一种肾脏固有巨噬细胞缺失小鼠模型及其构建方法与应用

本发明属于基因工程和实验动物模型，具体涉及一种肾脏固有巨噬细胞缺失小鼠模型及其构建方法与应用。

背景技术：

1、巨噬细胞是机体固有免疫系统的重要组成部分，广泛分布于全身各组织和器官中。肾脏固有巨噬细胞（kidney-resident macrophages）是肾脏中最重要的免疫细胞群体之一，它们在维持肾脏内环境稳定、清除凋亡细胞、调节炎症反应及参与组织修复等过程中发挥着关键作用。近年来的研究表明，肾脏固有巨噬细胞在急性肾损伤、慢性肾病、糖尿病肾病、自身免疫性肾炎、肾纤维化以及移植排斥反应等多种肾脏疾病中均扮演着重要角色。然而，由于巨噬细胞在体内的广泛分布和功能异质性，其在特定肾脏疾病中的具体作用机制仍未完全阐明。

2、传统的巨噬细胞功能研究方法主要包括药理学清除（如使用氯膦酸盐脂质体）和全身性基因敲除。然而，氯膦酸盐脂质体介导的巨噬细胞清除缺乏细胞类型特异性，可同时清除多种组织中的巨噬细胞，且清除效果因给药途径和剂量不同而存在较大差异；全身性基因敲除策略则往往导致胚胎致死或严重的发育缺陷，难以用于成年动物的功能研究。此外，上述方法均无法实现特定组织或特定发育阶段的巨噬细胞精准操控，严重制约了肾脏固有巨噬细胞功能研究的深入。

3、cre-loxp重组系统是目前应用最广泛的条件性基因操控技术之一，结合他莫昔芬诱导型creert2系统，可实现时间特异性和细胞类型特异性的基因修饰。白喉毒素a亚基（dta）是一种高效的细胞杀伤分子，其进入细胞后可催化肽链延伸因子-2的失活，导致蛋白质合成终止和靶细胞凋亡。将上述技术与巨噬细胞特异性启动子相结合，有望实现肾脏固有巨噬细胞的可诱导性、条件性清除，为研究其在肾脏疾病中的作用提供理想的动物模型。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肾脏固有巨噬细胞缺失小鼠模型及其构建方法与应用，通过csf1r介导的他莫昔芬可诱导cre-loxp系统联合dta毒素杀伤策略，实现肾脏固有巨噬细胞时空特异性、高效可控的条件性清除，以解决现有巨噬细胞清除手段非特异性强、易造成胚胎致死、无法单独靶向肾脏固有巨噬细胞、难以开展长期肾脏疾病动物实验的问题。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种肾脏固有巨噬细胞缺失小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

3、（1）繁育csf1r-p2a-creert2小鼠：将csf1r-p2a-creert2小鼠与c57bl/6jgpt野生型小鼠交配繁育，提取子代鼠尾基因组dna，采用3'arm引物对t006204-f1/t006204-r1、野生型引物对t006204-f2/t006204-r2进行pcr基因型鉴定，筛选获得csf1r-p2a-creert2小鼠；

4、（2）繁育dtaflox/flox小鼠：将rosa26-loxp-zsgreen-stop-loxp-dta小鼠与c57bl/6jgpt小鼠交配繁育，提取子代鼠尾基因组dna，采用5'arm引物对t009408-f1/t009408-r1、野生型引物对t009408-f2/t009408-r2进行pcr基因型鉴定，筛选得到dtaflox/flox小鼠；

5、（3）制备f1代双阳性小鼠：将步骤（1）获得的csf1r-p2a-creert2小鼠与步骤（2）获得的dtaflox/flox小鼠交配，对子代小鼠进行csf1r-p2a-creert2和dtaflox/flox双基因pcr鉴定，筛选同时携带两种基因修饰的f1代双阳性小鼠；

6、（4）繁育f2代双阳性小鼠：将f1代双阳性小鼠与dtaflox/flox小鼠回交，子代进行双基因pcr鉴定，筛选获得csf1r-p2a-creert2-dtaflox/flox双阳性小鼠；

7、（5）对步骤（4）获得的双阳性小鼠施用他莫昔芬进行诱导，使creert2入核并特异性切除肾脏固有巨噬细胞中两个loxp位点间的终止元件，以开启dta的表达，诱导肾脏固有巨噬细胞凋亡，即得所述肾脏固有巨噬细胞缺失小鼠模型。

8、优选的，所述csf1r-p2a-creert2的鉴定引物序列如下：

9、t006204-f1：5'-acagcatgaagtgcaaagaacgtggt-3'，

10、t006204-r1：5'-gtggttccacccactctcacct-3'；

11、t006204-f2：5'-ggaagaggagccagtgcaaaca-3'，

12、t006204-r2：5'-gtggttccacccactctcacct-3'。

13、优选的，所述dtaflox/flox的鉴定引物序列如下：

14、t009408-f1：5'-tcaaatggctctccctcaagcgt-3'，

15、t009408-r1：5'-tggtacatgacgttctctccacc-3'；

16、t009408-f2：5'-ccaaaagtcgctctgagttgtta-3'，

17、t009408-r2：5'-tcgggtgagcatgtcttttaatct-3'。

18、优选的，步骤（5）中所述他莫昔芬的施用方式为腹腔注射，注射剂量按小鼠体重计为100 mg/kg，隔日腹腔注射一次，共注射4次，注射周期为7天。

19、优选的，步骤（5）中所述诱导时间为小鼠出生后第42天至第49天。

20、优选的，步骤（5）中所述巨噬细胞为肾脏固有巨噬细胞，包括f4/80hicd11blo巨噬细胞亚群。

21、本发明进一步提供一种由上述构建方法得到的肾脏固有巨噬细胞特异性缺失小鼠模型。

22、优选的，所述小鼠模型在未诱导他莫昔芬时，巨噬细胞发育正常，dta不表达；经他莫昔芬诱导后，肾脏固有巨噬细胞缺失，缺失效率通过流式细胞术进行检测。

23、本发明进一步提供上述肾脏固有巨噬细胞特异性缺失小鼠模型在制备用于研究肾脏固有巨噬细胞参与急性肾损伤、慢性肾病、自身免疫性肾炎、肾纤维化或移植排斥反应的动物模型中的应用。

24、本发明进一步提供上述肾脏固有巨噬细胞特异性缺失小鼠模型在筛选或评价调节肾脏固有巨噬细胞功能的药物或治疗策略中的应用。

25、本发明的有益效果：

26、本发明提供一种肾脏固有巨噬细胞缺失小鼠模型，本发明利用csf1r-p2a-creert2转基因小鼠与rosa26-loxp-zsgreen-stop-loxp-dta报告小鼠杂交，通过他莫昔芬诱导实现肾脏固有巨噬细胞的条件性、可诱导性清除。csf1r启动子驱动的creert2表达确保了巨噬细胞的高度特异性，避免了传统全身性敲除或化学清除方法的非特异性副作用。本发明的特异性诱导策略使得构建得到的小鼠模型在未诱导时发育正常、活力良好，存活周期长，可以存活六个月以上，能够有效保证长期实验的顺利进行。通过本发明构建方法得到的肾脏固有巨噬细胞缺失小鼠模型，在肾脏免疫学、肾脏疾病机制研究及药物靶点筛选等领域具有很好的应用前景。