一种HPLC法同时测定活血接骨止痛膏中多种皂苷成分含量的方法与流程

本发明涉及中药，尤其涉及一种hplc法同时测定活血接骨止痛膏中多种皂苷成分含量的方法。

背景技术：

1、黑膏药是祖国医药古老的剂型之一，载药量大，作用持久，直接作用于患处，上千年的发展历史证明其在为人类治疗疾病方面发挥过重要作用，是我国宝贵的文化遗产中重要的一部分，需加以保护和发扬。长期以来，由于黑膏药往往药味多且工艺特殊，对黑膏药的质量控制多停留在经验阶段，如质量以“明如镜，黑如漆”为好，并有“黑之功在于搅，亮之功三于扇”的观点。《中国药典》制剂通则中膏药项下仅规定了性状、软化点及重量差异检查，收载的“阳和解凝膏”“暖脐膏”“狗皮膏”等品种质量标准中均无其他质量控制指标；以往药典曾收载的“拔毒膏”仅规定了樟脑的气相色谱鉴别，“万灵五香膏”仅规定了肉桂、白芷的薄层鉴别及麝香的含量测定，但这几种成分均为另外分装的药粉，并未混合在膏药内。与绝大多数中药制剂相比，黑膏药的质量控制历来是个难点，究其原因，这与黑膏药药味多且工艺特殊有关，各成分难分离、干扰多，黏性大、吸附性强的基质加大了分析时处理样品的难度，给黑膏药的鉴别特别是有效成分含量测定造成巨大困难。近年来，虽有气相色谱及液相色谱法用于黑膏药的含量测定，但多停留在个别产品的研究阶段，并未全面、具体地运用到实际的产品检验当中，还需进一步的实践验证。

2、活血接骨止痛膏由三七、续断、乳香、没药、当归、生地黄、大黄、独活、羌活、连翘、白芷、赤芍等22味中药制成，分大、中、小号三种规格，药品批准文号分别为豫药制字z20120261（洛）、豫药制字z20120262（洛）、豫药制字z20120263（洛），具有活血祛瘀、消肿止痛、接骨续筋、祛风除湿的功效，用于治疗创伤骨折、软组织损伤、劳损性腰腿痛、颈肩痛等各种痛症。

3、活血接骨止痛膏为传统中药外用制剂黑膏药，包括基质及接骨丹两部分，基本工艺为：当归、生地黄等9味中药通过油炸、炼油、下丹、去火毒后，形成膏药基质，基质加热后再加入三七、续断等13味中药组成的接骨丹摊涂而成。其质量控制指标除《中国药典》制剂通则中规定的性状、软化点及重量差异外，制剂标准中仅有三七、冰片两味药的薄层鉴别，缺少对有效成分的含量测定，这对于控制产品质量来说远远不够。像市场上其他黑膏药一样，药味多，有效成分相对含量低，经过油炸后，部分有效成分发生了未知变化或转化，药物成分与膏药基质混杂后造成提取分离困难，均给有效成分的分析测定造成困难，使用常规的方法很难检测有效成分含量。三七、续断为方中主药，三七皂苷r1、人参皂苷rg1、川续断皂苷ⅵ、人参皂苷rb1及人参皂苷rd等皂苷类成分为其有效成分，目前文献中未见活血接骨止痛膏中的有效成分含量测定方法，也未见hplc法同时测定黑膏药中多种皂苷成分含量的方法。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：提供一种hplc法同时测定活血接骨止痛膏中多种皂苷成分含量的方法，以解决现有技术中大复方黑膏药剂型因基质黏性大、成分难分离、干扰多，导致有效成分含量难以准确测定，产品质量控制水平较低的技术问题，更好地控制产品质量。

2、本发明为了解决上述技术问题采用的技术方案是：

3、第一方面，本发明提供一种液相色谱法同时测定活血接骨止痛膏中多种皂苷成分含量的方法，所述多种皂苷成分包括三七皂苷r1、人参皂苷rg1、川续断皂苷ⅵ、人参皂苷rb1和人参皂苷rd；所述方法包括以下步骤：

4、s1，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按下述程序进行梯度洗脱：0～10分钟，流动相a为20%、流动相b为80%；10～40分钟，流动相a由20%线性变化至30%、流动相b由80%线性变化至70%；40～60分钟，流动相a由30%线性变化至31%、流动相b由70%线性变化至69%；60～61分钟，流动相a由31%线性变化至36%、流动相b由69%线性变化至64%；61～70分钟，流动相a由36%线性变化至42%、流动相b由64%线性变化至58%；70～72分钟，流动相a由42%线性变化至90%、流动相b由58%线性变化至10%；流速为1ml/min，检测波长为203nm；

5、s2，对照品溶液的制备：分别精密称取三七皂苷r1对照品、人参皂苷rg1对照品、川续断皂苷ⅵ对照品、人参皂苷rb1对照品及人参皂苷rd对照品，加甲醇制成混合溶液，即得；

6、s3，供试品溶液的制备：揭取活血接骨止痛膏，剪碎，精密称取，置具塞锥形瓶中，按样品重量与三氯甲烷、乙醇和水的用量比为1g:2ml:2ml:5ml，依次精密加入三氯甲烷、乙醇和水，摇匀，称定重量，置水浴振荡器上保持1小时，取出，放冷，用水补足减失的重量，滤过，滤液加乙醚洗涤，弃去乙醚液，水层蒸干，残渣加甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

7、s4，测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

8、作为优选方案，所述步骤s2中，混合溶液中，三七皂苷r1的浓度为10μg/ml，人参皂苷rg1的浓度为40μg/ml，川续断皂苷ⅵ的浓度为200μg/ml，人参皂苷rb1的浓度为40μg/ml，人参皂苷rd的浓度为10μg/ml。

9、作为优选方案，所述步骤s3中，称取的样品重量为10g；所述三氯甲烷、乙醇和水的用量分别为20ml、20ml和50ml；所述水浴振荡器的温度为60℃，振荡频率为150r/分钟；所述水层蒸干的温度为85℃；所述残渣加甲醇定容至5ml。

10、作为优选方案，所述步骤s3中，乙醚洗涤的用量为每次30ml，洗涤2次。

11、作为优选方案，所述步骤s4中，对照品溶液与供试品溶液的进样量分别为10μl。

12、第二方面，本发明提供上述方法在活血接骨止痛膏产品质量控制中的应用。

13、根据上述技术方案，本发明的有益效果是：

14、1.本发明采用液相色谱法，首次实现了活血接骨止痛膏中三七皂苷r1、人参皂苷rg1、川续断皂苷ⅵ、人参皂苷rb1及人参皂苷rd五种皂苷成分的同时含量测定。该方法突破了传统黑膏药质量控制仅依靠性状、软化点、重量差异及薄层鉴别等常规检查的局限，也突破了常规仅控制单一有效成分的不足，方法简单、准确，有效解决了大复方黑膏药剂型含量测定的技术难题，为活血接骨止痛膏提供了全面、可靠的质量控制手段。

15、2.针对黑膏药基质黏性大、吸附性强、有效成分提取困难的特点，本发明采用三氯甲烷、乙醇、水三元混合溶剂体系，通过分步加入的方式对样品进行提取，三氯甲烷能够有效溶散黑膏药的脂溶性基质，乙醇作为桥梁溶剂可与三氯甲烷及水互溶，水作为提取溶剂可将皂苷类成分充分提取出来，三者协同作用实现了对黑膏药中皂苷成分的高效提取。同时，本发明采用60℃水浴振荡提取方式，既避免了超声提取温度不易控制的缺陷，又避免了回流提取温度过高对有效成分的破坏，还能保证提取溶剂与药物的充分接触，保证了提取过程的充分性和结果的可靠性。

16、3.本发明提供的含量测定方法操作简便，对照品溶液与供试品溶液的制备过程无需复杂的纯化步骤，液相色谱分析在较短时间即可完成五种成分的同时测定，适用于活血接骨止痛膏的日常质量检验及质量控制，具有良好的推广应用前景。