原卟啉原氧化酶的用途的制作方法

本发明涉及植物分子生物学，特别是涉及一种原卟啉原氧化酶赋予植物对ppo抑制剂产生耐受性的用途。

背景技术：

1、卟啉生物合成途径用于合成在植物代谢中起重要作用的叶绿素和血红素，并且该途径发生在叶绿体中。在该途径中，原卟啉原氧化酶(简称ppo)催化原卟啉原ix氧化成原卟啉ix。在原卟啉ix产生之后，原卟啉ix通过镁螯合酶与镁结合来合成叶绿素，或通过铁螯合酶与铁结合来合成血红素。

2、在植物中，ppo是除草剂的重要靶点。当ppo活性受到抑制时，叶绿素和血红素的合成亦受到抑制，并且底物原卟啉原ix离开正常的卟啉生物合成途径，导致原卟啉原ix从叶绿体快速输出到细胞质，并被氧化为原卟啉ix，累积在细胞膜上。累积的原卟啉ix在光和氧分子的存在下产生高反应性的单线态氧(1o2)，它们能够破坏细胞膜并迅速导致植物细胞死亡。基于该原理，已经开发出许多抑制ppo活性的除草剂，主要包括嘧啶二酮类(pyrimidinediones)、n-苯基酰亚胺类(n-phenylphthalimides)、三唑啉酮类(triazolinones)、二苯醚类(diphenyl-ethers)、噁唑烷二酮类(oxazolidinediones)、苯基吡唑类(phenylpyrazoles)、噁二唑类(oxadiazoles)、噻二唑类(thiadiazoles)和其他不同化学结构的除草剂。

3、为了在使用ppo抑制剂时防止这些除草剂对植物生长产生影响，以下方法可用于使植物耐受ppo抑制剂：(1)过量表达敏感性ppo，使得鉴于此酶的动力学常数，在植物中产生相对于除草剂足够的靶酶量，以致尽管存在ppo抑制剂，但这些敏感性ppo与该ppo抑制剂是充分作用的，从而具有足够的可供使用的功能性酶。(2)提供一种功能性ppo(简称ippo)，该功能性ppo对除草剂或其活性代谢物是较不敏感的，但其保留了催化原卟啉原ix氧化为原卟啉ix的性质。(3)使用可以将除草剂或其活性代谢物转化成无毒产物的酶，将除草剂脱毒。

4、随着ppo抑制剂的使用，已经出现针对特定种类的ppo抑制剂产生抗性的杂草，本领域需要针对更多ppo抑制剂提供耐受性的新方法。此外，研究表明，虽然一些ippo可以针对一类ppo抑制剂赋予或增强植物的耐受性/抗性，但是这些ippo可能不足以针对多种ppo抑制剂赋予或增强不同作物具有商业化应用水平的耐受性/抗性。因此，需要开发向不同植物赋予耐受多种类型ppo抑制剂的新ippo以满足农业生产的需要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种原卟啉原氧化酶的用途，所述原卟啉原氧化酶能够赋予植物对ppo抑制剂产生较好的耐受性。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种控制杂草的方法，包括将含有有效剂量ppo抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物至少产生原卟啉原氧化酶，所述转基因植物与其他不产生所述原卟啉原氧化酶的植物相比表现出增产和/或减弱损伤，所述原卟啉原氧化酶与seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性；

3、优选的，所述原卟啉原氧化酶具有seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；

4、更优选的，所述转基因植物为草甘膦耐受性植物，所述杂草为草甘膦抗性杂草。

5、进一步地，所述转基因植物还产生至少一种不同于所述原卟啉原氧化酶编码序列的第二种多核苷酸序列；

6、优选的，所述第二种多核苷酸序列编码选自以下组中至少一种蛋白质：抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、选择标记蛋白质、影响植物产量的蛋白质、分解活性蛋白质、合成活性蛋白质、雄性不育蛋白质和影响植物品质的蛋白质；

7、更优选的，所述第二种多核苷酸序列编码草甘膦-n-乙酰转移酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶、草甘膦氧化还原酶、α酮戊二酸依赖性双加氧酶、草铵膦乙酰转移酶、麦草畏单加氧酶、草甘膦脱羧酶、乙酰乳酸合酶或细胞色素类蛋白质。

8、为实现上述目的，本发明还提供了一种产生耐受ppo抑制剂植物的方法、保护植物免受由ppo抑制剂引起损伤的方法或赋予植物对ppo抑制剂产生耐受性的方法，包括向植物的基因组中引入编码原卟啉原氧化酶的核酸分子以获得目的植物，当含有有效剂量ppo抑制剂的除草剂施加到至少存在所述目的植物的田地中，所述目的植物与其他不含有编码所述原卟啉原氧化酶的核酸分子的植物相比表现出增产和/或减弱损伤，所述原卟啉原氧化酶与seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性；

9、优选的，所述原卟啉原氧化酶具有seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；

10、更优选的，所述向植物的基因组中引入编码原卟啉原氧化酶的核酸分子以获得目的植物包括：将获得的所述目的植物自交，或者将获得的所述目的植物作为第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码所述原卟啉原氧化酶的核酸分子的植物繁殖体。

11、为实现上述目的，本发明还提供了一种增强植物对ppo抑制剂耐受性的方法，包括向具有ppo抑制剂耐受性的植物基因组中引入编码原卟啉原氧化酶的核酸分子以获得目的植物，当含有有效剂量ppo抑制剂的除草剂施加到至少存在所述目的植物的田地中，所述目的植物与其他不含有编码所述原卟啉原氧化酶的核酸分子的植物相比表现出增产和/或减弱损伤，所述原卟啉原氧化酶与seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性；

12、优选的，所述原卟啉原氧化酶具有seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；

13、更优选的，所述向具有ppo抑制剂耐受性的植物基因组中引入编码原卟啉原氧化酶的核酸分子以获得目的植物包括：将获得的所述目的植物自交，或者将获得的所述目的植物作为第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码所述原卟啉原氧化酶的核酸分子的植物繁殖体。

14、为实现上述目的，本发明还提供了一种培养耐受ppo抑制剂植物的方法，包括：

15、种植至少一个植物繁殖体，所述植物繁殖体至少产生原卟啉原氧化酶；

16、使所述植物繁殖体长成植株；

17、将含有有效剂量ppo抑制剂的除草剂施加到至少包含所述植株的田地中，收获与其他不产生所述原卟啉原氧化酶的植物相比表现出增产和/或减弱损伤的植株；

18、所述原卟啉原氧化酶与seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性；

19、优选的，所述原卟啉原氧化酶具有seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列。

20、为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草生长的种植组合，包括含有有效剂量ppo抑制剂的除草剂和至少一种转基因植物，所述转基因植物至少产生原卟啉原氧化酶，当含有有效剂量ppo抑制剂的除草剂施加到至少存在所述转基因植物的田地中，所述转基因植物与其他不产生所述原卟啉原氧化酶的植物相比表现出增产和/或减弱损伤，所述原卟啉原氧化酶与seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性；

21、优选的，所述原卟啉原氧化酶具有seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；

22、更优选的，所述转基因植物为草甘膦耐受性植物，所述杂草为草甘膦抗性杂草。

23、进一步地，所述转基因植物还产生至少一种不同于所述原卟啉原氧化酶编码序列的第二种多核苷酸序列；

24、优选的，所述第二种多核苷酸序列编码选自以下组中至少一种蛋白质：抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、选择标记蛋白质、影响植物产量的蛋白质、分解活性蛋白质、合成活性蛋白质、雄性不育蛋白质和影响植物品质的蛋白质；

25、更优选的，所述第二种多核苷酸序列编码草甘膦-n-乙酰转移酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶、草甘膦氧化还原酶、α酮戊二酸依赖性双加氧酶、草铵膦乙酰转移酶、麦草畏单加氧酶、草甘膦脱羧酶、乙酰乳酸合酶或细胞色素类蛋白质。

26、为实现上述目的，本发明还提供了一种原卟啉原氧化酶在制备具有ppo抑制剂耐受性植物中的用途，所述原卟啉原氧化酶与seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性；

27、优选的，所述原卟啉原氧化酶具有seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；

28、更优选的，所述原卟啉原氧化酶在制备具有ppo抑制剂耐受性植物中的用途包括将含有有效剂量ppo抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物至少产生所述原卟啉原氧化酶，所述转基因植物与其他不产生所述原卟啉原氧化酶的植物相比表现出增产和/或减弱损伤。

29、进一步地，所述ppo抑制剂包括嘧啶二酮类ppo抑制剂、n-苯基酰亚胺类ppo抑制剂、三唑啉酮类ppo抑制剂、二苯醚类ppo抑制剂、噁唑烷二酮类ppo抑制剂、苯基吡唑类ppo抑制剂、噁二唑类ppo抑制剂和/或噻二唑类ppo抑制剂；

30、优选的，所述ppo抑制剂包括苯嘧磺草胺、氟丙嘧草酯、丙炔氟草胺、唑草酮和/或乙氧氟草醚。

31、在上述技术方案的基础上，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；优选的，所述双子叶植物包括苜蓿、菜豆、花椰菜、甘蓝、胡萝卜、芹菜、棉花、黄瓜、茄子、莴苣、甜瓜、豌豆、胡椒、西葫芦、萝卜、油菜、菠菜、大豆、南瓜、番茄、拟南芥、花生或西瓜；所述单子叶植物包括玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、粟、甘蔗、燕麦或草坪草。

32、在上述技术方案的基础上，所述含有有效剂量ppo抑制剂的除草剂还包括草甘膦除草剂、草铵膦除草剂、禾本科除草剂、植物生长素类除草剂、发芽前选择性除草剂和/或发芽后选择性除草剂。

33、示例性的，嘧啶二酮类ppo抑制剂包括但不限于：氟丙嘧草酯(cas#:134605-64-4)、苯嘧磺草胺(cas#:372137-35-4)、双苯嘧草酮(cas#:158755-95-4)、氟嘧硫草酯(cas#:1220411-29-9)、[(3-{2-氯-4-氟-5-[3-甲基-2,6-二氧代-4-(三氟甲基)-3,6-二氢嘧啶-1(2h)-基]苯氧基}-2-吡啶基)氧基]乙酸乙酯(epyrifenacil，cas#:353292-31-6)、1-甲基-6-三氟甲基-3-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2h-苯并[1,4]嗪-6-基)-1h-嘧啶-2,4-二酮(cas#:1304113-05-0)、3-[7-氯-5-氟-2-(三氟甲基)-1h-苯并咪唑-4-基]-1-甲基-6-(三氟甲基)-1h-嘧啶-2,4-二酮(cas#:212754-02-4)、氟尿嘧啶(flupropacil，cas#:120890-70-2)。n-苯基酰亚胺类ppo抑制剂包括但不限于：丙炔氟草胺(cas#:103361-09-7)、吲哚酮草酯(cas#:142891-20-1)和氟烯草酸(cas#:87546-18-7)。三唑啉酮类ppo抑制剂包括但不限于：唑草酮乙酯(cas#:128639-02-1)、唑啶草酮(cas#:68049-83-2)、甲磺草胺(cas#:122836-35-5)、酰苯草酮(cas#:173980-17-1)和唑草酮(cas#:128621-72-7)。二苯醚类ppo抑制剂包括但不限于：苯草醚(cas#:74070-46-5)、草枯醚(cas#:1836-77-7)、治草醚(cas#:145350-09-0)、氯氟草醚(cas#:188634-90-4)、氟磺胺草醚(cas#:72178-02-0)、乙氧氟草醚(cas#:42874-03-3)、乳氟禾草灵(cas#:77501-63-4)、甲氧除草醚(cas#:32861-85-1)、三氟羧草醚(cas#:50594-66-6)及其盐和酯、甲羧除草醚(cas#:42576-02-3)、乙羧氟草醚(cas#:77501-90-7)、氟硝磺酰胺(cas#:77227-69-1)、氟除草醚(cas#:13738-63-1)、呋氧草醚(cas#:80020-41-3)、氟乳醚(cas#:131086-42-5)、三氟甲草醚(cas#:42874-01-1)。噁唑烷二酮类ppo抑制剂包括但不限于：环戊噁草酮(cas#:110956-75-7)。苯基吡唑类ppo抑制剂包括但不限于：异丙吡草酯(cas#:174514-07-9)和吡草醚(cas#:129630-19-9)。噁二唑类ppo抑制剂包括但不限于：丙炔噁草酮(cas#:39807-15-3)和噁草酮(cas#:19666-30-9)。噻二唑类ppo抑制剂包括但不限于：嗪草酸甲酯(cas#:117337-19-6)和噻二唑草胺(cas#:123249-43-4)。其他类ppo抑制剂包括但不限于：氟哒嗪草酯(cas#:188489-07-8)、双唑草腈(cas#:158353-15-2)、氟唑草胺(cas#:190314-43-3)、三氟草嗪(cas#:1258836-72-4)。

34、在一个具体的实施例中，苯嘧磺草胺和氟丙嘧草酯属于嘧啶二酮类ppo抑制剂，苯嘧磺草胺的化学名称为n'-[2-氯-4-氟-5-(3-甲基-2,6-二氧-4-(三氟甲基)-3,6-二氢-1(2h)-嘧啶)苯甲酰]-n-异丙基-n-甲基硫酰胺，为浅褐色挤条颗粒状固体，可制成70％水分散颗粒剂型。苯嘧磺草胺可有效防治多种阔叶杂草，包括对草甘膦、als和三嗪类产生抗性的杂草，其具有很快的灭生作用且土壤残留会降解迅速。氟丙嘧草酯的化学名称为2-氯-5-[1,2,3,6-四氢-3-甲基-2,6-二氧-4-(三氟甲基)嘧啶-1-基]苯甲酸-1-(丙烯氧基羰基)-1-甲基乙基酯，为无色粉状固体，可用于防治禾本科杂草、一年生和多年生阔叶杂草。

35、在另一个具体的实施例中，丙炔氟草胺属于n-苯基酰亚胺类ppo抑制剂，化学名称为2-[7-氟代-3,4-二氢-3-氧代-4-(2-丙炔基)-2h-1,4-苯并嗪-6-基]-4,5,6,7-四氢-1h-异吲哚-1,3(2h)-二酮，为幼芽和叶片吸收型ppo抑制剂，常用剂型为50％可湿性粉剂和48％悬浮剂。丙炔氟草胺可有效防治1年生阔叶杂草和部分禾本科杂草，其在环境中易降解，对后茬作物安全。

36、在另一个具体的实施例中，唑草酮属于三唑啉酮类ppo抑制剂，化学名称为(rs)-2-氯-3-[2-氯-5-(4-二氟甲基-4,5-二氢-3-甲基-5-氧-1h-1,2,3,-三唑-1-基)-3-氟苯基]丙酸乙酯，原药外观为粘性黄色液体。唑草酮主要用于防除阔叶杂草和莎草，其对磺酰脲类除草剂产生抗性的杂草也具有很好的活性。

37、在另一个具体的实施例中，乙氧氟草醚属于二苯醚类ppo抑制剂，化学名称为2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-三氟甲基苯，为白色-橙色或红色-棕色结晶固体，是一种超低用量、低毒、高选择性、芽前芽后触杀型ppo抑制剂，可制成乳油使用。杂草主要通过胚芽鞘、中胚轴吸收药剂致死，适用于水稻、大豆、小麦、棉花、玉米、油棕、蔬菜及果园等。乙氧氟草醚可用于防除阔叶杂草及某些禾本科杂草，包括但不限于，如鸭跖草、稗草、莎草、田菁、雀麦、狗尾草、曼陀罗、匍匐冰草、豚草、刺黄花捻、苘麻、田芥菜等。

38、ppo抑制剂可施加到包含本发明提供的植物和种子的植物生长区域用于控制杂草。除草剂施用量可以是推荐的商业比率(1x，1倍大田浓度)或其任何分数或倍数，在生长季节可由范围约0.1x至约30x的商业比率组成。商业比率单位为酸当量/磅/英亩(lb ae/英亩)、酸当量/克/公顷(g ae/ha)、磅活性成分/英亩(lb ai/英亩)或克活性成分/公顷(gai/ha)。

39、本发明中除草剂的施用量随土壤结构、ph值、有机物含量、耕作系统和杂草的大小而变化，并且通过查看除草剂标签上合适的除草剂施用量来确定。

40、提供以下描述和定义是为了更好地限定本发明以及指导本领域普通技术人员实践本发明。除非另有说明，术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。

41、本发明中使用的冠词“一个”和“一种”是指一个(种)或多于一个(种)(即至少一个)。例如，“一种要素”表示一种或多种要素(元件)。

42、本发明中术语“包含”或其变体，例如“包含了”、“包含着”或“包括”、“包括了”，是指包括所述的要素、整数或步骤，或成组的要素、整数或步骤，但是不排除任何其他要素、整数或步骤，或者成组的要素、整数或步骤。

43、本发明中术语“重组”是指由基因工程引起并且通常不存在于自然界中的非天然发生的dna、蛋白质、细胞、种子或生物体。“重组dna分子”是指包含在自然界中非天然地发生并且由人类干预产生的dna分子，如由彼此异源的至少两个dna分子构成的dna分子。其中，“基因工程”是指创造通常不存在于自然界中并且需要施加人类干预的非天然dna、蛋白质或生物体。基因工程可用于使用生物技术，如分子生物学、蛋白质生物化学、细菌转化、以及植物转化中的一种或多种技术以构思并创造的工程dna、蛋白质或生物体。

44、本发明中术语“转基因”是指由于人类干预(例如植物转化方法、基因编辑技术)合并入生物体基因组中的dna分子。

45、本发明中术语“异源的”是指来自不同的来源。在dna的背景下，“异源的”是指任何外来的“非自身”dna，包括来自相同种类的另一个植物的dna。例如，在本发明中，可以利用转基因的方法在大豆植物中表达大豆ppo基因，该大豆ppo基因仍被认为“异源的”dna。

46、本发明中术语“序列”是指核苷酸或氨基酸的顺序排布。术语“转基因表达”、“蛋白质表达”是指通过将dna分子转录为信使rna(mrna)并且将mrna翻译为多肽链(其最终折叠为蛋白质)以产生蛋白质。

47、本发明中术语“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。本发明中所述“有效连接”可以为将调控序列与编码本发明所述ippo的多核苷酸序列相连，使得编码本发明所述ippo的多核苷酸序列的转录受到所述调控序列控制和调控。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供dna转移和/或整合功能的序列(即t-dna边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。

48、选择本发明载体中的调控序列是本领域技术人员所熟知的。所述调控序列包括但不限于启动子(例如camv 35s启动子、玉米ubi启动子、水稻gos2基因的启动子等)、转运肽(例如靶向叶绿体的转运肽等)、终止子(例如nos基因的多聚腺苷酸化信号序列、pinⅱ基因的多聚腺苷酸化信号序列、e9基因的多聚腺苷酸化信号序列等)、增强子(例如camv增强子、fmv增强子、mmv增强子等)、前导序列(例如tmv前导序列、mdmv前导序列、马铃薯y病毒组前导序列等)、内含子(例如玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、cat-1内含子等)以及其它有效连接到编码本发明所述ippo的多核苷酸序列的调控序列。

49、本发明中术语“dna构建体”是包含两个或更多个异源的dna序列的重组dna分子。dna构建体可用于转基因表达并且可包含在载体和质粒中。dna构建体可用于载体中以用于转化的目的，即将异源dna引入到宿主细胞中，以产生转基因细胞和植物，并且还可包含在转基因细胞、植物或其部分、种子的质粒dna或基因组dna中。“植物转化载体”典型地含有包含t-dna转移(如左边界和右边界)所需的顺式作用序列的质粒载体、经工程改造成能够在植物细胞中表达的选择性标记、和目的基因，此质粒载体上也存在细菌复制所需的序列，将顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达的方式进行排列。例如，所述选择性标记基因和杀有害生物基因位于左边界和右边界之间。如本领域所理解的，所述“植物转化载体”含有允许通过农杆菌感染植物细胞、以及通过在边界序列切割进行dna的转移和vir介导的dna转移的毒力功能(vir基因)(hellens和mullineaux,trends in plantscience,(2000)5：446-451)。

50、用于转化宿主植物细胞的适合方法包括可将dna引入到细胞中(例如将重组dna构建体稳定地整合到植物染色体中)的任何方法是本领域熟知的。用于将重组dna构建体引入到植物中的示例性的且广泛利用的方法是本领域技术人员熟知的土壤杆菌转化系统。用于将重组dna构建体引入到植物中的另一种示例性方法是通过定点整合的方法将重组dna构建体插入到预先确定的位点处的植物基因组中。定点整合可通过本领域已知的任何方法来实现，例如通过使用基因编辑技术(如zfn技术、talen技术、crispr技术)来实现。此外，本领域技术人员熟知，应用基因编辑技术还可以对基因组序列(如植物中ppo)进行精确操作，以实现基因定点突变、插入或删除等修饰引入，从而获得希望的转基因植物。转基因植物可通过植物细胞培养方法从转化的植物细胞再生。用于再生植物的方法在本领域也是熟知的。例如，已经利用ti质粒载体用于传送外源dna，以及直接dna摄入、脂质体、电穿孔、显微注射以及微弹。

51、本发明中术语“肽”以及“蛋白”、“蛋白质”在本发明中可互换地使用，指的是氨基酸残基的聚合物。所述氨基酸残基的聚合物中的一个或多个氨基酸残基是一个相应的天然存在的氨基酸的一种人工化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。本发明的蛋白可以重组产生，也可以通过化学合成。

52、本发明中术语“氨基酸”是指天然氨基酸、合成氨基酸以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸。氨基酸类似物包括但不限于经过后来修饰的天然氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。在本发明中可以公知的3字母符号或iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号指代氨基酸。

53、提供功能上相似的氨基酸保守性取代是本领域技术人员所熟知的，以下五组各自包含彼此保守性取代的氨基酸：脂肪族：甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)；芳香族：苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；含硫的：甲硫氨酸(m)、半胱氨酸(c)；碱性的：精氨酸(r)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)；酸性的：天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)。

54、本发明中术语“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”或“核酸序列”在本发明中可互换地使用，包括涉及的单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物(例如肽核酸)，因为它们以一种类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。

55、由于遗传密码子的简并性，多种不同的核酸序列可以编码相同的氨基酸序列。产生编码相同或基本相同的蛋白的可替代核酸序列在本领域技术人员的能力内，因此本发明包括因遗传密码子的简并性而编码相同或基本相同氨基酸序列的不同核酸序列。所述“基本相同”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响其功能活性的序列，亦包括保留活性的片段(“活性片段”)。

56、本发明中术语“功能活性”或“活性”指本发明用途的蛋白质/酶(单独或与其它蛋白组合)具有催化原卟啉原ix氧化为原卟啉ix的性质且在一种或多种ppo抑制剂的存在下表现出除草剂不敏感的能力。产生本发明所述ippo的植物优选产生“有效剂量”的蛋白质，从而在用ppo抑制剂处理植物时，蛋白质表达的水平足以给予植物对ppo抑制剂(若无特别说明则为一般用量)完全或部分的耐受性。可以以通常杀死靶标植物的用量、正常的大田用量和浓度使用ppo抑制剂。优选的，本发明的植物细胞和植物被保护免受ppo抑制剂处理引起的生长抑制或损伤。本发明的转化植物和植物细胞优选具有ppo抑制剂的耐受性，即转化的植物和植物细胞能在有效量的ppo抑制剂存在下生长。

57、本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、变体蛋白质、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。

58、本发明中术语“变体”是指实质上类似的序列。一种变体包括在本发明所述多核苷酸或蛋白之内的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失和/或添加和/或替换。本发明中“变体蛋白质”是指相对于正规序列或野生型序列或参考序列，通过在本发明所述ippo中的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失或添加和/或替换而衍生的一种蛋白质。本发明涵盖的变体蛋白质是保留其功能活性的，即仍具有本发明所述的原卟啉原氧化酶活性和/或对ppo抑制剂耐受性。变体蛋白质可以产生于例如遗传多态性或产生于人工干预。本发明包括与本发明所述ippo氨基酸序列中的任一个具有至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性并且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白。例如，变体蛋白质可以是在本发明任一所述ippo氨基酸序列的n和/或c末端缺失了一个或多个(如1-50个、1-25个、1-10个、1-5个或4、3、2、1个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。

59、通常，“序列同一性”指两个最佳比对的dna或氨基酸序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的比对窗口整个范围内不变的程度。测试序列和参考序列(本发明核苷酸序列或氨基酸序列)的已比对区段的“同一性分数”是由两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即完整的参考序列或参考序列的更小限定的部分)中组分的总数目。“同一性％”是同一性分数乘以100。例如可从national center for biotechnologyinformation(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得blast运算法则，使用默认参数确定。

60、本发明中，“野生型”是指天然发生的、相似的但是不同的版本。“野生型核酸分子”或“野生型蛋白”是核酸分子或蛋白质的天然发生的版本，即预先存在于自然界中的核酸分子或蛋白质的版本。“野生型植物”是与转基因植物相同类型的非转基因植物，并且与具有除草剂耐受性性状的转基因植物在遗传上不同。

61、本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

62、本发明中术语“植物”包括全株、植物地上部营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)及其子代。可用于本发明方法的植物类别一般来说可宽泛至可经受遗传转化技术的高等和低等植物类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。其包括各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。

63、本发明中术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由之再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物簇以及在植物或以下植物的部分中完整的植物细胞，这些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药等。

64、本发明中术语“植物繁殖体”包括但不限于植物有性繁殖体和植物无性繁殖体。所述植物有性繁殖体包括但不限于植物种子；所述植物无性繁殖体是指植物体的营养器官或某种特殊组织，其可以在离体条件下产生新植株；所述营养器官或某种特殊组织包括但不限于根、茎和叶，例如：以根为无性繁殖体的植物包括草莓和甘薯等；以茎为无性繁殖体的植物包括甘蔗和马铃薯(块茎)等；以叶为无性繁殖体的植物包括芦荟和秋海棠等。

65、本发明所述ippo可应用于多种植物中，所述双子叶植物包括但不限于苜蓿、菜豆、花椰菜、甘蓝、胡萝卜、芹菜、棉花、黄瓜、茄子、莴苣、甜瓜、豌豆、胡椒、西葫芦、萝卜、油菜、菠菜、大豆、南瓜、番茄、拟南芥、花生或西瓜；优选的，所述双子叶植物是指黄瓜、大豆、拟南芥、烟草、棉花、花生或油菜。所述单子叶植物包括但不限于玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、粟、甘蔗、燕麦或草坪草；优选的，所述单子叶植物是指玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、粟、甘蔗或燕麦。

66、本发明所述ippo可以通过遗传转化技术在宿主生物体中表达。本领域所公知的遗传转化技术，包括但不限于农杆菌介导法、基因枪法、微量发射轰击、直接将dna摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导dna导入。

67、本发明术语“除草剂”是指用来杀死、控制或不利地调节植物生长的活性成分。该除草剂的优选量或浓度是“有效剂量”或“有效浓度”，所述“有效剂量”或“有效浓度”足够杀死相似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞，或者抑制其生长，但是所述“有效剂量”或“有效浓度”不杀死本发明具有ppo除草剂耐受性/抗性的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞，或者不严重抑制其生长。一般地，除草剂的“有效剂量”或“有效浓度”是农业生产系统中例行用来杀死目的杂草的量，这种量是本领域技术人员已知的。术语“ppo抑制剂”或“ppo除草剂”是靶向并抑制原卟啉原氧化酶的酶活性的化学品，ppo除草剂是本领域熟知的并且是可以商业购买获得的。

68、本发明术语“耐受性”或“抗性”是可遗传的，并允许植物在ppo抑制剂对给定植物进行一般除草剂有效处理的情况下生长和繁殖。正如本领域技术人员所认可的，即使给定植物受到ppo抑制剂处理的一定程度损伤，如很少的坏死、溶解、萎黄或其它损伤，但至少没有在产量上有显著影响，仍可认为给定植物具有抵抗ppo抑制剂诱导的各种程度损伤的提高的能力，而在同样的ppo抑制剂剂量下一般导致相同基因型野生型植物损伤。本发明中“赋予或增强植物对ppo抑制剂产生耐受性/抗性”是指向不具有ppo抑制剂耐受性/抗性的植物提供耐受性/抗性，和/或增强具有ppo抑制剂耐受性/抗性的植物的耐受性/抗性。

69、本发明中“除草剂不敏感的”是指在一种或多种ppo抑制剂的存在下，ppo维持其酶活性中的至少一部分的能力。ppo的酶活性可通过本领域已知的任何手段来测量，例如在一种或多种ppo抑制剂的存在下通过荧光、高效液相色谱法(hplc)或质谱法(ms)测量原卟啉原氧化酶产物的生成量或原卟啉原氧化酶底物的消耗量来测定酶活性。除草剂不敏感性可以是对于特定除草剂的完全或部分不敏感性，并且可表达为对于特定ppo抑制剂的耐受性或不敏感性百分比(％)。如本发明所述ippo不仅保留了催化原卟啉原ix氧化为原卟啉ix的活性，而且在一种或多种ppo抑制剂的存在下表现出除草剂不敏感性。

70、本发明术语“控制”和/或“防治”是指至少将有效剂量的ppo抑制剂直接施用(例如通过喷雾)到植物生长环境中，使杂草发育最小化和/或停止生长。同时，耕种的转基因植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培育以用于产物的消耗和/或生成；优选的，与野生型植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。所述具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的茎秆抗性、和/或提高的籽粒重量等。本发明所述ippo对杂草的控制和/或防治作用是可以独立存在的，不因其它可控制和/或防治杂草的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物(含有本发明所述ippo的编码dna序列)的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，所述ippo和/或可控制和/或防治杂草的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响所述ippo对杂草的控制和/或防治作用，也不能导致所述控制和/或防治作用完全和/或部分由所述另一种物质实现，而与所述ippo无关。其中，“杂草”是指在植物生长环境中与耕种的转基因植物竞争的植物。

71、本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞、以及植物部分还可以包含一种或多种额外的性状。额外的性状可以通过将包含编码本发明所述ippo的多核苷酸序列的转基因植物与包含一种或多种额外的性状的另一株植物杂交来引入。其中，术语“性状”是指从特定的序列或序列组得到的表型。术语“杂交”是指培育两株个体植物以产生子代植物。两株植物因此可杂交以产生包含来自每个亲本的所希望的性状的子代。术语“子代”是指亲本植物的任何世代的后代，并且转基因子代包含从至少一株亲本植物遗传的编码本发明所述ippo的多核苷酸序列。额外的性状也可以通过将包含该额外性状的dna构建体与包含编码本发明所述ippo的多核苷酸序列的dna构建体(所有dna构建体作为一部分存在于用于植物转化的相同载体上)共转化或通过将额外的性状插入到包含本发明dna构建体(包含编码本发明所述ippo的多核苷酸序列)的转基因植物中或反之亦然(例如，进行植物转化、或在转基因植物或植物细胞上进行基因编辑)来引入。该额外的性状包括但不限于：对于疾病、昆虫以及除草剂的抗性，对于热和干旱的耐受性，缩短作物成熟时间、改进工业加工(例如，用于将淀粉或生物质转化为可发酵的糖类)以及改进的农艺学品质(例如，高油含量和高蛋白含量)。示例性额外的除草剂耐受性性状可以包括对于一种或多种除草剂耐受性(转基因或非转基因)，所述一种或多种除草剂如als抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶和三唑啉酮)、epsps抑制剂(例如草甘膦)、合成生长素(例如苯氧基、苯甲酸、羧酸和缩氨基脲)、光合作用抑制剂(例如三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑和脲)、谷氨酰胺合成抑制剂(例如草铵膦)、hppd抑制剂(例如异唑、吡唑啉酮和三酮)、以及长链脂肪酸抑制剂(例如氯乙酰胺、氧乙酰胺和吡唑)等。示例性额外的昆虫抗性性状可以包括对于鳞翅目、鞘翅目、半翅目、以及同翅目等中的一个或多个目内的一种或多种昆虫的抗性。

72、除草剂施加可与一种、两种ppo除草剂、或多种ppo除草剂的组合或任何其他相容的除草剂顺序地混合或罐装混合。组合的或单独的一种、两种或更多种除草剂的多次施加可在生长季节用于包含本发明的转基因植物的区域以用于控制广泛范围的双子叶杂草、单子叶杂草、或两者，例如，两次施加(如种植前施加和出苗后施加、或出苗前施加和出苗后施加)或三次施加(如种植前施加、出苗前施加和出苗后施加、或出苗前施加和两次出苗后施加)。

73、使用本发明所述ippo的编码dna序列转化的细胞可在将此细胞再生为转基因植物之前或之后针对所述ippo的编码dna序列或ippo酶活性的存在进行选择。可以通过识别包含所述ippo的编码dna序列或ippo酶活性、和/或相对于其他同基因对照植物表现出改变的性状(例如对于ppo抑制剂的耐受性)，对转基因植物进行选择。

74、包含本发明耐受ppo除草剂的转基因性状的转基因植物和子代包括在本发明中并可以在本领域已知的任何培育方法下使用。在具有两种或更多种转基因性状的植物株系中，转基因性状可以在具有两种或更多种转基因性状的植物株系中独立地分离、连接、或两者的组合。本发明还涵盖与亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交，无性繁殖亦然。用于不同性状和作物的培育方法是本领域技术人员熟知的。可以进行各种测定以确认特定植物或种子中转基因的存在，测定方法包括分子生物学测定，如southern和northern印迹、pcr、和dna测序；生物化学测定，如通过免疫手段(elisa和蛋白质印迹)或通过酶功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，如叶或根测定；以及分析整株植物的表型。

75、可以通过回交转育的方法将转基因性状整合到植物基因型中。转基因性状所整合到的植物基因型可称为回交转育基因型、株系、近交体、或杂交体，类似地，缺少所需转基因性状的植物基因型可称为非转育基因型、株系、近交体、或杂交体。

76、本发明中所述种植组合是指植物、其显示的任一种除草剂耐受性和/或在植物发育的不同阶段可用的除草剂处理的组合。当可用的除草剂施加到所述植物上，所述植物与其他不具有该种除草剂耐受性的植物相比表现出增产和/或减弱损伤。

77、本发明提供了一种原卟啉原氧化酶的用途，所述ippo能够赋予植物对多种类型的ppo抑制剂产生优良的耐受性或显著增强植物对ppo抑制剂的耐受性，尤其对苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺、唑草酮和乙氧氟草醚表现出4倍大田浓度的耐受性，以及对氟丙嘧草酯表现出2倍大田浓度的耐受性，在植物上应用前景广阔。

78、下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。