一种基于H型DNA纳米结构荧光适配体传感器的制备方法

一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法
技术领域
1.本发明属于生物传感器检测技术领域，具体涉及一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法。


背景技术：

2.近年来，许多农产品和饲料中容易受到黄曲霉毒素的污染，由于其高毒性而对人类和动物健康具有潜在危害。其中黄曲霉毒素b1（afb1）是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的毒素，已知具有遗传毒性、免疫毒性、致畸性、致癌性和致突变毒性作用。因此被世界卫生组织癌症研究机构划（iarc）定为i类天然存在的致癌物质。根据食品法典委员会的规定，食品中黄曲霉毒素污染总量的最高水平限量在10-15 μg/kg，国家标准（gb2761-2005）规定的最大允许含量为5.0 μg/kg。afb1可通过受污染的食物和动物饲料进入食物链，对人类健康产生危害，由于其耐热性较强，常规的食品加工方法很难消除afb1的危害。因此，建立一种操作简便、准确的检测农产品中afb1的方法。
3.目前，常规的afb1检测方法是基于高效液相色谱法（hplc）和液相色谱-质谱（lc-ms）等。这些方法都能够满足对afb1检测的高灵敏度和选择性。但是，hplc和lc-ms方法受限于昂贵的仪器和繁琐的样品预处理、技术娴熟的操作人员。基于免疫分析方法例如酶联免疫吸附法（elisa）操作简单、灵敏度高。但是，elisa方法中，对抗原、抗体纯度要求比较高纯化困难且抗体的制备过程较为复杂，同时在运输和储存中也会遇到抗体稳定性的问题。
4.核酸适配体（简称适配体，aptamer）由指数富集配体系统进化（selex）技术筛选而得的特异性靶标结合分子，能够紧密结合并有选择性地靶向目标物。现有技术彭臻菲等人（《基于核酸适配体检测饲料中黄曲霉毒素b1的方法》）利用fam标记的核酸适配体与黄曲霉毒素b1的特异性结合，而与偶联bhq1的互补序列无法配对，导致荧光值变化而实现afb1的检测，该方法展现出了核酸适配体对靶标的高亲和力。相对于抗体而言，核酸适配体具有较高的热稳定性、合成成本低、便于长期储存和运输等优势，已经被广泛应用于细胞成像、疾病治疗与微生物检测等众多方面。基于核酸适配体的检测方法，可避免色谱法和免疫方法的一些局限性。荧光适配体传感器由于操作简单、灵敏度高等优点在化学领域得到了广泛的应用。
5.综上所述，基于核酸适配体的荧光传感器方法具有相对显著的优势，特异性强、操作简单、稳定性好，具有良好的应用前景。


技术实现要素：

6.一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法，按照以下步骤进行：（1）h型dna纳米结构的形成：取一定量的互补链cdna1和cdna2以及置换链zh置于恒温振荡器中孵育一定时间，之后向上述混合液中加入一定量的黄曲霉毒素b1适配体链(afb1-apt)以及不同浓度的黄曲霉毒素b1(afb1)孵育一定时间，最终得到h型dna纳米结构；
（2）荧光适配体传感器的构建：向上述步骤（1）体系中加入一定量淬灭材料，在恒温振荡器中孵育一定时间；当afb1不存在时，afb1-apt产生链置换反应将zh置换下来从而被淬灭材料吸附，发生荧光共振能量转移效应(fret)致使其荧光被淬灭，产生较低的背景信号；当加入afb1时，afb1优先与afb1-apt结合，此时参与形成h型dna纳米结构的zh由于双链结构游离在溶液中维持荧光信号，至此荧光适配体传感器制备完成；最后用缓冲液定容并经涡旋仪充分混合；设置固定激发波长、测量范围和测量电压，用荧光分光光度计记录发射波长的荧光强度；通过加入afb1前后响应信号的变化实现对afb1的定量分析。
7.进一步限定，步骤（1）（2）中，所述zh的序列为5
’‑
aatgtgtgttggttctctctgtc-3’，其中3’端标记的荧光基团为alexa fluor 594、fam、rox、cy3、cy5的一种或多种，优先选择fam。
8.进一步限定，步骤（1）（2）中恒温振荡器处理的条件温度为25~50℃，时间为0.5~2 h。
9.进一步限定，步骤（1）中，所述cdna1的序列为5
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gagacacagagagactgagaagcgcatcacaacacgtcca-3’。
10.进一步限定，步骤（1）中，所述cdna2的序列为5
’‑ꢀ
gagacacagagagatgatgcgcttctcggcaacacgtcca-3’。
11.进一步限定，步骤（2）中，所述的淬灭材料为氧化石墨烯、三维氮掺杂碳纳米片、氮掺杂碳纳米棒、空心碳球中的一种，优先选择空心碳球。
12.进一步限定，步骤（2）中，所述的淬灭材料浓度为0.1~0.5 mg/ml。
13.进一步限定，步骤（2）中，所述缓冲溶液为tris-hcl、pbs、hepes中的一种或两种，优先选择tris-hcl，ph为7.4。
14.与现有技术相比，本发明具有如下显著特点：（1）本发明制备得到具有中空结构的球状碳纳米材料，具有高效率的淬灭能力。
15.（2）本发明利用核酸适配体的强特异性、高亲和力及稳定性好等特点，发明了两条相互结合的h型骨架互补链，可以与zh进行互补杂交，适配体链可以通过链置换反应将zh替代下来，从而构建一种新型的检测afb1的荧光适配体传感器。
16.（3）本发明制备的荧光适配体传感器对afb1的检测具有准确度高、选择性好、响应速度快、线性范围宽、检测限低的特点。同时，对实际样品的检测结果表明所制备的传感器具有良好的实际应用价值。
17.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下为本发明的较佳实施例详细说明。
附图说明
18.图1为本发明荧光适配体传感器的检测原理示意图。
19.图2为实施例1制备传感器在0 ng/ml afb1（点划线）、存在50 ng/ml afb1（虚线）、存在500 ng/ml afb1（实线）时fam的荧光强度。
20.图3为实施例1所构建的传感器在其他干扰毒素存在的情况下对afb1的选择性比较图。
21.图4为实施例1所构建的荧光适配体传感器在实际样品中的应用。
实施方式
22.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容并不局限于下面的实施例。
实施例
23.一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法及其应用，其实现方法如下图1所示。
24.一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）分别吸取10 μl 1 μmol/l cdna1和cdna2以及10 μl 2 μmol/l的zh混合，经涡旋仪充分摇匀，放入37℃恒温振荡器孵育30 min，得到h型dna纳米结构；（2）吸取10 μl 2 μmol/l afb1-apt以及afb1待测溶液加入到上述步骤（1）溶液中充分混合，放入37 ℃恒温振荡器孵育30 min，由于核酸适配体的高特异性使afb1-apt优先与afb1结合，不发生链置换反应使得参与形成h型dna纳米结构中的zh仍然保持双链状态，之后将10 μl 0.25 mg/ml的空心碳球加入上述体系中，放入37 ℃恒温振荡器孵育30 min，即得到荧光适配体传感器；最后再取tris-hcl缓冲液定容并经涡旋仪充分混合，通过荧光分光光度计检测fam的荧光强度。
25.其中，检测荧光强度的具体步骤为：使用微量比色皿盛装待测样，设置荧光分光光度计的激发波长为490 nm，发射波长测量范围510~610 nm，狭缝选择10 nm，测量电压600v。
26.图2为实施例1制备传感器在0 ng/ml afb1（点划线）、存在50 ng/ml afb1（虚线）、存在500 ng/ml afb1（实线）时fam的荧光强度。
27.对比例1一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法，未特别说明的步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤（2）中，先将afb1-apt加入步骤（1）溶液充分混合孵育30 min后，再将afb1待测溶液加入混合溶液中孵育30 min后再测fam的荧光强度。与实施例1相比，测定相同浓度的afb1（50 ng/ml）时的相对荧光强度值明显降低，说明通过调整afb1待测溶液加入顺序，能够增加空白与加标之间的相对荧光强度，提高传感器的灵敏度。
28.对比例2一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法，未特别说明的步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤（2）中，所用的淬灭材料为氮掺杂碳纳米棒，将其加入混合溶液中孵育30 min后再测fam的荧光强度。与实施例1相比，测定相同浓度的afb1（50 ng/ml）时的相对荧光强度值显著降低，表明实施例1中所使用的空心碳球具有更高效率的荧光淬灭效果。
实施例
29.一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法及其应用，其实际应用，包括以下步骤：为了验证所制备的新型荧光生物传感器对afb1有特异性识别作用，将tris缓冲溶液中加入afb1标准品，使样品中afb1的浓度为50 ng/ml；采用tris缓冲溶液分别配置其他9种干扰真菌毒素的标准溶液，浓度均为500 ng/ml，为afb1浓度的10倍。按照实施例1所构建
的检测体系对上述9种不同干扰真菌毒素标准溶液以及它们与afb1的混合样品进行检测，检测结果如图3所示，说明本发明方法对afb1的选择性良好。
实施例
30.一种基于h型dna纳米结构荧光适配体传感器的制备方法及其应用，其实际应用，包括以下步骤：（1）实际样品处理：取0.5 g的加标样品（玉米粉、小麦粉），加入到10 ml 甲醇/水溶液（比例7：3）中，充分混合并震荡20分钟，随后取出进行离心10 min，转速为10000 转/分钟，离心完成后取出上清液得到样品提取液；（2）样品检测：将样品提取液按照实施例1的步骤（1）~步骤（3）操作后测得荧光强度信号，带入标准曲线得到样品中afb1的浓度。每份样品重复测定3次取平均值，计算平均回收率如下表所示：
31.经验证所制备的荧光适配体传感器对afb1的检测具有灵敏度高、线性范围宽、检测限低的特点。同时，对实际样品（如玉米粉、小麦粉）的检测结果表明所制备的传感器的实际应用价值是可靠的。
32.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
33.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。