重组胶原蛋白凝胶中谷氨酰胺转移酶残留量的测试方法与流程

本技术涉及化妆品领域，具体而言，涉及一种重组胶原蛋白凝胶中谷氨酰胺转移酶残留量的测试方法。

背景技术：

1、重组胶原蛋白是通过重组dna技术制备的胶原蛋白，因其生物相容性好、水溶性佳、修复能力强等优点，在医美材料、医用敷料及组织工程领域应用日益广泛。其中，重组胶原蛋白凝胶是重要的产品形式，通常采用谷氨酰胺转移酶（tg酶）作为交联剂，催化重组胶原蛋白分子间发生交联反应，形成具有三维网络结构的水凝胶。谷氨酰胺转移酶作为一种蛋白质酰基转移酶，能够通过分子插入、交联反应和脱氨作用，使蛋白质分子结构发生变化，进而改善蛋白质的凝胶性、乳化性和稳定性等功能特性。

2、在重组胶原蛋白凝胶的制备过程中，谷氨酰胺转移酶作为催化剂参与交联反应，但反应完成后残留的谷氨酰胺转移酶属于工艺杂质，其残留量直接影响产品的纯度、安全性和质量稳定性。一些规定对重组胶原蛋白凝胶中的杂质残留控制也提出了严格要求。因此，建立准确、灵敏的谷氨酰胺转移酶残留量检测方法，对于保障产品质量、满足使用规定要求具有重要意义。

3、然而，当前缺乏可有效测试胶原蛋白凝胶中残留交联酶的方法。传统elisa测试法无法有效测试灭活后胶原蛋白凝胶中酶的残留。

技术实现思路

1、本技术实施例的目的在于提供一种重组胶原蛋白凝胶中谷氨酰胺转移酶残留量的测试方法。

2、第一方面，本技术提供一种重组胶原蛋白凝胶中谷氨酰胺转移酶残留量的测试方法，包括：

3、建立标准胶原蛋白浓度与紫外吸光值的第一标准曲线；

4、测定待测重组胶原蛋白凝胶中的蛋白浓度；根据蛋白浓度与第一标准曲线得到待测重组胶原蛋白凝胶在预设波长处的紫外吸光值，得到第一吸光值；待测重组胶原蛋白凝胶为重组胶原蛋白与谷氨酰胺转移酶交联反应形成的凝胶；

5、对待测重组胶原蛋白凝胶进行热处理，使待测重组胶原蛋白凝胶发生降解，得到待测溶液样品；测试待测溶液样品在预设波长处的紫外吸光值，得到第二吸光值；

6、采用第二吸光值减去第一吸光值，得到第三吸光值；

7、建立谷氨酰胺转移酶浓度与紫外吸光值的第二标准曲线；

8、根据第三吸光值与第二标准曲线，得到谷氨酰胺转移酶残留量。

9、上述技术方案中，通过建立两个标准曲线，将待测重组胶原蛋白凝胶中的总蛋白浓度换算为胶原蛋白的理论紫外吸光值，再对凝胶进行热处理使其降解，凝胶热处理下化为溶液，会将其中的谷氨酰胺转移酶释放出来，以游离蛋白的形式存在，随着加热时间增加，会进一步发生水解形成肽段，即谷氨酰胺转移酶是以游离变性蛋白和多肽混合物形式存在。测得降解后溶液的实际紫外吸光值，以第二吸光值减去第一吸光值得到谷氨酰胺转移酶的净吸光值，最终根据谷氨酰胺转移酶标准曲线得到谷氨酰胺转移酶残留量的定量测定。该方法有效解决了目前重组胶原蛋白凝胶中谷氨酰胺转移酶无法测量的难题，并且该方法操作简便，无需复杂的分离纯化步骤，不依赖特殊抗体，成本极低，具有广泛的应用潜力。

10、在本技术的其他实施例中，上述的测定待测重组胶原蛋白凝胶中的蛋白浓度，包括：

11、将待测重组胶原蛋白凝胶中的有机氮转化为无机铵盐，根据无机铵盐测定氮含量，根据氮含量计算重组胶原蛋白凝胶中的蛋白浓度。

12、上述技术方案中，采用将有机氮转化为无机铵盐的方法测定待测重组胶原蛋白凝胶中的蛋白浓度，准确度高、重现性好，能够为后续的紫外吸光值换算提供可靠的蛋白浓度数据基础，有利于第一吸光值的计算准确性。

13、在本技术的其他实施例中，对待测重组胶原蛋白凝胶进行热处理，包括：

14、对待测重组胶原蛋白凝胶在100℃~140℃进行热处理。

15、上述技术方案中，对待测重组胶原蛋白复合凝胶于 100 ℃～140 ℃区间实施热处理。该温度区间可促使胶原蛋白、弹性蛋白的天然高级空间结构受热解折叠，破坏维持凝胶宏观固态形貌的非共价相互作用，使凝胶基质液化溃散，原本被三维网格包裹截留的谷氨酰胺转移酶能够充分释放至水溶液体系中；同时相较于更高的加热温度，100～140 ℃的湿热条件可有效缓解 tg 酶多肽主链发生热水解断裂，完整保留酶分子氨基酸骨架结构及其固有紫外吸收属性，规避高温过度水解造成的吸光度偏移问题，保证后续紫外检测结果真实、精准。

16、在本技术的其他实施例中，对待测重组胶原蛋白凝胶进行热处理，包括：热处理的时间为30min~120min。

17、上述技术方案中，将热处理时间控制在30min~120min范围内，可以与前述的热处理温度协同配合，可以使得凝胶降解完全、谷氨酰胺转移酶释放充分，使待测溶液样品中的谷氨酰胺转移酶浓度反映凝胶中的残留量水平，提高检测的精确度。

18、在本技术的其他实施例中，预设波长为250nm-300nm；

19、上述技术方案中，将预设波长设定为250nm-300nm，该波长范围处于蛋白质中芳香族氨基酸的特征紫外吸收区域，谷氨酰胺转移酶在该波长处具有显著的吸收峰，可以使得检测信号强度与谷氨酰胺转移酶浓度之间具有良好的线性关系，提高检测灵敏度。

20、在本技术的其他实施例中，可选地，预设波长为280nm。

21、在本技术的其他实施例中，测试待测溶液样品在预设波长处的紫外吸收值，包括：

22、通过紫外分光光度计测试待测溶液样品在预设波长处的紫外吸收值。

23、上述技术方案中，采用紫外分光光度计测试待测溶液样品的紫外吸收值，准确度高。

24、在本技术的其他实施例中，根据所述蛋白浓度与所述第一标准曲线得到所述待测重组胶原蛋白凝胶在预设波长处的紫外吸光值，得到第一吸光值，包括：按照以下公式（1）计算所述第一吸光值：

25、y=0.02275x1-0.00931公式（1）

26、公式（1）中，y为第一吸光值；x1为胶原蛋白浓度。

27、在本技术的其他实施例中，采用所述第二吸光值减去所述第一吸光值，得到第三吸光值，包括：

28、按照以下公式（2）计算所述第三吸光值：

29、z= a- y公式（2）

30、公式（2）中，z为第三吸光值；y为第一吸光值；a为第二吸光值。

31、在本技术的其他实施例中，根据所述第三吸光值与所述第二标准曲线，得到谷氨酰胺转移酶含量，包括：

32、按照以下公式（3）计算所述谷氨酰胺转移酶含量：

33、z= 3.237x2-0.02039公式（3）

34、公式（3）中，z 为第三吸光值；x2为谷氨酰胺转移酶的浓度。

35、在本技术的其他实施例中，待测重组胶原蛋白凝胶为重组胶原蛋白与谷氨酰胺转移酶交联反应形成的凝胶，包括：

36、采用不含有芳香族氨基酸的重组胶原蛋白与谷氨酰胺转移酶，交联反应形成的凝胶。

37、上述技术方案中，采用不含有芳香族氨基酸的胶原蛋白，与谷氨酰胺转移酶进行交联反应形成凝胶。由于芳香族氨基酸是蛋白质在250nm~300nm处产生紫外吸收的物质基础，采用不含芳香族氨基酸的胶原蛋白可以消除胶原蛋白在预设波长处的吸收干扰，使谷氨酰胺转移酶成为体系中唯一的紫外信号源，从而可以提高检测的精准度。

38、在本技术的其他实施例中，可选地，所述芳香族氨基酸包括：酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸中的至少一种。

39、在本技术的其他实施例中，待测重组胶原蛋白凝胶为重组胶原蛋白与谷氨酰胺转移酶交联反应形成的凝胶，包括：

40、重组胶原蛋白与谷氨酰胺转移酶交联反应时，谷氨酰胺转移酶的添加量低于0.02mg/ml。

41、上述技术方案中，将交联反应中谷氨酰胺转移酶的添加量控制在低于重组胶原蛋白质量的0.02 mg/ml，该添加量水平下谷氨酰胺转移酶残留属于微量范畴，常规elisa等检测方法难以准确测定。本技术方法能够在此极低添加量条件下实现谷氨酰胺转移酶残留量的准确定量，体现了方法的高灵敏度和实用性，适用于医美等高纯度要求产品的质量控制。