一种寒葱种质资源圃营建与核心种质保存方法

本发明属于种质资源保护与利用，更具体地说，涉及一种寒葱种质资源圃营建与核心种质保存方法，尤其适用于东北寒葱分布区种质资源的系统化收集、标准化保存、科学化评价与高效化利用。

背景技术：

1、寒葱，别名茖葱、野生韭菜，是百合科葱属多年生草本植物，以嫩叶和假茎为主要食用部位。寒葱富含维生素c、硫化物和氨基酸等营养成分，同时含有多种药用活性物质。

2、伴随寒葱产业快速发展，野生寒葱资源面临过度采挖压力，优良种源面临消失风险，遗传多样性保护形势日趋严峻。种质资源是作物育种和农业可持续发展的物质基础，建立科学规范的寒葱种质资源圃，开展系统化的种质资源收集、保存和评价利用研究，对于保护寒葱遗传多样性和促进产业可持续发展具有重要战略意义。然而，现有寒葱种质资源保护技术仍存在诸多缺陷，主要存在以下问题：

3、第一，传统分株繁殖方式繁殖系数低、周期长，无法满足大规模种质资源保存的需求，单个鳞茎繁殖系数仅为1至2倍。

4、第二，野生寒葱携带病毒和类病毒的问题未被充分重视，长期分株繁殖导致病毒在体内不断积累，种性退化严重。现有文献报道，葱属作物常见的病毒包括洋葱黄矮病毒（oydv）和葱x病毒（lenv）等，感染率可达30%~50%。

5、第三，超低温保存过程中茎尖褐变问题突出，常规保存方法复苏率仅40%~50%，再生植株存活率仅70%~80%。

6、第四，种质资源评价多采用单一性状选择方法，未建立针对寒葱特性的多维评价体系。

7、第五，缺乏寒葱特异性分子标记辅助评价技术，无法准确评估种质资源的遗传多样性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种寒葱种质资源圃营建与核心种质保存方法，以提高繁殖效率、解决病毒积累问题、提高超低温保存复苏率、建立科学的评价体系，为寒葱产业的可持续发展提供种质资源保障。

2、为了达到上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

3、本发明的第一方面，提供了一种寒葱茎尖超低温保存联合用抗氧化预处理液，包括预处理培养基和褐变抑制剂；其中，预处理培养基为含7mg/l 6-ba的ms培养基；褐变抑制剂为含3% pvp和0.8g/l抗坏血酸的混合水溶液或含0.8%半胱氨酸和0.8g/l柠檬酸钠的混合水溶液。

4、本发明的第二方面，提供了一种寒葱茎尖超低温保存方法，包括以下步骤：

5、1）抗氧化预处理：取茎尖分生组织，接种于预处理培养基中光照培养18h，培养后，将茎尖分生组织转入褐变抑制剂处理20min，再经消毒后，得到超低温保存材料；

6、2）脱水处理：将超低温保存材料在包埋液中处理30min，弃去包埋液，加入pvs3处理液处理30min，然后迅速投入液氮罐中保存；

7、其中，预处理培养基为含7mg/l 6-ba的ms培养基；褐变抑制剂为含3% pvp和0.8g/l抗坏血酸的混合水溶液或含0.8%半胱氨酸和0.8g/l柠檬酸钠的混合水溶液。

8、优选方案下，光照培养的温度为25±1℃，光照强度为2000lux；褐变抑制剂的处理温度为15至20℃；包埋液的组分包括0.7mol/l蔗糖、2.0mol/l甘油和0.1mol/l脯氨酸；pvs3处理液的组分包括30%甘油、15%乙二醇和15% dmso。

9、本发明的第三方面，提供了一种寒葱种质资源圃营建与核心种质保存方法，包括以下步骤：

10、s1、采集与病毒前置检测：在寒葱主要分布区采集优株，采集过程中使用抗氧化剂进行抗氧化处理；同步采集样本进行病毒检测，根据病毒检测结果建立种质健康档案，无病毒或低病毒含量种质直接入圃，高病毒含量种质经茎尖培养脱毒后入圃；

11、s2、圃址选择与整地作畦：选取有机质含量大于2.5%的弱酸性至中性土壤为圃址；深翻土壤20~25cm，施基肥，基肥以腐熟有机肥为主，配合使用磷铵复合肥；作畦时，作成畦宽为1.3m、畦高为18cm的高畦，畦间步道宽为45cm；

12、s3、鳞茎快速繁殖：培育采用鳞茎切块繁殖技术；

13、s4、田间管理：种质定植后前两年在5月至7月高温期搭设遮光度为50%至70%的荫棚；种质萌发期追施硫酸钾型复合肥，定植生长期后期施用腐熟农家肥；种质定植后一周内保持土壤湿润，成活后根据墒情适量浇水或排水；

14、s5、核心种质多维评价：以各种质的形态学性状、营养品质、抗逆性状和ssr分子标记为评价指标，采用层次分析法确定各定性指标的权重，并结合ssr分子标记分析进行遗传多样性评价，根据综合评价得分排序，将排名前25%的种质列为核心种质；

15、s6、茎尖超低温保存：采用上述的寒葱茎尖超低温保存保存方法对茎尖分生组织进行抗氧化预处理，得到超低温保存材料；超低温保存材料经包埋、脱水后迅速放入投入液氮罐中保存。

16、优选方案下，步骤s1中，病毒检测采用的方法为rt-pcr法或elisa法，检测对象为洋葱黄矮病毒和葱x病毒进行检测；其中，rt-pcr法中，用于检测洋葱黄矮病毒的引物包括如seq id no:1所示的oydv-f和如seq id no:2所示的oydv-r；用于检测葱x病毒的引物包括如seq id no:3所示的lenv-f和如seq id no:4所示的lenv-r。

17、优选方案下，步骤s1中，抗氧化剂为含0.2g/l抗坏血酸和0.08g/l柠檬酸的混合水溶液；茎尖培养脱毒处理包括切取0.3~0.5mm茎尖，接种于含0.5mg/l 6-ba和0.1mg/l naa的ms培养基，暗培养7天后转光培养，3次继代后病毒检测确认为阴性方可入圃。

18、优选方案下，步骤s3中，鳞茎切块繁殖技术包括：选择鳞茎直径不小于2cm、重量不小于5g的植株作为繁殖材料，剥除外层干枯鳞叶后纵切为4~6块，每块保留1~2个芽眼，切块大小为鳞茎纵径的1/4至1/6；切口涂抹多菌灵可湿性粉剂500倍液进行杀菌处理5~10min；将切块芽眼朝上平铺于催芽基质上催芽，催芽基质为珍珠岩、蛭石、泥炭土按体积比为1:1:1混合，催芽温度为15~20℃，湿度为70%~80%；芽长2~3cm时移栽至育苗基质，育苗基质为草炭土、珍珠岩、蛭石按体积比3:1:1混合，育苗30~45天后定植于异位保存区，株行距为10cm×10cm。

19、优选方案下，步骤s5中，评价指标中，形态学性状包括株高、叶长、叶宽、分蘖数和单株鲜重；营养品质包括叶绿素spad值、维生素c含量、可溶性糖含量、硫化物含量；抗逆性状包括越冬存活率和病害抗性；ssr分子标记包括遗传多样性指数和特异标记位点；

20、其中，形态学性状权重为0.36、营养品质权重为0.25、抗逆性权重为0.17、ssr分子标记权重为0.22；

21、具体地，株高权重为0.09、叶长权重为0.06、叶宽权重为0.05、分蘖数权重为0.05、单株鲜重权重为0.06；叶绿素spad值权重为0.08、维生素c权重为含量0.07、可溶性糖含量权重为0.05、硫化物含量权重为0.05；越冬存活率权重为0.10、病害抗性权重为0.05；遗传多样性指数权重为0.12、特异标记位点权重为0.10。

22、优选方案下，步骤s6中，茎尖超低温保存包括取茎尖分生组织，接种于预处理培养基中光照培养18h，培养后，将茎尖分生组织转入褐变抑制剂处理20min，再经消毒后，得到超低温保存材料；将超低温保存材料在包埋液中处理30min，弃去包埋液，加入pvs3处理液处理30min，然后迅速投入液氮罐中保存；

23、步骤s6还包括超低温保存茎尖的解冻复苏，具体包括：将冻存的超低温保存材料在40℃水浴2min，经无菌水洗涤后接种于含0.5mg/l 6-ba和0.1mg/l naa的ms培养基中暗培养3d，然后转为光培养。

24、优选方案下，上述寒葱种质资源圃营建与核心种质保存方法，还包括以下步骤：

25、种子超低温保存：采集成熟种子置于硅胶干燥器中4℃干燥7天，种子含水量控制在8%至12%，每2ml冷冻管装50至100粒，封口膜密封后投入液氮罐保存；

26、分子身份证构建：对核心种质材料进行基因组dna提取，采用ssr标记进行基因型分析，选择15至25个多态性高、稳定性好的分子标记位点构建分子身份证，分子身份证格式为"标记名称-等位基因片段大小"的组合编码；

27、病虫害防治措施：主要病害锈病于发病初期喷施15%三唑酮可湿性粉剂1000倍液每隔7天一次连续2至3次；软腐病及时拔除病株用生石灰处理病穴并喷施72%农用硫酸链霉素可溶性粉剂3000倍液；主要虫害葱蝇于成虫发生期悬挂黄色粘虫板并用50%辛硫磷乳油1000倍液灌根。

28、本发明的有益效果

29、其一，提高繁殖效率。采用鳞茎切块快速繁殖技术，单个鳞茎可产生3~5个有效芽苗，繁殖系数达3~5倍，显著高于传统分株繁殖的1~2倍，缩短了种质资源扩繁周期。

30、其二，解决病毒积累问题。通过在采集环节即进行病毒前置检测，建立种质健康档案，对高病毒含量种质进行茎尖培养脱毒处理后再保存，有效解决了长期困扰寒葱种质保存的病毒积累问题。

31、其三，提高超低温保存成活率。通过引入6-苄基氨基嘌呤预处理结合褐变抑制剂处理的复合预处理方案，有效解决了茎尖超低温保存过程中易发生的褐变问题，茎尖保存复苏率可达73%~83%，较常规方法提高20%~30%。

32、其四，提高评价科学性。通过建立包含形态学性状、营养品质、分子标记、抗逆性状四个维度的多维评价体系，采用层次分析法结合ssr分子标记分析进行综合评价，核心种质筛选更加科学合理。

33、综上所述，本发明解决了现有技术繁殖效率低、病毒积累、复苏率低等问题，为寒葱产业可持续发展提供了资源保障。