一种细胞长期保存方法与流程

本发明属于细胞生物学，具体涉及一种细胞长期保存方法。

背景技术：

1、细胞采用包含卡波姆、蛋白酶抑制剂、细胞通透剂、防腐剂以及缓冲成分的凝胶包裹，凝胶包裹后的目标细胞直接进行保存或者放入石蜡中包埋，获得细胞蜡块保存。采用该方法固定的细胞可以不脱水、透明、包埋，直接4℃保存可保存至少1个月的时间。

2、但是在经过4℃保存超过2个月后，细胞的表达开始变弱，当保存时间超过3个月后，部分细胞开始转为阴性，单纯冷藏难以达到更长保存期的要求。

3、面对现有技术中细胞样本无法长期保存的问题，因此，亟需一种可以长期冷冻保存细胞的方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题中的至少一种，本发明提供了一种细胞长期保存方法。

2、为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：

3、一种细胞长期保存方法，包括如下步骤：

4、s1、获得目标细胞，对其进行固定预处理：用多聚甲醛浸润，同时加入防腐剂、细胞通透剂和蛋白酶抑制剂共同作用，pbs清洗；

5、s2、将固定预处理后的目标细胞均匀分散在凝胶中形成凝胶包裹；所述凝胶中包含卡波姆、甘油、乙醇、细胞通透剂、防腐剂以及缓冲成分；

6、s3、凝胶包裹后的目标细胞直接-20℃冷冻保存。

7、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s1固定预处理中，防腐剂为叠氮钠，苯扎氯铵和proclin系列防腐剂中的一种，防腐剂质量体积分数0.01%-0.1%；细胞通透剂为dmso，体积分数为0.005%-0.02%；蛋白酶抑制剂的体积分数为0.005-0.05%。

8、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s2凝胶中，卡波姆的质量体积分数为0.0167%。

9、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s2凝胶中，甘油的体积分数为29.16%-37.5%。

10、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s2凝胶中，细胞通透剂为dmso，dmso体积分数为0.00417%-0.0417%。

11、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s2凝胶中，防腐剂为叠氮钠、苯扎氯铵和proclin系列防腐剂中的一种；防腐剂质量体积分数0.00833%-0.0334%。

12、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s2凝胶中，乙醇的体积浓度为16.67%。

13、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s2凝胶中，缓冲成分为pbs缓冲液、tris-hcl缓冲液中的一种。

14、本发明的第二方面提供了一种细胞质控品，采用第一方面所述的方法制备得到。

15、本发明还提供了采用第一方面所述的方法保存的细胞在免疫组化中的应用，方法取包裹细胞的凝胶，加入无水乙醇充分混匀，离心去除凝胶后用pbs重悬离心清洗后获得细胞，取细胞直接点样进行免疫组化染色或者将凝胶包裹的细胞包埋成细胞蜡块，切片后获得石蜡切片，石蜡切片脱蜡，采用无水乙醇溶解凝胶后获得细胞，取细胞点样进行免疫组化染色。

16、本发明的有益效果

17、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

18、本发明提供了一种可长期保存细胞的方法，该方法是在固定预处理环节加入防腐剂、细胞通透剂和蛋白酶抑制剂，配合包含卡波姆、甘油、乙醇、细胞通透剂、防腐剂以及缓冲成分的凝胶对目标细胞进行包裹，使得在低温环境下蛋白性质更加稳定，细胞能保存更长的时间。

19、凝胶中甘油的加入，不影响凝胶成型，并且使得细胞在温度更低的环境下仍能不改变其物理性能维持原有形态和作用。

20、在经过采用本申请的细胞保存方法处理后，细胞能够固定快速，细胞间的均匀分散和形态好，方便去除凝胶直接使用细胞。使用该方法固定的细胞可以不脱水、透明、包埋，直接在-20℃保存长达3个月以上，细胞表达稳定不变，并且背景染色低。同时在使用时也不需要抗原修复的过程，节省时间，提高效率。

1.一种细胞长期保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种细胞长期保存方法，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠，苯扎氯铵和proclin系列防腐剂中的一种；所述步骤s1固定预处理中，防腐剂质量体积分数0.01%-0.1%；所述步骤s2凝胶中，防腐剂质量体积分数0.00833%-0.0334%。

3.根据权利要求1所述的一种细胞长期保存方法，其特征在于，所述细胞通透剂为dmso，所述步骤s1固定预处理中，dmso体积分数为0.005%-0.02%；所述步骤s2凝胶中，dmso体积分数为0.00417%-0.0417%。

4.根据权利要求1所述的一种细胞长期保存方法，其特征在于，所述步骤s1固定预处理中，蛋白酶抑制剂的体积分数为0.005-0.05%。

5.根据权利要求1所述的一种细胞长期保存方法，其特征在于，所述步骤s2凝胶中，卡波姆的质量体积分数为0.0167%。

6.根据权利要求1所述的一种细胞长期保存方法，其特征在于，所述步骤s2凝胶中，甘油的体积分数为29.16%-37.5%。

7.根据权利要求1所述的一种细胞长期保存方法，其特征在于，所述步骤s2凝胶中，乙醇的体积浓度为16.67%。

8.根据权利要求1所述的一种细胞长期保存方法，其特征在于，所述步骤s2凝胶中，缓冲成分为pbs缓冲液、tris-hcl缓冲液中的一种。

9.一种细胞质控品，其特征在于：采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到。

10.根据权利1-8任一项所述的方法保存的细胞在免疫组化中的应用。