用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料及制备方法

本发明涉及农业生物。更具体地说，本发明涉及用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料及制备方法。

背景技术：

1、土壤团聚体通过调控土壤通气性、保水性及养分持留能力，直接决定作物根系生长微环境。

2、土壤团聚体结构的破坏会直接触发肥力退化的连锁反应：板结土壤的通气孔隙占比常低于10%，导致作物根系呼吸能力下降，养分吸收效率降低，最终导致作物平均减产15%～30%；而土壤保水能力的下降幅度超过30%，不仅会加剧干旱地区农田的水肥流失，还会通过养分淋溶引发农业面源污染。现有技术路径主要包括施加有机肥、深耕松土及施用微生物菌肥等，但均存在明显的局限性：有机肥虽然可以补充土壤有机质，但其腐熟周期长达3～6个月，且养分释放速率与作物生育期需求的匹配度较低；深耕措施则易扰动土壤剖面结构的稳定性，且板结现象在短期内容易再次发生。

3、微生物菌肥可以定向调控土壤微生态系统，但现有产品仍存在关键技术缺陷。首先是菌群与目标土壤的适配性不足，多数菌肥采用商业化标准菌株而非目标土壤菌群，使得菌株在目标土壤中的定植率常低于20%，活性维持周期仅1～2周，难以形成稳定的功能菌群；其次是功能设计单一，现有菌肥多聚焦于固氮、解磷解钾等养分转化功能，少数涉及团聚体结构构建的产品，仅含产气芽孢杆菌会导致气体逸散后无法实现孔隙的稳定固定：仅含产胶菌株会导致胶黏度过高易引发局部土壤黏结，未能形成“产气膨胀-产胶固定”的协同耦合机制，难以定向构建稳定的土壤团聚体结构；再者载体与功能基质的设计存在缺陷，传统菌肥载体多为普通泥炭或秸秆粉，孔隙结构单一且大孔隙占比不足15%，无法为微生物存活提供适宜的微环境，同时缺乏可降解膨胀调控组分，难以突破板结土壤的物理屏障，而结构稳定调节物质的缺失，则导致临时形成的团聚体结构易在灌溉或耕作扰动后崩解。

4、现有菌肥的微生物保护体系不完善：多数产品未添加微包埋材料与抗逆组分，导致菌株在干燥、运输及土壤极端环境中的存活率不足30%；同时缺乏代谢诱导微量元素组合，无法持续激活菌群的产气、产胶代谢通路。

5、综上，农业生产实践中需要开发一种能够适配待改造土壤微生态特征、集成“产气膨胀-产胶固定”协同耦合功能、并具备多孔缓释载体与膨胀调控机制的生物肥料，通过定向构建稳定的土壤团聚体结构，解决我国耕地土壤板结与肥力退化的核心难题，最终实现农田土壤质量的长效提升。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有微生物肥料在改良土壤结构时存在的菌群适配性差、功能单一以及载体与保护体系不完善等缺陷，提供一种用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法。该方法旨在通过从目标土壤环境分离培养功能菌群，并将其与专门设计的多孔缓释载体、可降解膨胀调控基质、微生物保护与诱导组分及结构稳定调节组分进行复合，实现“产气膨胀”与“产胶固定”的协同耦合，从而定向、稳定、高效地构建土壤团粒结构，以解决土壤板结和肥力退化问题。

2、为了解决上述问题，并实现本发明的目的和其它优点，提供了一种用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法，包括以下步骤：

3、s1：从待改造土壤所属地貌单元的微生物富集处采集土壤样本，制备梯度土壤悬液；

4、s2：从不同梯度的土壤悬液中分别分离培养，获得活化地衣芽孢杆菌菌液、活化枯草芽孢杆菌菌液、活化放线菌菌液及活化蓝藻藻液；

5、s3：制备产气-产胶复合菌液：将活化地衣芽孢杆菌菌液、活化枯草芽孢杆菌菌液、活化放线菌菌液及活化蓝藻藻液混合，得到产气-产胶复合菌液；产气-产胶复合菌液中地衣芽孢杆菌菌液质量占25-35%、枯草芽孢杆菌菌液质量占25-35%、放线菌菌液质量占20-30%、蓝藻藻液质量占10-20%；

6、s4：制备多孔缓释载体：将玉米秸秆生物炭粉碎过筛至粒径＜3mm，腐殖质泥炭、腐殖酸土干燥过筛至粒径＜2mm，膨润土粉碎过筛至粒径＜1mm；按质量份数计，取玉米秸秆生物炭20-35份、腐殖质泥炭10-20份、腐殖酸土10-20份、膨润土5-15份混合得到多孔缓释载体；

7、s5按质量份数计，取改性玉米淀粉5-12份、甜菜糖蜜3-8份，加蒸馏水5-10份溶解得到可降解膨胀调控基质；

8、s6：按质量份数计，取海藻酸钠1-2份、酵母粉1-3份、甜菜碱1-2份、微量元素液1-2份混合得到微生物保护与诱导组分；

9、s7：按质量份数计，取木质素磺酸盐1-2份、沸石粉1-2份、蛭石1-2份混合得到结构稳定调节组分；

10、s8：按质量份数计，将步骤s3所得产气-产胶复合菌液5-12份、步骤s4所得多孔缓释载体45-65份、步骤s5所得可降解膨胀调控基质10-20份、步骤s6所得微生物保护与诱导组分3-8份、步骤s7所得结构稳定调节组分2-5份混合，搅拌、造粒，并在35-40℃干燥至含水率＜10%，得到所述生物肥料。

11、优选的是，所述的用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法中，步骤s2中，所述分离培养包括使用专用培养基对目标菌群进行培养；所述专用培养基包括芽孢杆菌培养基、放线菌培养基和蓝藻培养基；芽孢杆菌培养基用于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌培养；

12、所述芽孢杆菌培养基通过称取牛肉膏3.0-3.5g、蛋白胨10.0-12.0g、nacl 5.0-5.5g、琼脂15-25g，加入纯化水1000ml溶解并调节ph值至7.4-7.5配置而成；

13、所述放线菌培养基通过称取可溶性淀粉20-25g、kno3 0.8-0.9g、nacl 0.4-0.5g、k2hpo4·3h2o 0.5-0.6g、mgso4·7h2o 0.5-0.6g、cacl2 0.1-0.15g、mnso4 0.005-0.01g、feso4·7h2o 0.01g、琼脂20g，加入纯化水1000ml溶解并调节ph值至7.3-7.4配置而成；

14、所述蓝藻培养基通过称取nano3 1.5g、k2hpo4·3h2o 0.04g、mgso4·7h2o 0.075g、cacl2·2h2o 0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、edta二钠0.001g、na2co3 0.02g、微量元素液1ml，加入纯化水1000ml溶解并调节ph值至7.0-7.2配置而成；

15、其中，所述微量元素液的制备方法如下：

16、称取硼酸0.02g、硫酸锰0.02g、硫酸锌0.02g、硫酸铜0.01g、钼酸钠0.01g、氯化钴0.01g，备用；取800ml去离子水加热至40-50℃，将上述备用试剂依次加入水中，边加边搅拌至完全溶解，最后加入预先单独配制并冷却至室温的edta-fe溶液10ml，混合均匀后用去离子水定容至1000ml，调节ph值至6.0-7.0，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到母液，将母液用纯化水按体积比1:100稀释，得到微量元素液；

17、所述edta-fe溶液的制备方法为：称取na2edta 1.0g、feso4·7h2o 0.8g，分别加入500ml 60℃的去离子水中，搅拌至完全溶解，得到edta二钠溶液和硫酸亚铁溶液；在持续搅拌条件下，将硫酸亚铁溶液缓慢倒入edta二钠溶液中，保持60℃恒温搅拌20-30min，使其充分螯合，冷却至室温后用去离子水定容至1000ml，得到稳定的金黄色edta-fe溶液，备用；

18、在使用所述专用培养基前，对其进行灭菌与无菌性检查：将所述芽孢杆菌培养基、放线菌培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min，将所述蓝藻培养基采用115℃、0.06mpa高压蒸汽灭菌15min。

19、优选的是，所述的用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法中，步骤s1中，制备梯度土壤悬液的具体步骤为：从待改造土壤所属地貌单元的微生物富集处采集土壤样本，取10g土壤加入90ml无菌生理盐水振荡，制成10-1梯度土壤悬液，再梯度稀释得到10-2～10-5梯度的土壤悬液；

20、步骤s2中，所述活化地衣芽孢杆菌菌液和活化枯草芽孢杆菌菌液通过以下方式获得：取10-4和10-5梯度土壤悬液接种于芽孢杆菌培养基，在36.6-37.2℃下培养18-24h，挑取特征菌落转接至液体培养基扩大培养；

21、所述活化放线菌菌液通过以下方式获得：取10-3和10-4梯度土壤悬液接种于放线菌培养基，在27.5-28.5℃、湿度63%-67%下培养36-48h，挑取特征菌落转接至液体培养基扩大培养；

22、所述活化蓝藻藻液通过以下方式获得：取10-2和10-3梯度土壤悬液接种于蓝藻培养基，在20-28℃、光照2000-3000lux下培养36-48h，挑取特征菌落转接至液体培养基扩大培养。

23、优选的是，所述的用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法中，步骤s5中，所述改性玉米淀粉为羟丙基玉米淀粉；

24、羟丙基玉米淀粉的制备方法为：先将100g玉米淀粉分散在350ml体积分数为75%的乙醇溶液中，加入1.5g质量分数为2%的氢氧化钠溶液进行碱化处理，碱化体系ph维持在8.5-9.0，使淀粉颗粒活化；随后在密封条件下加热至42-45℃，缓慢滴加10g环氧丙烷作为醚化剂，保温搅拌反应16h，使羟丙基接枝到淀粉分子上；反应结束后用质量分数为1%的盐酸中和至ph 6.8-7.2，再用体积分数为80%的乙醇溶液反复洗涤3-4次，以去除盐分和未反应的试剂，经离心脱水、40℃低温真空干燥和粉碎过100目筛，即得羟丙基玉米淀粉；

25、步骤s8中，搅拌速度为150-200rpm，搅拌时间为20-30min，造粒的粒径为2-5mm。

26、优选的是，所述的用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法中，步骤s3中，在各活化菌液混合前，分别测定活化地衣芽孢杆菌菌液、活化枯草芽孢杆菌菌液、活化放线菌菌液及活化蓝藻藻液的微生物浓度；再根据各活化菌液的微生物浓度，计算并确定所需混合的各菌液体积，然后按各菌液体积进行混合，以使得到的产气-产胶复合菌液中，地衣芽孢杆菌菌液质量占25-35%、枯草芽孢杆菌菌液质量占25-35%、放线菌菌液质量占20-30%、蓝藻藻液质量占10-20%。

27、优选的是，所述的用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法中，步骤s2具体包括：

28、s2.1 挑取特征菌落：从涂布了10-4和10-5梯度土壤悬液的芽孢杆菌培养基平板上，挑取具有地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌典型形态特征的单菌落；从涂布了10-3和10-4梯度土壤悬液的放线菌培养基平板上，挑取具有放线菌典型形态特征的单菌落；从涂布了10-2和10-3梯度土壤悬液的蓝藻培养基平板上，挑取具有蓝藻典型形态特征的单菌落；

29、s2.2 功能验证与筛选：

30、针对挑取的地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌单菌落，将其点种于功能验证用芽孢杆菌琼脂培养基平板上，在36.6-37.2℃下培养18-24h，培养结束后，测量菌落周围形成的溶钙圈直径，选取溶钙圈直径不小于3mm的单菌落，作为功能验证通过的芽孢杆菌菌株；所述功能验证用芽孢杆菌琼脂培养基是在芽孢杆菌培养基配方基础上添加15-20g/l碳酸钙配制而成；

31、针对挑取的放线菌单菌落，将其接种于功能验证用放线菌液体培养基中，于27.5-28.5℃、150-180rpm振荡培养48-72h，培养结束后使用旋转式黏度计测定发酵液黏度，选取发酵液黏度不低于50mpa·s的培养物，作为功能验证通过的放线菌菌株；所述功能验证用放线菌液体培养基是在放线菌培养基配方基础上，将其碳源可溶性淀粉替换为50-100g/l蔗糖并去除琼脂配制而成；

32、针对挑取的蓝藻单菌落，将其接种于功能验证用蓝藻液体培养基中，于20-28℃、光照强度2000-3000lux条件下培养5-7d，培养结束后采用苯酚-硫酸法测定培养液中胞外多糖含量，选取胞外多糖含量不低于100mg/l的培养物，作为功能验证通过的蓝藻菌株；所述功能验证用蓝藻液体培养基是在蓝藻培养基配方基础上去除琼脂配制而成；

33、s2.3 扩大培养：将步骤s2.2中功能验证通过的芽孢杆菌菌株、放线菌菌株和蓝藻菌株，分别无菌操作转接至各自对应的扩大培养用液体培养基中进行扩大培养；扩大培养用芽孢杆菌液体培养基是在芽孢杆菌培养基配方基础上去除琼脂配制而成；扩大培养用放线菌液体培养基是在放线菌培养基配方基础上去除琼脂配制而成；扩大培养用蓝藻液体培养基组成与所述功能验证用蓝藻液体培养基相同；

34、其中，芽孢杆菌菌株的扩大培养在36.6-37.2℃下进行，放线菌菌株的扩大培养在27.5-28.5℃下进行，蓝藻菌株的扩大培养在20-28℃、光照2000-3000lux条件下进行；从而分别获得活化地衣芽孢杆菌菌液、活化枯草芽孢杆菌菌液、活化放线菌菌液及活化蓝藻藻液。

35、优选的是，所述的用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法中，步骤s8中，在混合所有组分并进行搅拌之前，增加定向吸附与活化步骤：

36、首先，将步骤s4所得多孔缓释载体置于35-40℃环境下预热5-15min；

37、然后，将预热后的多孔缓释载体总质量的15%-30%与步骤s3所得产气-产胶复合菌液，在150-200rpm的搅拌转速下混合3-8min，形成含水率为20%-35%、温度为30-35℃的微生物-载体复合物；

38、之后，将所得微生物-载体复合物在28-32℃、相对湿度75%-85%的环境下密闭静置活化20-40min；

39、最后，将活化后的微生物-载体复合物与剩余的多孔缓释载体、可降解膨胀调控基质、微生物保护与诱导组分及结构稳定调节组分进行混合，继而进行后续搅拌、造粒与干燥。

40、优选的是，所述的用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法中，在步骤s3之后、步骤s8之前，增加土壤环境模拟诱导步骤：

41、取步骤s1采集土壤样本时所得的新鲜土壤，加入到步骤s3所得的产气-产胶复合菌液中，加入比例为每100ml菌群液加入5-10g新鲜土壤；

42、将混合体系置于温度25-28℃、转速100-150rpm的摇床中，于光照强度500-1000lux、光暗周期12h/12h的条件下，通气培养12-24h；

43、培养结束后，使用孔径为20-50μm的无菌筛网过滤，去除土壤颗粒，获得经目标土壤微生态预适应的产气-产胶复合菌液。

44、优选的是，所述的用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法中，步骤s8中的干燥具体采用阶梯诱导干燥工艺：

45、第一阶段：将造粒后的湿颗粒置于温度38-40℃、相对湿度60%-70%的环境中干燥1-2h，使颗粒表面初步定型；

46、第二阶段：将环境参数调整为温度30-32℃、相对湿度75%-85%，并保持2-3h，在此较高湿度环境下减缓整体脱水速率，为菌群提供适宜短期代谢与修复的微环境；

47、第三阶段：将温度调整至35-37℃、相对湿度降低至50%-60%，持续1h，利用前阶段被激活的菌群代谢活性，启动其孢子形成进程；

48、第四阶段：将温度升至40-42℃、相对湿度降至20%以下，持续干燥直至颗粒含水率小于10%，完成孢子最终成熟定型与颗粒深度脱水。

49、一种采用所述用产气产胶复合菌群重塑土壤结构的生物肥料的制备方法制备得到的生物肥料，所述生物肥料由以下重量份数的组分制成：产气-产胶复合菌液或经目标土壤微生态预适应的产气-产胶复合菌液5-12份、多孔缓释载体45-65份、可降解膨胀调控基质10-20份、微生物保护与诱导组分3-8份、结构稳定调节组分2-5份；

50、其中，产气-产胶复合菌液中地衣芽孢杆菌菌液质量占25-35%、枯草芽孢杆菌菌液质量占25-35%、放线菌菌液质量占20-30%、蓝藻藻液质量占10-20%；

51、所述多孔缓释载体按质量份数计，包含玉米秸秆生物炭20-35份、腐殖质泥炭10-20份、腐殖酸土10-20份、膨润土5-15份；

52、所述可降解膨胀调控基质按质量份数计，包含改性玉米淀粉5-12份、甜菜糖蜜3-8份，蒸馏水5-10份；

53、所述微生物保护与诱导组分按质量份数计，包含海藻酸钠1-2份、酵母粉1-3份、甜菜碱1-2份、微量元素液1-2份；

54、所述结构稳定调节组分按质量份数计，包含木质素磺酸盐1-2份、沸石粉1-2份、蛭石1-2份。

55、本发明至少包括以下有益效果：

56、本发明通过从目标土壤中分离并复配地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌及蓝藻，形成具有高生态适应性的产气-产胶复合菌群，显著提升了菌群在土壤中的定植率与功能持久性，有效克服了传统商业菌株适应性差、定植率低的技术缺陷。

57、本发明集成“产气膨胀-产胶固定”协同耦合机制，利用产气菌创造孔隙、产胶菌固定结构，实现土壤疏松与胶结同步进行，能够快速、定向地构建稳定的土壤团聚体，显著改善土壤通气性、保水性及抗侵蚀能力。

58、本发明设计的多孔缓释载体由玉米秸秆生物炭、腐殖质泥炭、腐殖酸土及膨润土复合而成，具有梯度孔隙结构，能为微生物提供长效栖居与缓释保护环境，结合可降解膨胀调控基质的碳源缓释功能，共同维持菌群代谢活性。

59、本发明所含的微生物保护与诱导组分包括海藻酸钠、酵母粉、甜菜碱及多种微量元素，不仅能在加工与储存过程中保护微生物活性，还能在土壤中激活其代谢通路，提升菌群抗逆性，保障肥料在复杂田间环境下的功能稳定性。

60、本发明通过添加木质素磺酸盐、沸石粉、蛭石等结构稳定调节组分，从胶结、持水及机械支撑等多维度增强新生土壤团聚体的稳定性，使其能够有效抵抗冻融、灌溉及耕作扰动，实现土壤结构的长期改良。

61、本发明的制备工艺科学可行，涵盖专用培养基配置、菌群分离活化、功能验证筛选、定向吸附活化及阶梯诱导干燥等关键步骤，工艺参数明确、操作性强，原料易于获取，适合规模化生产与推广应用。

62、本发明在实际应用中表现出显著的土壤改良与作物增产效果，田间试验证实其可有效提升土壤有机质含量、改善养分供应、促进根系发育，最终实现作物产量与品质的协同提升，为退化土壤的生态修复与农业可持续发展提供了高效可靠的技术方案。

63、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。