一种基于膜保护和控冰的低毒性冻存液及其在卵母细胞冷冻保存中的应用

本发明属于生物医用材料，涉及一种基于膜保护和控冰的低毒性冻存液及其制备方法和应用，具体涉及一种基于膜保护和控冰的低毒性冻存液及其制备方法和在卵母细胞冷冻保存中的应用。

背景技术：

1、冷冻保存技术是将细胞、组织或器官等生物样品置于超低温环境中，使其代谢速率大大降低甚至停止，以达到长期存储的目的，并能在解冻后恢复其生理功能的科学与技术。当前，年轻肿瘤患者、生育力低下患者以及不孕不育患者尤其女性患者伴随的卵巢早衰和卵巢功能丧失引发的生育难题亟需解决。依赖于卵母细胞、精子及胚胎冷冻保存的辅助生殖技术(art)的发展，不仅仅可以满足适龄女性的生育需求，而且可以进一步缓解人口出生率下降的压力、并优化人口结构。值得注意的是，不同于胚胎冷冻存在的部分伦理、宗教及法律问题，卵母细胞冷冻保存适用面更加广泛，可以使女性能够做出更适合自己的生育选择。卵母细胞是当前最难冻存的细胞种类之一，因为其尺寸在百微米级，比表面积低，含水量高，因而其对细胞内结冰的敏感性极高，伴随的冻存损伤也更加严重。

2、玻璃化是当前卵母细胞冻存较高效的保存手段。基于二甲基亚砜(dmso)和乙二醇(eg)的有机小分子冷冻保护剂具有很好的细胞渗透性，在降温过程中，这类小分子可以跨膜置换出部分胞内水分，同时基于氢键与水分子的相互作用，可以使胞质发生玻璃化，避免溶质过度积累和胞内冰晶形成，进而使细胞免受致命损伤。但是dmso、eg等渗透性小分子作为cpa发挥作用时也具有明显不足之处。当生物大分子外层的大量“结合水”通过强氢键作用被dmso键合时，其水化壳层将遭到破坏进而会导致结构不稳定，甚至直接不可逆地损伤亚细胞结构(如线粒体、微管和微丝等)，严重时还会破坏细胞间隙连接。含有超过2％w/w的dmso的冷冻保护剂可明显损害细胞的内部结构，导致蛋白聚集，严重时会对基因组造成损伤，同时对卵母细胞具有表观遗传毒性。同时，临床实施效果存在“三低一高”(存活率低、临床妊娠率低、活产率低，而流产率高)的瓶颈难题。然而，现有冻存技术一直存在高浓度化学分子(eg，dmso)产生的细胞化学毒性和解冻复苏过程出现冰晶造成细胞机械损伤的问题，导致卵母细胞可使用率受限。同时，细胞膜作为卵母细胞和精子作用的界面，维持冷冻保存中其结构功能稳定性至关重要，而当前研究往往忽视对细胞膜的保护。因此，主动性的细胞膜保护协同冰晶生长抑制，同时降低dmso等渗透性cpa浓度的玻璃化技术将是未来优化卵母细胞玻璃化冻存的有效解决途径。

技术实现思路

1、为改善上述现有技术的缺陷，本发明提供一种冷冻保存液，包括：膜保护分子、控冰材料、渗透性两亲离子型分子、水溶性二糖、dmso、乙二醇和血清。

2、根据本发明的实施方案，所述膜保护分子选自锌盐，例如为葡萄糖酸锌，在水溶液中可以电离出二价金属锌离子，起到低温下细胞膜流动性保护的作用。

3、根据本发明的实施方案，以每100ml冷冻保存液计，所述锌盐中锌离子的含量为0.001g-0.0325g，优选为0.0065g-0.0325g，例如为0.001g、0.002g、0.003g、0.005g、0.0065g、0.008g、0.01g、0.0162g、0.02g、0.025g或0.0325g；最佳为0.0162g。

4、根据本发明的实施方案，所述控冰材料选自聚乙烯醇(pva)。

5、在一些实施方式中，所述pva的分子量为5-50kda分子量，水解度为85-99％，起到抑制升降温过程中冰晶生长的作用。

6、根据本发明的实施方案，以每100ml冷冻保存液计，所述pva的含量为0.3-1g，例如为0.3g、0.5g、0.7g或1.0g，最佳为0.5g。

7、根据本发明的实施方案，所述渗透性两亲离子型分子选自甜菜碱。甜菜碱是一种季铵盐，广泛存在于动植物和微生物中，起到渗透性跨膜调节渗透压，维持玻璃化水平的作用。

8、根据本发明的实施方案，以每100ml冷冻保存液计，所述甜菜碱的含量为3-10g，例如为3g、5g、7g或10g，最佳为5g。

9、根据本发明的实施方案，所述水溶性二糖可以为蔗糖、海藻糖和麦芽糖中的至少一种；优选为蔗糖。

10、根据本发明的实施方案，以每100ml冷冻保存液计，所述水溶性二糖的含量为10～20g，示例性为10g、12g、15g、17.12g或20g。

11、根据本发明的实施方案，以每100ml冷冻保存液计，所述dmso含量为0～10ml，示例性为1ml、2ml、5ml、8ml或10ml。

12、根据本发明的实施方案，以每100ml冷冻保存液计，所述乙二醇含量为5～15ml，示例性为5ml、8ml、10ml、12ml或15ml。

13、根据本发明的实施方案，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清(fbs)或牛血清白蛋白。

14、根据本发明的实施方案，以每100ml冷冻保存液计，所述血清含量为15～30ml，示例性为15ml、20ml或30ml。

15、根据本发明的实施方案，所述冷冻保存液还包括基础溶液。本发明中，所述基础溶液的用量不做具体限定，可以根据需要调整至所需用量。优选地，所述基础溶液为水溶液，可以选自pbs溶液(phosphate buffer saline)和hepes溶液中至少一种。

16、根据本发明的实施方案，所述冷冻保存液的ph值在6.5-7.5的范围内，较佳为7.0-7.4，例如为7.0、7.2或7.4。

17、根据本发明的实施方案，以每100ml体积计，所述冷冻保护液含有：锌盐，其中，锌离子的含量为0.0065g-0.0325g；pva，0.3-1g；甜菜碱，3-10g；水溶性二糖，17.12g；dmso，5ml；乙二醇，10ml；血清，20ml；余量为基础溶液。

18、本发明还提供上述冷冻保存液的制备方法，所述制备方法包括将膜保护分子、控冰材料、渗透性两亲离子型分子、水溶性二糖、dmso、乙二醇和血清加入基础溶液中，得到所述冷冻保存液。所述膜保护分子、控冰材料、渗透性两亲离子型分子、水溶性二糖、dmso、乙二醇和血清具有如上文所述的含义和用量选择。

19、根据本发明的实施方案，所述冷冻保存液的制备方法如下：

20、步骤一：使用基础溶液稀释血清；

21、步骤二：将pva加热溶解于基础溶液，配制pva母液；

22、步骤三：将膜保护分子、渗透性两亲离子型分子和水溶性二糖溶解于步骤一所得溶液中；

23、步骤四：将步骤二pva母液加入至步骤三所得溶液中，并加入dmso和eg，最终余量用基础溶液补齐。

24、根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括步骤五，将步骤四所得冷冻保存液过滤，优选地所述过滤可选用本领域已知的方法进行，例如使用0.22μm的过滤器过滤。

25、示例性地，以每100ml冷冻保存液计，制备方法如下：

26、步骤一：使用基础溶液pbs，稀释胎牛血清(fbs)至20％v/v，至少100ml备用；

27、步骤二：将pva加入基础溶液pbs中加热溶解，配制20x pva母液；

28、步骤三：将甜菜碱、葡萄糖酸锌和蔗糖溶解于步骤一所得溶液中；

29、步骤四：取步骤二所得20x pva加入至步骤三溶液中，最终得到1x pva；加入dmso和eg；最终余量用步骤一基础溶液补齐至100ml；

30、步骤五：将步骤四所得冷冻保存液使用0.22μm的过滤器过滤。

31、本发明还提供上述冷冻保存液在冻存哺乳动物的卵母细胞中的应用。

32、本发明还提供一种冻存方法，所述冻存方法包括使用上述冷冻保存液冻存哺乳动物的卵母细胞。

33、本发明还提供一种保护细胞膜的方法，所述方法采用上述冷冻保存液通过维持低温下细胞膜流动性达到避免细胞膜冷冻保存损伤的目的，实现安全高效的卵母细胞冷冻保存。

34、根据本发明的实施方案，所述细胞膜主要来自对膜损伤敏感的生物样本，例如为细胞、组织或器官。

35、根据本发明的实施方案，所述对膜损伤敏感的细胞选自高度分化的细胞、具有分化能力的细胞和肿瘤细胞系中的至少一种。

36、优选地，所述高度分化的细胞例如选自成熟的卵母细胞、角膜内皮细胞等。优选地，所述具有分化能力的细胞包括但不限于造血干细胞、间充质干细胞等。优选地，所述肿瘤细胞系例如选自小鼠淋巴瘤细胞等。示例性地，所述卵母细胞选自各类哺乳动物提取的处于第二次减数分裂中期的卵母细胞，已经排出第一极体。

37、根据本发明的实施方案，所述生物样本来自昆虫、动物、植物，较佳是哺乳动物。优选地，所述哺乳动物例如选自大鼠、小鼠、牛、猪、兔、猴和人类等中的至少一种。

38、本发明的有益效果：

39、本发明提供一种针对低温膜保护和控冰材料的卵母细胞玻璃化冷冻保存液，能够实现成熟mii卵母细胞的高效保存，并维持复苏前后细胞膜的膜流稳定性。对比商品化试剂，以新鲜组为对照，本发明的冷冻保存液能够保持卵母细胞的结构功能和遗传稳定性。本发明通过添加金属锌离子实现膜状态保护，pva的引入增加了冻存体系的玻璃化能力和控冰作用，而甜菜碱小分子的加入还可以进一步改善渗透压，本发明的冷冻保存液将传统冻存液中的dmso浓度从15％降低至5％，将传统冻存液中的eg浓度从15％降低至10％，从而大大降低冷冻保存液的毒性问题。