限较高，无法精准判定食品中乳果糖超量添加的情况。

7、除此之外，现有单一检测技术前处理步骤复杂，多需经过多次萃取、净化、衍生化处理，操作门槛高、检测周期长，对实验设备及操作人员专业度要求严苛，基层食品检测机构难以落地应用。同时，三种物质理化性质差异较大，巴豆苷极性糖苷、阿卡波糖大分子降糖糖苷、乳果糖人工双糖的色谱保留特性、质谱响应特征区别明显，传统检测体系无法实现多组分同步分离、同步定性定量分析，极大地制约了食品中三类风险物质的常态化监管与风险防控。

8、综上所述，当前食品领域缺乏一种适配复杂基质、灵敏度高、精准度好、操作简便，可同步检测巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的一体化检测方法。为弥补现有技术空白，提升食品中三类风险物质的检测效率与检测精准度，实现食品非法添加、超量添加风险的有效防控，保障食品质量安全与公众饮食健康，亟须研发一种全新的食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖同步检测方法。

技术实现思路

1、本发明是为避免上述现有技术所存在的不足，提供了一种食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的检测方法。本发明方法简单、快速、通量高、成本低、能精准定性定量，适用于大批量食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的检测，为食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖同时快速分析提供科学方法。

2、本发明所用仪器为液相色谱-三重四极杆串联质谱仪lc-ms/ms，包括液相色谱仪lc和三重四极杆串联质谱仪ms/ms；

3、本发明食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的检测方法，包括如下步骤：

4、步骤1：各组分保留时间和监测离子的确定

5、取巴豆苷、阿卡波糖和乳果糖三个组分配制浓度均为1000ng/ml的混标工作溶液，将混标工作溶液通过三重四极杆质谱仪进行母离子的扫描，采用infuion、combine两者模式相结合方式找寻母离子和子离子，运用单一控制变量的方法，对锥孔电压、毛细管电压及各物质的碰撞能进行优化，以每种物质响应最高的条件为采集条件，确定各组分的监测离子（见表1）、定量离子对及定性离子对，建立质谱文件；然后将混标工作溶液进行lc-ms/ms检测，确定各组分的保留时间。

6、本发明的各组分质谱参数如下表1所示：

7、

8、在定性离子与定量离子的确定步骤中，采用了混标工作溶液直接注入的模式infuion（直接注射）、combine（流动相与标液两者混合注射）两者模式相结合方式找寻母离子和子离子，有效的解决了乳果糖和阿卡波糖对乙酸铵的依赖性，大大提供了两种物质在系统检测中的响应值。

9、步骤2：各物质标准曲线的绘制、检出限及定量限的制定

10、取不含巴豆苷、阿卡波糖和乳果糖三个组分的压片糖果为空白基质，通过添加巴豆苷、阿卡波糖、乳果糖配制不同浓度的混合系列标准工作溶液，然后将配制好的混合系列标准工作溶液进样，分别进样5µl，进行lc-ms/ms检测，以各巴豆苷、阿卡波糖和乳果糖三个组分的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，获得巴豆苷、阿卡波糖和乳果糖三个组分的线性回归方程，各线性回归方程所对应的曲线，即为巴豆苷、阿卡波糖和乳果糖三个组分的标准曲线；

11、所述不同浓度的混合系列标准工作溶液中巴豆苷、阿卡波糖和乳果糖三个组分的质量浓度控制在2~200ng/ml。在所述不同浓度的混合系列标准工作溶液中，巴豆苷、阿卡波糖和乳果糖三组分的质量浓度至少分别设置六个不同的点值。

12、所述各组分对应的线性回归方程及相关系数r2见表2，方程中y即为相应各组分所对应的峰面积，x即为各组分的质量浓度；另根据检测方法的专属性，对本方法中检出限和定量限进行了制定及验证。所得的相关数据见表2。

13、

14、步骤3：待测样品的前处理

15、固体样品前处理：

16、制备：固体样品首先需逐级粉碎样品，通过标准套筛筛选，保证95%以上样品处于要求粒度范围（过60目的筛子通过率为95%以上），其次通过转堆、研磨等方式让不同粒度、不同成分的样品充分混匀，最后用四分法，将混匀样品堆成圆锥后压平，用十字板分成四等份，取对角两份，重复操作直至得到符合检测需求的样品量。

17、提取：称取试样5g至50ml离心管中，加甲醇20 ml，涡旋1min，超声提取30 min，6000r/min离心5 min，放冷至室温，上清液转移至25ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，在40℃下氮吹，至浸干，用1ml 20%甲醇复溶。

18、净化：加5ml正己烷，涡旋5min，6000r/min离心5 min，放冷至室温，取下层溶液经0.22μm有机微孔滤膜过滤，待液相色谱-串联质谱仪测定。本步骤中加入正己烷可以较好的除去样品中的脂肪，避免非目标物的干扰。

19、液体样品前处理：

20、当液体样品中蛋白质含量≥12克/100ml时，先加硫酸铅去除蛋白，再取上清液经0.22μm有机微孔滤膜过滤，待液相色谱-串联质谱仪测定；

21、当液体样品中蛋白质含量＜12克/100ml时，直接经0.22μm有机微孔滤膜过滤，待液相色谱-串联质谱仪测定。

22、注：空白试验：除不加试样外，按试样同法处理，制得空白溶液，待液相色谱-串联质谱仪测定。

23、空白基质提取液：称取与试样等量的空白基质试样（不含巴豆苷、阿卡波糖和乳果糖三个组分），按试样同法处理，制得空白基质试样溶液，待液相色谱-串联质谱仪测定。

24、步骤4：待测样品的测试

25、取步骤3前处理后的待测样品1ml进行lc-ms/ms检测，通过多反应监测模式，获得待测样品的质谱图和色谱图，根据保留时间和各组分的监测离子对待测样品进行定性分析，根据各组分标准曲线对待测样品进行定量分析。

26、本发明检测参数设定如下：

27、液相色谱lc的检测参数为：

28、色谱柱：waters xbridge beh amide 色谱柱，2.6μm，2.1×100mm；

29、柱温：40℃；

30、流速：0.2～0.4ml/min；

31、进样量：5μl；

32、流动相体系及梯度洗脱：a相为5mmol/l甲酸铵（含0.1%甲酸水溶液），b相为乙腈；

33、梯度洗脱程序设置如下：

34、0min 时，a相：b相=95:5，v/v，下同；

35、0min到0.20min，a相：b相由95:5以恒定的速率逐渐变为80:20；

36、0.20min到 3.00min，a相：b相由80:20以恒定的速率逐渐变为5:95；

37、3.00min到4.00min，a相：b相由5:95以恒定的速率逐渐变为80:20；

38、4.00min到5.00min，a相：b相由80:20以恒定的速率逐渐变为95:5；

39、即完成梯度洗脱。

40、在整个洗脱过程中，乙腈的比例随时间以恒定速率线性增加或减少。

41、质谱(msms)的检测参数为：

42、电离方式：电喷雾电离，正、负离子模式扫描；

43、检测方式：多反应监测模式；

44、离子源温度120℃；

45、脱溶剂气温度500℃；

46、脱溶剂气流量800l/h；

47、锥孔气流量50 l/h；

48、毛细管电压1.0 kv；

49、锥孔电压20 v；

50、扫描时间0.5s；

51、保留时间0.5～6min。

52、与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

53、1、本发明建立了一种食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的检测方法，其所要达到的目的是方法简单、快速、通量高、成本低、能精准定性定量，适用于大批量食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的检测，为食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖同时快速分析提供科学方法。

54、2、本发明液相色谱-三重四极杆串联质谱仪操作简单快捷、准确可靠、重复性好。

55、3、本发明为液质方法开发提供了一种快速、高效、精准的找寻母离子及碎片离子的方法，为液质方法开发提供思路。

56、4、本发明为新方法的开发提供了检出限和定量限的制定方法及验证方法，为新方法检出限和定量限的制定提供科学依据。

57、5、本发明采用了1000ng/ml的混合标准溶液直接注入的模式infuion（直接注射）、combine（流动相与标液两者混合注射）两者模式相结合方式找寻母离子和子离子，有效的解决了乳果糖和阿卡波糖对乙酸铵的依赖性，大大提供了两种物质在系统检测中的响应值。

58、6、本发明简单、快速、检出限低、成本低，适用于大批量食品中的巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖快速、准确定量检测，为食品中巴豆苷、阿卡波糖及乳果糖的检测和污染风险评估工作提供技术保障。