一种对呼出气冷凝液定位收集并用SERS技术对其亚硝酸盐含量进行原位检测的方法

一种对呼出气冷凝液定位收集并用sers技术对其亚硝酸盐含量进行原位检测的方法
技术领域
1.本发明属于呼出气检测技术领域，具体涉及一种对呼出气冷凝液定位收集并用sers技术对其亚硝酸盐含量进行原位检测的方法。


背景技术：

2.疾病的早期筛查和有效诊疗依赖于对反映某种疾病的生化指标的准确检测。疾病筛查是指用快速、简便、灵敏的检验方法，对一些对人体重要器官造成不可逆伤害或是危及个体生命的疾病的检测，以便对疾病做出早期诊断，结合有效治疗，降低患病率、死亡率。然而，传统的疾病筛查往往依赖于昂贵且笨重的仪器、复杂的采样方法以及整个取样检测过程中医护人员繁琐且熟练的操作等等。常见的例子是癌症检测，通过磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)和电子计算机断层扫描(computed tomography，ct)或通过组织病理学审查进行。mri或ct需要昂贵的仪器，并且仅在大型医院提供，且组织病理学审查耗时久。同样地，传染性病原体通常通过生物或生物分子诊断方法检测，例如培养细胞或聚合酶链反应(pcr)以检测病原体的特定遗传特征。细胞培养物对于细菌感染诊断非常有用，因为它们可以提供额外的信息，例如抗生素耐药性；但是，这种方法需要数天和专门的实验室设置。同样，pcr也需要专门的设置、人员和仪器。这一系列苛刻且繁琐的检测步骤、昂贵的检测费用以及假阳性给人们造成生活的困扰，不仅阻碍了“我要筛查”这种主动的疾病早期筛查观念的普及，而且使得一些怕繁琐的百姓望而却步。因此，亟需开放一种低成本、不依赖大型仪器、易操作同时又能保证检测准确度的检测策略。
3.与耗费人力和时间的传统诊断方法相比，即时检验(point-of-care testing，poct，poct技术是在患者护理附近进行的诊断，是一种新的智能策略，用于在患者需求点进行实时、快速、准确和现场检测)作为一种便携式且用户友好的技术，可以在采样点直接检测，具有诊断速度更快、灵敏度和特异性更高、成本更低、效率和现场检测能力更高的优势。近年来，随着临床医学对现场检测的高需求，特别是在资源贫乏地区，poct技术自出现以来越来越受到关注，poct设备市场巨大。为了实现poct诊断，开发poct检测样本、检测方法和相关poct设备是关键，应给予重视。
4.首先，从检测样本方面考虑，开发新的生物标记物用于家庭护理点的实施，有助于疾病的早期筛查和预防。呼出气冷凝液(exhaled breath condensate，ebc)检测具有无创、简单易操作、可反复进行等优点，同时呼出气冷凝液是一种充满有价值生物分子信息的基质，其中某些成分的显著变化可以反映人体内的病理生理状态，是评估人类健康和环境暴露水平的一种重要生物媒介，有望成为疾病早期筛查、病情监测及疗效判断的新型媒介。公布号cn 102841199 a(申请号201210349966.7)的中国专利文献公开了一种快速诊断流感的方法，其特征是利用特异性抗体修饰的硅纳米线效应晶体管生物传感器实现对呼出气冷凝液中的流感病毒进行检测。但其存在将呼出气冷凝液收集和检测分开，且对呼出气冷凝液进行稀释等步骤，操作耗时繁琐，不利于poct诊断。
5.迄今为止，已经有多种新颖的检测方法用于开发poct诊断，包括电化学生物传感器、荧光生物传感器、比色生物传感器、化学发光生物传感器、基于表面等离子体共振(spr)的生物传感器和磁性生物传感器。其中，基于光学现象的方法非常适合在poct上工作，因为可以进行非接触式测量。poct中最常用的是比色法和荧光法。这两种方法都基于具有宽光谱响应的光学现象，带宽约为100nm。该特性将同时可观察到的峰数限制为两个或三个，从而限制了生物靶标的多重检测。此外，宽光谱分布阻碍了从背景干扰中提取传感器光学响应。相反，拉曼散射是一种光学现象，其振动性质赋予了非常尖锐的光谱特征。尖锐的拉曼峰允许同时检测多种分析物，并清楚地区分背景和拉曼信号。作为一种强大而有效的分析工具，表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering，sers)在可穿戴柔性传感和非侵入性即时检测(poct)医学诊断领域引起了相当大的研究兴趣。通过吸附在纳米结构金属表面上的分子增强拉曼散射的发现是光谱和分析技术史上的一个里程碑。对可靠和稳健的生化传感方法的需求不断增长，这要求传感器技术的不断进步。在过去的二十年中，sers克服了与拉曼光谱相关的固有灵敏度限制，拉曼光谱提供了分子的振动“指纹”光谱，使其在其他光谱技术中独一无二且用途广泛。sers是一种等离子体现象，由于金属纳米颗粒表面散射的放大。放大来自局部表面等离子体共振，这是由特定波长的光相互作用产生的导电带电子的集体振荡。拉曼信号的这种增强或放大允许利用拉曼光谱的功能(例如，多路复用、精度)进行诊断。
6.如今，自新型冠状病毒疫情爆发以来，口罩逐渐生为人们生活中的必需品。文献表明，戴口罩可以降低covid-19的传播，因为人类呼出/吸入的空气可以通过口罩有效过滤。对口罩的使用可以追溯到中世纪，用于佩戴口罩以防止腺鼠疫。在19世纪末和20世纪初，外科口罩被用于减少细菌感染的传播。自2003年sars爆发以来，人们高度重视开发高效口罩来保护医护人员。一般来说，口罩过滤的功效各不相同，取决于所用材料的类型、层数和在脸上的贴合度。不同的口罩提供不同水平的过滤人类呼气气溶胶和可吸入污染物，从打喷嚏飞沫到气态分子。戴口罩还可以防止呼出有害气溶胶和吸入空气污染物。因此，口罩可以成为一种安全、无创采样且具有成本效益的可穿戴工具，用于对各种呼出和吸入的分析物进行直接采样，并为人类健康和环境暴露提供新的见解，并在生命科学、医学和环境健康等许多领域提供了许多新的可能性。公布号cn 113491363 a(申请号：202110449024.5)的中国专利公布了一种用于收集和检测呼出气中飞沫的口罩装置，利用焦耳汤姆逊效应(节流膨胀效应)设计该口罩，可以实现呼出气飞沫收集检测一体化。和已有的用于收集呼出气飞沫的装置类似，都存在装置制备较为复杂、成本较高等问题。本发明基于口罩自身的特殊润湿性实现对呼出气冷凝液的定位收集检测的一体化。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了解决现有疾病检测技术依赖于昂贵仪器、取样及检测步骤繁琐等问题，基于口罩这种类似于纳米布沙漠甲虫的特殊润湿性，提出一种对呼出气冷凝液定位收集并用sers技术对其亚硝酸盐含量进行原位检测的方法，其步骤如下：
8.(1)利用口罩和呼出气的温度差以及口罩的特殊润湿性收集呼出气冷凝液阵列；
9.(2)设计等离子体生物传感器，并根据待测物对等离子体生物传感器进行功能化修饰；
10.(3)利用功能化修饰的等离子体生物传感器对呼出气冷凝液中的亚硝酸盐含量进行检测，通过对特征峰值的信号采集，检测呼出气冷凝液中的亚硝酸盐含量。
11.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中所采用的口罩本体类型可以是但不限于市售的普通医用口罩、医用外科口罩、n95口罩、kn95口罩等，口罩具有类似于纳米布沙漠甲虫背部的超润湿表面，即口罩具有被超疏水区域包围的亲水图案化区域；步骤(1)所述的口罩本体，通常以无纺布、熔喷布、鼻梁条、挂耳带等为原料，然后采用热轧加固的方式成型，因此口罩的无纺布上具有类似于压扁的致密“扁坑”，而这个“扁坑”恰好成了亲水图案化区域，对于液滴有较好的粘附性，可以有效的收集呼出气冷凝液，呼出气冷凝液在亲水图案化区域冷凝成核形成小液滴，并凝聚成大水滴。
12.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，利用口罩和呼出气的温度差，从而对呼出气进行冷凝收集，可以采用但不限于以下几种技术方案：
13.(a)将口罩用氮气吹净，装进密封袋，于-15℃～-30℃下冷冻20～40min，取出佩戴10～30min；
14.(b)设计用于收集和冷凝呼出气的口罩装置，包括口罩本体1，挂耳2，制冷囊泡3，制冷囊泡3设置于口罩外部靠近口鼻的位置，囊泡里一半区域装有制冷剂，一半区域装有水，两个区域用热封通道隔开，当对制冷囊泡3进行挤压时，热封通道打开，制冷剂和水反应后吸热产生降温效果，再佩戴10～30min；
15.(c)在冬天(-20℃～10℃)的室外，佩戴口罩10～30min。
16.作为上述技术方案的优选，步骤(2)中等离子体生物传感器可以是但不限于利用微量氯离子刻蚀-多元醇方法制备的银纳米立方体胶体溶液，制备步骤如下：
17.①
打开油浴锅，设定温度预热到120～160℃至稳定，转速为300～500rpm；
18.②
将2.00～8.00ml乙二醇(色谱纯gc,＞99.0％)置于敞开体系内，在油浴锅内预热0.5～2h，至体系的温度达到设定的温度且保持稳定，反应体系内的水分被蒸出；
19.③
向上述敞开体系内加入1.00～1.50ml、1～5mm盐酸的乙二醇溶液反应8～15min；即向多元醇还原反应体系中引入微量氯离子，氯离子与体系中的氧结合形成具有强还原性的clo-，目的是为了后续步骤中与体系中多元醇还原产生的反应性高的银纳米粒子将其氧化为ag

重新参与反应至形成成核较好的银纳米立方体，从而起到选择性蚀刻的作用，当cl-浓度较低时，体系中cl-与孪晶银的蚀刻反应不够充分，导致产物中孪晶银的比例增加，最终会产生更多的ag纳米柱、ag纳米线、ag纳米棒等不规则形状；当cl-浓度较高时，溶液中的ag

容易生成更多的agcl析出物，从而影响ag纳米立方的形成；
20.④
称取0.1500～0.5000g pvp k30溶解在10.00～30.00ml乙二醇溶液中，再称取0.1500～0.5000g agno3溶解在10.00～30.00ml乙二醇溶液中，避光保存；
21.⑤
将步骤
④
配好的pvp k30的乙二醇溶液和agno3的乙二醇溶液以0.45～0.90ml/min的速率各加入2.00～4.50ml到步骤
③
的反应体系中，在pvp k30的辅助下，在敞开体系下反应20～24h成核，这种敞开的有氧体系使得氯离子氧化成次氯酸根，刻蚀掉孪晶晶种，将其氧化为ag

重新参与反应至形成成核较好的银纳米立方体；然后将反应体系封闭，继续反应生长至溶液变红褐色，得到银纳米立方体胶体的乙二醇溶液；
22.⑥
将步骤
⑤
所得的银纳米立方体胶体的乙二醇溶液离心去除上清液，然后用丙酮离心清洗3～5次后去除上清液，再用去离子水离心清洗3～5次后去除上清液，从而将银纳
米立方体从乙二醇中洗出来；离心的转速为1500～3900rpm，离心的时间为15～30min；最后将得到的银纳米立方体胶体再分散在3～5ml去离子水中，得到银纳米立方体胶体溶液，银纳米立方体胶体的粒径为30～250nm。
23.作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，对传感器件进行功能化修饰，即将银纳米立方体尿素功能化，进而对亚硝酸盐进行特异性检测。亚硝酸盐含量的检测原理：尿素被探索用作反应性sers探针来测定亚硝酸盐离子，因为尿素在1003cm-1
处仅呈现一个主要的sers峰。通过一步重氮反应，在酸性介质中加入亚硝酸盐离子，触发尿素产生n2和co，这将降低尿素的拉曼信号。具体功能化修饰方法如下：
24.将银纳米立方体胶体溶液和10-2
～10-4
m尿素溶液按体积比1：0.5～4混合后孵育3～8h，然后离心去除上清液；再用去离子水洗涤3～5次后去除上清液；最后分散在3.0～6.0ml、0.05～0.2m hcl溶液中，得到分散在酸性介质中的尿素修饰的银纳米立方体胶体溶液，其中尿素修饰的银纳米立方体胶体的浓度为0.0070～0.0141g/ml。
25.作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，具体检测方案为：移取2.5～5.0μl分散在酸性介质中的尿素修饰的银纳米立方体溶液滴加在收集的体积为1.0～2.5μl的呼出气冷凝液阵列上，晾干后直接用于拉曼检测；该检测是在便携式bwtek btr-111拉曼光谱仪(b&w tek inc.)上完成的，单色激光器的激光波长为532nm，激光功率为4.5
×
10-5
w～1.60mw。
26.作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，也可以根据待测物中的其他生物标记物(谷胱甘肽、葡萄糖)的检测对生物传感器进行功能化修饰，从而实现对一些疾病的早期诊断。
27.作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，利用功能化的生物传感器器件对呼出气冷凝液中的生物标记物结合不同的检测手段进行检测，如比色等分析技术，实现对生物标记物的双/多模式的检测，进而实现对疾病的早期筛查。
28.本发明所述的一种对呼出气冷凝液定位收集并用sers技术对其亚硝酸盐含量进行原位检测的方法，具有如下有益效果：
29.(1)基底简单易得。口罩的制作成本较低，材料易得，可以大规模、大面积制备；
30.(2)取样简单。利用呼出气和口罩的温度差，直接将呼出气冷凝液收集在口罩上；
31.(3)自定位收集。基于口罩表面的亲水/疏水图案化阵列，当呼出气遇冷时，优先在口罩上亲水区域克服能量势垒形成初始液核，并长大成液滴阵列；
32.(4)微反应器。将功能修饰的金属纳米颗粒胶体溶液作为等离子体生物传感器滴加在呼出气冷凝液液滴上，呼出气冷凝液液滴和功能修饰的金属纳米颗粒的混合，有一个自发的动态搅拌过程，提高了待测物和功能修饰的金属纳米颗粒接触的概率，使得反应更充分；
33.(5)液滴混合的动态蒸发。随着水分的自动蒸发，在溶剂毛细管力的驱动下，纳米粒子间距变小，待测物进入到粒子间隙的概率增大，有利于产生更强的信号，提高检测的灵敏度；
34.(6)浓缩富集作用。口罩表面亲水区域和疏水区域的表面张力差，阻碍了液滴的扩散，有效地避免“咖啡环”效应，提高检测的重复性，同时，疏水性可以使得样品液滴在基底有着较大的接触角，这种浓缩效应有利于进一步提高检测灵敏度。
附图说明
35.图1：本发明所述的一种对呼出气冷凝液定位收集并用sers技术对其亚硝酸盐含量进行原位检测的操作步骤示意图；
36.图2(a)是实施例1中口罩的光学显微镜图片，图2(b)是实施例1中口罩的扫描电子显微镜图片，图2(c)是实施例1中口罩的静态水接触角图片；
37.图3(a)是实施例2中口罩收集呼出气冷凝液的照片，图3(b)是实施例2中口罩收集呼出气冷凝液的光学显微镜图片；
38.图4(a)是实施例3中口罩收集水蒸气的照片，图4(b)是实施例3中口罩收集水蒸气的光学显微镜图片；
39.图5(a)和图5(b)为实施例4中不同倍数下银纳米立方体的扫描电子显微镜图像，图5(c)为银纳米立方体的粒径统计图，图5(d)为银纳米立方体的紫外-可见吸收光谱图；
40.图6(a)为实施例5中将银纳米立方体胶体溶液滴加在口罩上的阵列照片；图6(b)为图6(a)中银纳米胶体溶液干燥后的光学显微镜图片；
41.图7(a)为实施例6中10-7
～10-15
m r6g的拉曼谱图；图7(b)为实施例6中r6g在浓度范围10-7
～10-15
m时609cm-1
处的信号归一化强度的对数值和浓度的对数值的线性关系图；
42.图8(a)为实施例7中同一个口罩上随机在20个亲水点上的r6g(10-7
m)拉曼谱图的瀑布图；图8(b)为实施例7中同一个口罩上随机20个亲水点上的r6g(10-7
m)在609cm-1
处信号强度的柱状图；图8(c)为实施例7中5个不同批次口罩上滴加不同批次的银纳米立方体时r6g(10-7
m)拉曼谱图的瀑布图；图8(d)为实施例7中5个不同批次口罩上滴加不同批次的银纳米立方体时r6g(10-7
m)在609cm-1
处信号强度的柱状图；
43.图9：实施例8中尿素功能化后的银纳米立方体进行拉曼表征的拉曼谱图；
44.图10(a)为实施例9中4.5
×
10-3
～10-6
m亚硝酸盐的拉曼谱图；图10(b)为实施例9中亚硝酸盐在浓度范围为4.5
×
10-3
～10-6
m时1003cm-1
处的信号归一化强度的对数值和浓度的对数值的线性关系图；
45.图11(a)为实施例10中不同浓度亚硝酸盐和亚硝酸盐显色液等体积混合后的uv-vis图；图11(b)为实施例10中亚硝酸盐浓度和其在520nm处吸光度的δa520
nm
线性关系图；
46.图12：为实施例11中2.5μm、4μm、4.5μm、10μm、15μm、15μm、20μm的亚硝酸盐在亚硝酸盐显色功能化的口罩上log(g0/g)和δa520
nm
的线性图，其中：g代表rgb值中的g值，g0是空白样(没有加亚硝酸盐)的g值，g是不同亚硝酸盐的g值，δa520
nm
指不同浓度下显色后和空白样的吸光度差值；
47.图13：为实施例12中尿素功能修饰的银纳米立方体对实际呼出气冷凝液中亚硝酸盐的sers检测谱；
48.图14：为实施例13中该方法用于检测谷胱甘肽(10-2
～10-9
m)和葡萄糖(10-3
m)的sers谱图；分别对应图14(a)和图14(b)；
49.图15：实施例14中简易的呼出气冷凝液收集口罩示意图。
50.如图1所示，一种对呼出气冷凝液定位收集并用sers技术对其亚硝酸盐含量进行原位检测的方法主要包括以下步骤：(a)收集呼出气冷凝液；(b)滴加尿素功能化银纳米立方体胶体溶液；(c)蒸发浓缩后进行原位raman检测。首先将从冰箱冷冻后的带有亲水图案化区域的口罩取出佩戴上，利用呼出气和口罩的温度差，呼出气冷凝，先在亲水图案化区域
黏附成核，然后进一步长大成液滴，从而实现了对呼出气冷凝液在亲水图案化阵列上的收集；然后在收集的呼出气冷凝液液滴上直接滴加尿素功能化银纳米立方体胶体溶液，待蒸干后直接进行原位raman检测。其中：ag ncs代表合成的尿素功能化银纳米立方体纳米胶体，analyte droplet代表待测物，laser代表拉曼激光。
51.如图2所示，(a)图是实施例1中口罩的光学显微镜照片片，可见其表面有肉眼可见的约为0.60cm
×
0.70cm的规则方形图案阵列为亲水区域，间距约为0.85cm；(b)图是口罩的扫描电子显微镜图像，从中可以看出，超疏水区域是由随机交织排列的聚丙烯纤维组成，亲水图案化区域的纤维经热轧加固处理后纤维紧密黏结，纤维间的缝隙消失，形成较为平坦的亲水区域；(c)图是该口罩的接触角表征图，在亲水区域滴加2.5μl的去离子水，测得其接触角为148.5
°
，达到了超疏水状态，而这种超高的疏水性得益于超疏水/亲水图案化区域的杂化后亲水区域周围疏水区域对水的排斥作用。
52.如图3所示，是实施例2中在温度为8℃的室外佩戴口罩走20min，保持均匀呼吸不讲话在口罩上收集到的呼出气冷凝液的光学照片，(a)图可以发现在口罩上大范围的收集到了呼出气冷凝液阵列，(b)图是收集的呼出气冷凝液的光学显微镜图片，可以发现呼出气在口罩的方形亲水区域，形成液滴，证明该法确实可以实现对呼出气的冷凝和定位收集。
53.如图4所示，是实施例3中将口罩放在冰箱冷藏30min，接一杯热水于烧杯中，将口罩盖在烧杯上，盖住烧杯口，将冰袋置于口罩上收集液滴20min，(a)图是收集水蒸气阵列的光学照片，(b)图是收集水蒸气阵列的光学显微镜图片，证明该法确实可以实现对蒸汽液滴的定位收集。
54.如图5所示，实施例4中采用多元醇还原法合成的银纳米立方体，(a)(b)图是不同倍数下银纳米立方体的扫描电子显微镜图片，可以发现该法合成的银纳米立方体形貌均匀，且几乎没有其他形貌的银纳米粒子形成，从粒径统计图(图c)可见其直径大约为81.46
±
10.0nm，且在520nm处(图d)有较好的吸收和激光器的激发波长相匹配。
55.如图6所示，(a)图是实施例5中在特殊润湿性口罩上形成的液滴阵列的光学照片，可见该方法为实现高通量检测提供可能性，(b)图是(a)图干燥后的光学显微镜图片，可见干燥后的银纳米立方体均匀地沉积在“扁坑”里，起到了富集浓缩的作用，说明该口罩基底有较好的“限域功”能。
56.如图7所示，是实施例6中以罗丹明6g(r6g)为探针，探究合成的银纳米立方体的sers灵敏性，将2.5μl的10-7
～10-15
m的r6g水溶液分别滴加在口罩亲水区域，再滴加2.5μl银纳米立方体胶体溶液，晾干，进行拉曼测试，得到的不同浓度梯度的拉曼光谱图。从(a)图中可以看出，该银纳米立方体对r6g有较高的检测灵敏性，当r6g的浓度降低至10-15
m时，r6g的特征峰仍然清晰可见，说明该法的sers具有较好的灵敏性，为该法进一步用于实际检测奠定基础，同时(b)图r6g在609cm-1
的信号的对数和罗丹明6g(r6g)浓度的对数呈现较好的线性关系，其相关系数r2高达0.9939，说明该法可以用于定量分析。这种较好的灵敏性得利于银纳米立方体在拉532nm的激光器下产生的表面等离子体效应，而这较高的相关系数得益于口罩被超疏水包围的亲水图案化区域阵列，这种阵列可以将银纳米立方体胶体溶液和罗丹明6g(r6g)分析液滴限制在亲水区域内，随着溶剂的蒸发，它们均匀的沉积在亲水区域内。
57.如图8所示，是实施例7中以罗丹明6g(r6g)为探针，探究将合成的银纳米立方体和
具有亲水图案化区域阵列的口罩相结合的sers基底的检测重复性，我们在口罩上随机取20个亲水区域进行检测，(a)图是在口罩上随机取20个亲水区域进行检测r6g(10-7
m)的raman谱图，可以看出20个光谱的形貌几乎一样，(b)图是(a)图在同一个口罩上随机20个亲水点上的r6g(10-7
m)在609cm-1
处信号强度的柱状图，发现该策略对罗丹明6g(r6g)在609cm-1
处的检测信号的相对标准偏差rsd为6.92％，说明该方法有较好的检测重现性，(c)图是在5个不同口罩上滴加5批不同的银纳米立方体进行sers检测的瀑布图，发现光谱形貌几乎一样，(d)图是(c)图在609cm-1
处的检测信号的柱状图，计算得其相对标准偏差rsd为6.19％，说明该策略具有较高的重复性，可以提高检测的准确性。
58.如图9所示，是实施例8中，由于亚硝酸盐的拉曼散射截面较低，很难直接进行sers检测，因此我们对银纳米立方体进行尿素功能化，即利用一步重氮反应来间接检测的策略：在酸性介质中加入亚硝酸盐离子，可触发尿素产生n2和co，尿素的拉曼信号降低，从而间接的检测亚硝酸盐的含量。因此我们对实施例4合成的银纳米立方体按实施例8进行尿素修饰，并对尿素功能化后的银纳米立方体进行拉曼表征，发现在1003cm-1
出现了尿素的特征峰，证明了银纳米立方体的成功修饰。
59.如图10所示，对应实施例9，从(a)图的光谱图像可以看出，利用尿素功能化后的银纳米立方体可以检测到微摩尔级别的亚硝酸盐，(b)图为利用尿素功能化后的银纳米立方体对不同浓度的亚硝酸盐溶液进行拉曼检测后得到的标准曲线，可见拟合后曲线方程为log i＝-0.16logc 5.33(其中i为sers的归一化信号强度，c代表亚硝酸盐浓度，可以发现信号强度的对数和浓度的对数具有良好的线性关系，且相关系数r2＝0.9997，说明该方法可以用来定量测试呼出气冷凝液中的亚硝酸盐。
60.如图11所示，利用griess显色反应检测亚硝酸盐，(a)可以发现在520nm处的吸光度随着加入的亚硝酸盐浓度的降低而降低，且溶液颜色从深粉色变为淡粉色；(b)图为不同亚硝酸浓度和其在520nm处的吸光度值的线性曲线，其线性拟合方程为：a520
nm
＝0.04926c 0.03821，其中a520
nm
为在520nm处的吸光度值，c为亚硝酸盐的浓度，且该相关系数r2＝0.9948，说明a520
nm
和浓度c具有良好的线性关系，可以用该方法辅助检测亚硝酸盐。
61.如图12所示，为了证明我们所提的策略可以拓展到亚硝酸盐的比色检测，我们将griess反应转移到口罩的亲水区域。简单地说，我们对口罩进行亚硝酸盐显色传感区域功能化。就是取2.5μl实施例10配制的亚硝酸显色试剂在口罩的亲水区域里，干燥后，再滴加2.5μl不同浓度(20，15，10，4.5，4，2.5μm)的亚硝酸盐的标准液，待其干燥后，我们发现随着亚硝酸盐浓度的降低，亲水区域的粉色由深变浅，随后用手机拍下照片，用image j软件进行rgb分析。在image j中，将图像转换为rgb图。由于griess反应的预期着色产物为粉红色，而该产物吸收的互补色为绿色，因此使用rgb图的绿色滤光片来测量图像中粉色的强度。发现虽然beer
–
lambert定律不会普遍适用于彩色溶液的rgb数据，rgb数据的各种变换，可以生成具有适当分辨率的经验标准曲线，用于比色分析。我们这里发现log(g0/g)和δa520
nm
呈线性关系，其线性拟合方程为：δa520
nm
＝1.88 0.052log(g0/g)，r2＝0.9935。其中g0为空白样的g值，g为不同亚硝酸盐浓度下的g值，δa520
nm
扣掉空白后的不同亚硝酸盐浓度溶液的吸光度值。
62.如图13所示，收集了一名健康吸烟者呼出气冷凝液进行sers检测的谱图。研究表明，呼出气冷凝液中的亚硝酸盐含量在健康吸烟的人群中增加。根据谱图对比亚硝酸盐标
准曲线(图10b)，测出其亚硝酸盐含量为3.56μm，同时，将其滴加在亚硝酸盐显色功能化的口罩上，根据g值带入计算(图12)，测出其亚硝酸盐含量为3.41μm；上述实验数据进一步说明本发明所述方法的检测准确性。
63.如图14所示，为了验证该策略有用于检测呼出气冷凝液中其他生物标记物的可能性，我们分别检测了谷胱甘肽和葡萄糖。(a)间接检测谷胱甘肽的sers谱图；利用结晶紫和谷胱甘肽在银纳米立方体上的竞争吸附策略来检测谷胱甘肽，随着谷胱甘肽浓度的增加，结晶紫的sers信号逐渐降低；(b)10-3
m葡萄糖的sers光谱图，虽然用没有修饰的银纳米立方体直接检测葡萄糖只能测到10-3
m，这是因为葡萄糖的拉曼散射截面较低，比较难测，但是为该策略以后进一步对银纳米立方体进行修饰来检测葡萄糖提供了思路和方法。
64.如图15所示，是实施例12中，设计的呼出气冷凝液收集口罩示意图。各部分名称为：口罩本体1、挂耳2、制冷囊泡3。
具体实施方式
65.下面通过实施例来进一步阐明本发明的方法及应用，而不是要用这些实施例来限制本发明。本发明的目的是利用口罩特殊润湿性实现呼出气冷凝液的自定位收集并检测其亚硝酸盐含量的策略。这种策略所用的衬底简单、成本低且检测灵敏度高有利于推进sers在呼出气冷凝液检测的研究。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
66.实施例1
67.先将口罩用氮气吹净，裁取2cm
×
2cm小块进行光学显微镜表征以及扫描电子显微镜表征。光学显微镜照片取自徕卡ez4d显微镜(leica microsystems，德国)，扫描电子显微镜测试是在场发射扫描电子显微镜(su8020，日立，日本)进行的。移取2.5μl去离子水滴加在口罩表面的亲水图案化区域上，进行静态水接触角表征，该测试是在液滴形状分析系统(dsa10 mk2，克鲁斯，德国)进行的。
68.实施例2
69.为了探究这种具有被超疏水包围的亲水图案化的口罩对呼出气冷凝液液滴的收集能力，先将口罩用氮气吹净，装进密封袋，放在冰箱冷藏室(-20℃)冷藏30min后取出，在温度为8℃的室外佩戴口罩，走20min，保持均匀呼吸，不讲话。光学照片采用苹果手机(iphone 12)拍摄。
70.实施例3
71.为了探究这种具有被超疏水包围的亲水图案化的口罩对呼出气冷凝液液滴的收集能力，将口罩放在冰箱冷藏室(-20℃)冷藏30min后取出。接一杯热水于烧杯中，将口罩盖在烧杯上，盖住烧杯口，将冰袋置于口罩上，收集20min。口罩的光学照片苹果手机(iphone 12)拍摄，显微镜照片用徕卡ez4d显微镜(leica microsystems，德国)采集。
72.实施例4
73.利用微量氯离子刻蚀-多元醇方法制备直径为81.46
±
10.0nm的银纳米立方体。
74.①
打开油浴锅，设定温度预热到140℃至稳定，转速为360rpm；
75.②
将5.00ml乙二醇(色谱纯gc,＞99.0％)加入敞开体系预热1h，至体系的温度达到145℃且稳定，反应体系内的水分被蒸出；
76.③
加入1.00ml盐酸的乙二醇溶液(3mm)；
77.④
称取0.3260g pvp k30溶解在20.00ml乙二醇溶液中，再称取0.3193gagno3溶解在20.00ml乙二醇溶液中，避光保存；
78.⑤
步骤
③
加完盐酸10min后，将步骤
④
配好的pvp k30的乙二醇溶液和agno3的乙二醇溶液通过蠕动泵，以0.75ml/min的速率各加入3.00ml到步骤
③
加完盐酸后的反应体系内，在pvp的辅助下成核筛选20h，给圆底烧瓶加上盖子，继续反应生长8h至溶液变红褐色，得到最终产物为银纳米立方体胶体乙二醇溶液；
79.⑥
将步骤
⑤
所得的银纳米立方体胶体乙二醇溶液放在离心管里，用丙酮离心清洗4次后去除上清液，再用去离子水离心清洗4次后去除上清液，从而将银纳米立方体从乙二醇中洗出来；离心的转速3900rpm，离心的时间为30min；最后将得到银纳米立方体胶体分散在5.0ml的去离子水中，得到银纳米立方体胶体溶液；将得到的银纳米立方体进行扫描电子显微镜表征以及光谱测试，该光谱测试是在紫外-可见分光光度计(uv-3600，岛津，日本)进行的。
80.实施例5
81.为了探究口罩这种具有被超疏水区域包围的亲水图案化区域对银纳米立方体胶体溶液的“限域”效果，在口罩的亲水区域分别滴加2.5μl实施例4得到的银纳米立方体胶体溶液，待干燥后观察，用徕卡ez4d光学显微镜采集显微镜图片。
82.实施例6
83.为了探究合成的银纳米立方体的sers灵敏性，以罗丹明6g(r6g)为探针分子，将2.5μl的10-7
～10-15
m的罗丹明6g水溶液分别滴加在口罩亲水“扁坑”上，再滴加2.5μl实施例4得到的银纳米立方体胶体溶液，蒸干后，进行拉曼测试。该测试是在便携式bwtek btr-111拉曼光谱仪(b&w tek inc.)上完成的，单色激发器的激光波长为532nm，激光功率1.6mw。
84.实施例7
85.为了探究口罩作为sers基底的检测重复性，将2.5μl的10-7
m的r6g水溶液分别滴加在口罩上20个亲水区域上，再滴加2.5μl银纳米立方体胶体溶液，晾干，分别进行拉曼测试。为了探究批次的重复性，我们分别在5个不同口罩上2.5μl的10-7
m的r6g水溶液，再滴加2.5μl按照实施例4相同方法合成的5个批次的银纳米立方体，晾干，分别进行拉曼检测。该测试是在便携式bwtek btr-111拉曼光谱仪(b&w tek inc.)上完成的，单色激发器的激光波长为532nm，激光功率1.6mw。
86.实施例8
87.为了检测亚硝酸盐，因此对合成的银纳米立方体进行功能化。银纳米立方体尿素功能化：将实施例4合成的银纳米立方体溶液和10-2
m尿素溶液按体积比1：2混合孵育5h，用去离子水洗涤3次，以3900rpm的转速离心20min，去上清液，最后并分散在5.0ml的hcl水溶液(0.1m)备用。随后取2.5μl功能化后的银纳米立方体溶液于硅片上干燥，进行raman表征。测试是在便携式bwtek btr-111拉曼光谱仪(b&w tek inc.)上完成的，单色激发器的激光波长为532nm，激光功率1.6mw。
88.实施例9
89.将2.5μl的4.5
×
10-3
～10-6
m的亚硝酸盐水溶液分别滴加在口罩亲水“扁坑”，再滴加2.5μl实施例8得到的尿素修饰的银纳米立方体胶体溶液，晾干，进行拉曼测试，该测试是
在便携式bwtek btr-111拉曼光谱仪(b&w tek inc.)上完成的，单色激发器的激光波长为532nm，激光功率1.6mw。
90.实施例10
91.为了检验该专利所述的一种对呼出气冷凝液定位收集并用sers技术对其亚硝酸盐含量进行原位检测的准确性，采用比色的方法进行辅助。首先利用griess反应，配置亚硝酸盐显色试剂：即含有50mm磺胺，330mm柠檬酸，10mm 1-萘胺的溶液，其中试剂为无水甲醇和去离子水混合溶液，体积比为无水甲醇：去离子水＝1：3。然后在玻璃瓶内按体积比为1：1，分别加入不同浓度的亚硝酸盐的标准液和所配置的显色液，随后进行uv-vis表征。
92.实施例11
93.为了将该对亚硝酸盐的检测策略拓展到比色法，从而实现比色-sers双模式检测，我们对口罩进行亚硝酸盐显色传感区域功能化。简单来说就是取2.5μl实施例10配制的亚硝酸显色试剂在口罩的亲水区域里，干燥后，再滴加2.5μl不同浓度(20、15、10、4.5、4、2.5μm)的亚硝酸盐的标准液，待其干燥后，用手机拍下照片，用image j软件进行rgb分析。在image j中，将图像转换为rgb图。由于griess反应的预期着色产物为粉红色，而该产物吸收的互补色为绿色，因此使用rgb图的绿色滤光片来测量图像中粉色的强度。
94.实施例12
95.用自制的呼出气冷凝液收集试管收集一名吸烟男性的呼出气冷凝液，取2.5μl在口罩的亲水区域，再滴加2.5μl实施例8得到的尿素修饰的银纳米立方体胶体溶液，再取2.5μl呼出气冷凝液在口罩的亚硝酸盐显色功能化区域进行显色反应，晾干，进行拉曼测试，该测试是在便携式bwtek btr-111拉曼光谱仪(b&w tek inc.)上完成的，单色激发器的激光波长为532nm，激光功率1.6mw，显色区域的照片用image j软件处理，测量g值。
96.实施例13
97.为了验证该策略也可以根据待测物中的其他生物标记物的检测对生物传感器进行修饰，从而实现对的早期诊断，我们分别对谷胱甘肽和葡萄糖进行测量。为了检测谷胱甘肽，因此对合成的银纳米立方体进行功能化。银纳米立方体的结晶紫功能化：将实施例4合成的银纳米立方体溶液和10-2
m结晶紫溶液按体积比1：2混合孵育5h，用去离子水洗涤3次，以3900rpm的转速离心20min，去上清液，最后并分散在5.0ml去离子水中备用。在口罩上亲水区域先后滴加2.5μl不同浓度的谷胱甘肽溶液和2.5μl功能化后的银纳米立方体溶液，干燥后进行raman表征。测试是在便携式bwtek btr-111拉曼光谱仪(b&w tek inc.)上完成的，单色激发器的激光波长为532nm，激光功率1.6mw。而葡萄糖直接用实施例4得到的银纳米立方体进行raman表征。
98.实施例14
99.设计用于收集和冷凝呼出气的口罩装置，包括口罩本体1、挂耳2、制冷囊泡3，制冷囊泡3设置在口罩外部靠近口鼻的位置，囊泡3里一半装有制冷剂(硝酸铵)，一半装有水，两个区域用热封通道隔开，当对囊泡进行挤压时，热封通道打开，制冷剂遇水吸热产生了降温效果，再佩戴20min。