纤维蛋白水凝胶的制作方法

纤维蛋白水凝胶
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年11月13日提交的美国临时申请系列第63/113,468号的权益。该在先申请的公开内容被认为是本技术的公开内容的部分(且通过引用纳入本技术的公开内容)。
3.背景
1.技术领域
4.本文涉及制造和使用纤维蛋白水凝胶的方法和材料。
5.2.背景信息
6.纤维蛋白是通过作为酶的凝血酶激活纤维蛋白原形成的不溶性生物聚合物。临床上，纤维蛋白已被用作组织胶数十年，最近，纤维蛋白水凝胶已用于各种组织工程应用[参见，例如ahmed等人，tissue engineering part b：reviews(组织工程b部分：综述)，14:199-215)(2008)]。组织胶中较高的纤维蛋白浓度可以促进在实验室中生成高机械强度纤维蛋白水凝胶，但由于纤维蛋白在较高的纤维蛋白原浓度下快速聚合，因此受到限制。因此，难以生产大型或成形的较高机械强度的纤维蛋白水凝胶。


技术实现要素：

[0007]
本文提供了制造和使用纤维蛋白水凝胶的方法和材料。例如，本文提供了纤维蛋白水凝胶，其包含台盼蓝(tb)、伊文斯蓝(eb)和/或它们的一种或多种异构体。在一些情形中，本文提供了包含式(i)的化合物的纤维蛋白水凝胶：
[0008][0009]
或其药学上可接受的盐，其中，r
c1
和r
d1
各自独立地选自h和c
1-3
烷基，或者r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0010][0011]
其中，每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。例如，本文提供了包含式(ii)的化合物的纤维蛋白水凝胶：
[0012][0013]
或其药学上可接受的盐，其中，每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。在一些情况中，具有式(ii)的化合物的组合物或式(ii)的化合物可包括台盼蓝(tb)、伊文斯蓝(eb)
和/或它们的一种或多种异构体。本文还提供了制造和使用包含tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶的方法。在一些情况中，本文提供了制造和使用包含式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶的方法。
[0014]
如本文所证明的，在纤维蛋白凝胶的胶凝混合中包含tb和/或eb使初始胶凝变慢但不会延长最终的胶凝时间，并得到了更加均匀的凝胶。例如，tb和/或eb可用于增加纤维蛋白水凝胶的胶凝时间但不会不利地改变最终的聚合时间或剪切模量。因此，在凝血酶介导的纤维蛋白聚合期间加入tb和/或eb提供了独特且未实现的机会来改善纤维蛋白制造的处理时间，从而能够产生用于各种用途的高浓度、高强度的纤维蛋白水凝胶(例如，用于商业规模的细胞支架应用)。增加的处理时间还可允许生产具有特定特征(例如，特定拓扑)，例如尺寸、形状和光滑度的高机械强度纤维蛋白凝胶。
[0015]
总地来说，本文的一个方面的特征在于纤维蛋白水凝胶，其包括(a)纤维蛋白原多肽、(b)凝血酶多肽和(c)台盼蓝或其异构体。纤维蛋白水凝胶可包含台盼蓝。纤维蛋白水凝胶可包含台盼蓝的异构体。纤维蛋白水凝胶可包含约10mg/ml至约60mg/ml的纤维蛋白原多肽(例如，约40mg/ml的纤维蛋白原多肽)。纤维蛋白水凝胶可包含约0.1u/ml至约1200u/ml的凝血酶多肽(例如，约33u/ml的凝血酶多肽)。纤维蛋白水凝胶可包含约0.0001％(w/w)至约0.5％(w/w)的台盼蓝(例如，约0.15％(w/w)的台盼蓝)。纤维蛋白的聚合时间可以是约2秒至约1200秒。纤维蛋白水凝胶可包括直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。纤维蛋白水凝胶可具有约1900pa至约2420pa的剪切模量。纤维蛋白水凝胶的表面积可以是约0.05cm2至约300cm2。纤维蛋白水凝胶的厚度可以是约0.1μm至约1,000μm。纤维蛋白水凝胶可通过注塑成型制造。
[0016]
在另一个方面中，本文的特征在于纤维蛋白水凝胶，其包括(a)纤维蛋白原多肽、(b)凝血酶多肽和(c)伊文斯蓝或其异构体。纤维蛋白水凝胶可包含伊文斯蓝。纤维蛋白水凝胶可包含伊文斯蓝的异构体。纤维蛋白水凝胶可包含约10mg/ml至约60mg/ml的纤维蛋白原多肽(例如，约40mg/ml的纤维蛋白原多肽)。纤维蛋白水凝胶可包含约0.1u/ml至约1200u/ml的凝血酶多肽(例如，约33u/ml的凝血酶多肽)。纤维蛋白水凝胶可包含约0.0001％(w/w)至约0.5％(w/w)的伊文斯蓝(例如，约0.15％(w/w)的伊文斯蓝)。纤维蛋白水凝胶的聚合时间可以是约2秒至约1200秒。纤维蛋白水凝胶可包括直径为约1nm至约400nm的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括约1600pa至约2520pa的剪切模量。纤维蛋白水凝胶的表面积可以是约0.05cm2至约300cm2。纤维蛋白水凝胶的厚度可以是约0.1μm至约1,000μm。纤维蛋白水凝胶可通过注塑成型制造。
[0017]
在另一个方面中，本文的特征在于纤维蛋白水凝胶，其包括(a)大于约30mg/ml的纤维蛋白原多肽；和(b)凝血酶多肽；其中，纤维蛋白水凝胶包括约1900pa至约2420pa的剪切模量。纤维蛋白水凝胶可包含约30mg/ml至约60mg/ml的纤维蛋白原多肽(例如，约40mg/ml的纤维蛋白原多肽)。纤维蛋白水凝胶可包含约0.1u/ml至约1200u/ml的凝血酶多肽(例如，约33u/ml的凝血酶多肽)。其可包含台盼蓝或其异构体。纤维蛋白水凝胶可包含约0.0001％(w/w)至约0.5％(w/w)的台盼蓝或异构体。纤维蛋白水凝胶可包含伊文斯蓝或其异构体。纤维蛋白水凝胶可包含约0.0001％(w/w)至约0.5％(w/w)的伊文斯蓝或异构体。纤
维蛋白水凝胶的聚合时间可以是约2秒至约1200秒。纤维蛋白水凝胶可包括直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。纤维蛋白水凝胶的表面积可以是约0.05cm2至约300cm2。纤维蛋白水凝胶的厚度可以是约0.1μm至约1,000μm。纤维蛋白水凝胶可通过注塑成型制造。
[0018]
在另一个方面中，本文的特征在于纤维蛋白水凝胶，其包括(a)大于约30mg/ml的纤维蛋白原多肽；和(b)凝血酶多肽；其中，纤维蛋白水凝胶的聚合时间为约2秒至约1200秒。纤维蛋白水凝胶可包含约30mg/ml至约60mg/ml的纤维蛋白原多肽(例如，约40mg/ml的纤维蛋白原多肽)。纤维蛋白水凝胶可包含约0.1u/ml至约1200u/ml的凝血酶多肽(例如，约33u/ml的凝血酶多肽)。其可包含台盼蓝或其异构体。纤维蛋白水凝胶可包含约0.0001％(w/w)至约0.5％(w/w)的台盼蓝或异构体。纤维蛋白水凝胶可包含伊文斯蓝或其异构体。纤维蛋白水凝胶可包含约0.0001％(w/w)至约0.5％(w/w)的伊文斯蓝或异构体。纤维蛋白水凝胶可具有约1900pa至约2420pa的剪切模量。纤维蛋白水凝胶可包括直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。纤维蛋白水凝胶的表面积可以是约0.05cm2至约300cm2。纤维蛋白水凝胶的厚度可以是约0.1μm至约1,000μm。纤维蛋白水凝胶可通过注塑成型制造。
[0019]
在另一个方面中，本文的特征在于纤维蛋白水凝胶，其包括(a)纤维蛋白原多肽；(b)凝血酶多肽和(c)式(i)的化合物：
[0020][0021]
或其药学上可接受的盐，其中，r
c1
和r
d1
各自独立地选自h和c
1-3
烷基，或者r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0022][0023]
其中，每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。r
c1
和r
d1
各自可独立地选自h和c1‑‑3烷基。式(i)的化合物可具有下式：
[0024][0025]
或其药学上可接受的盐。r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0026][0027]
r1可以是c
1-3
烷基。r1可以是c
1-3
烷氧基。r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0028][0029]
式(i)的化合物可具有下式：
[0030][0031]
或其药学上可接受的盐。式(i)的化合物可具有下式：
[0032][0033]
或其药学上可接受的盐。式(i)的化合物可具有下式：
[0034][0035]
或其药学上可接受的盐。式(i)的化合物可具有下式：
[0036][0037]
或其药学上可接受的盐。纤维蛋白水凝胶可包含约10mg/ml至约60mg/ml的纤维蛋白原多肽(例如，约40mg/ml的纤维蛋白原多肽)。纤维蛋白水凝胶可包含约0.1u/ml至约1200u/ml的所述凝血酶多肽(例如，约33u/ml的凝血酶多肽)。纤维蛋白水凝胶的聚合时间可以是约2秒至约1200秒。纤维蛋白水凝胶可包括直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括约1900pa至约2420pa的剪切模量。纤维蛋白水凝胶的表面积可以是约0.05cm2至约300cm2。纤维蛋白水凝胶的厚度可以是约0.1μm至约1,000μm。纤维蛋白水凝胶可通过注塑成型制造。
[0038]
在另一个方面中，本文的特征在于纤维蛋白水凝胶，其包括(a)纤维蛋白原多肽；(b)凝血酶多肽和(c)式(ii)的化合物：
[0039][0040]
或其药学上可接受的盐，其中每个r1可独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。式(ii)的化合物可具有下式：
[0041][0042]
或其药学上可接受的盐。式(ii)的化合物可具有下式：
[0043][0044]
或其药学上可接受的盐。式(ii)的化合物可具有下式：
[0045][0046]
或其药学上可接受的盐。式(ii)的化合物可具有下式：
[0047][0048]
或其药学上可接受的盐。式(ii)的化合物可具有下式：
[0049][0050]
或其药学上可接受的盐。式(ii)的化合物可具有下式：
[0051][0052]
或其药学上可接受的盐。式(ii)的化合物可具有下式：
[0053][0054]
或其药学上可接受的盐。纤维蛋白水凝胶可包含约10mg/ml至约60mg/ml的纤维蛋白原多肽(例如，约40mg/ml的纤维蛋白原多肽)。纤维蛋白水凝胶可包含约0.1u/ml至约1200u/ml的所述凝血酶多肽(例如，约33u/ml的凝血酶多肽)。纤维蛋白水凝胶的聚合时间可以是约2秒至约1200秒。纤维蛋白水凝胶可包括直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。纤维蛋白水凝胶可包括约1900pa至约2420pa的剪切模量。纤维蛋白水凝胶的表面积可以是约0.05cm2至约300cm2。纤维蛋白水凝胶的厚度可以是约0.1μm至约1,000μm。纤维蛋白水凝胶可通过注塑成型制造。
[0055]
除非另外定义，否则本文中使用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人
员通常所理解的同样含义。虽然可使用与本文所述的方法和材料类似于或等同的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。
[0056]
本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和以下描述中有所阐述。通过说明书和附图以及权利要求书，不难了解本发明的其他特征、目的和优点。
附图说明
[0057]
图1：tb和eb的化学结构。
[0058]
图2：筛选的化合物的化学结构。tb被归类为偶氮染料；中心联苯胺结构将偶氮键的镜像结构连接到萘骨架，所述萘骨架各自具有胺、醇和两个磺酸根官能团。伊文斯蓝(eb)是tb的位置异构体，其中磺酸根沿着萘基团略微不同。聚乙二醇(peg)1000模拟相同的尺寸，但不带电荷或官能团。荧光素钠(sf)是一种不相关的染料。俾斯麦棕(bbr)含有偶氮基和胺基。苯磺酸钠(sbs)含有磺酸基和类似的电荷。刚果红(cr)含有偶氮基、磺酸基/根、联苯胺基和胺基。事实上，cr和tb之间唯一的主要区别在于cr总共包含2个磺酸基/根，而tb有4个。阿尔新蓝(ab)是一种具有不相关的化学性质或尺寸的蓝色染料。亮蓝r(bb)是一种尺寸相似的非偶氮染料，具有磺酸基/根和胺基。吲哚菁绿(icg)是一种带有磺酸基/根和胺基的染料。
[0059]
图3a-3c：由各种化合物形成的纤维蛋白的凝结时间。使用血凝分析仪来确定凝结形成时间。(图3a)在柠檬酸盐缓冲液或添加台盼蓝(tb)的柠檬酸盐缓冲液中稀释的样品的平均凝结时间图。使用来自制造商的商购对照品的纤维蛋白原和凝血酶。两组之间存在统计学差异(n＝10,p《0.001)。(图3b)各种化学试剂添加剂的平均凝结时间图。磷酸盐缓冲盐水(pbs)、tb、伊文思蓝(eb)、聚乙二醇(peg)、荧光素钠(sf)、亮蓝(bbr)、苯磺酸钠(sbs)。所有的染料以4mm浓度使用。使用纤维蛋白原(evicel)的固定1:20稀释液。*表示tb与所有其他试剂具有统计学差异(n＝10,p《0.001)。eb产生的凝结时间超过70秒，超出了仪器的可检测范围。实验运行后，在比色皿内验证凝结的形成。(图3c)用pbs、tb或eb铸造的纤维蛋白凝胶的显微照片。pbs纤维蛋白凝胶具有高度可变的不透明度。边缘是拉丝的并且没有明确界定。tb和eb凝胶在结构上显得更加均匀，并且具有明确的边缘和均匀的表面纹理。这些凝胶通过短暂搅拌混合物溶液而形成。
[0060]
图4a-4b：浓度变化对纤维蛋白凝结时间的影响。(图4a)在tb或eb的各种浓度下的平均凝结时间的图。使用纤维蛋白原(evicel)的固定1:20稀释浓度。在相同染料浓度下，eb对凝结时间的影响似乎比tb更大。(图4b)在pbs、tb或eb的各种纤维蛋白原浓度下的平均凝结时间的图。使用0.4％w/v(重量/体积)染料浓度。所有3个条件都证实了与纤维蛋白原浓度凝结时间的反比关系，正如克劳斯(clauss)方法所预测的那样。纤维蛋白原浓度似乎不会改变染料对凝结时间的影响。
[0061]
图5a-5b：添加染料的纤维蛋白凝胶的初始凝胶时间的流变学研究。使用流变仪评估胶凝参数。(图5a)用10mg/ml纤维蛋白原、1u/ml凝血酶和0.01％染料终浓度制成的示例纤维蛋白凝胶的模量(g'和g")与时间的关系图。调整时间窗口以使g'超过g"首次发生(胶凝时间)可视化。绿色箭头指示该样品的胶凝时间。(图5b)用pbs、tb、eb或peg制造的凝胶的
平均胶凝时间的图。*表示tb和eb均与所有其他组具有统计学差异(n＝3,p《0.001)。
[0062]
图6：示出了在流变实验下，在tb的各种浓度下的胶凝时间的图。纤维蛋白凝胶用10mg/ml纤维蛋白原和1u/ml凝血酶最终浓度来制造。tb浓度(％w/v)代表了最终的凝胶混合物浓度。这些数据通过第二种方法证实了先前在图2中确立的剂量依赖性。
[0063]
图7a-7c：纤维蛋白原浓度较高的凝胶的剪切模量。(图7a)用40mg/ml纤维蛋白原、33u/ml凝血酶和0.12％染料终浓度制成的示例纤维蛋白凝胶的剪切模量与时间的关系图。x和y轴均以以10为底的对数绘制，以使初始胶凝动力学可视化。(图7b)用pbs、tb、eb或peg制造的纤维蛋白凝胶的最终聚合时间(完全凝固的凝胶)的图。不存在显著差异(p＝0.65)。(图7c)用40mg/ml纤维蛋白原、33u/ml凝血酶和0.12％染料终浓度制成的纤维蛋白凝胶的凝胶时间的图。tb和eb具有统计学差异(n＝3.p＝0.03)。由这些浓度的pbs和peg制造的凝胶在11秒的第一个时间点之前胶凝，并且不能精确测量。
[0064]
图8a-8b：纤维蛋白原浓度较高的凝胶的剪切模量。(图8a)用40mg/ml纤维蛋白原、33u/ml凝血酶和0.12％染料终浓度制成的示例纤维蛋白凝胶的剪切模量与时间的关系图。(图8c)用pbs、tb、eb或peg制造的纤维蛋白凝胶的最终剪切模量的图(n＝3,p＝0.08)。
[0065]
图9a-9c：纤维蛋白凝胶剪切模量数据模型化参数。(图9a)用pbs、tb、eb或peg制造的纤维蛋白凝胶随着时间变化的由模型化剪切模量得到的时间位移参数xc的图。每种条件下的g'与时间的数据被模型化为双指数方程，并记录在表2中。*表示tb和eb与所有其他组显著差异(n＝3,p《0.001)。(图9b)示出了用pbs、tb、eb或peg制造的纤维蛋白凝胶随着时间变化的由模型化剪切模量得到的反应速率的比值(r1/r2)的图。未达到统计学趋势(n＝3,p＝0.057)。
[0066]
图10：采用定制的聚甲醛(pom)模具，由40mg/ml纤维蛋白原、33u/ml凝血酶、0.12％染料终浓度制成的纤维蛋白凝胶的代表性扫描电子显微镜(sem)显微照片。由于模具的疏水性质，因此原纤维沿着表面看上去排列得更加均匀。用pbs制造的凝胶的表面具有波浪纹理，在整个表面上具有坑和丘的不规则外观。用tb和eb制造的凝胶实际看上去更加均匀。
[0067]
图11：采用定制的聚甲醛(pom)模具，由40mg/ml纤维蛋白原、33u/ml凝血酶、0.12％染料终浓度制成的纤维蛋白凝胶截面的代表性透射电子显微镜(tem)显微照片。虽然用pbs、tb或eb制造的凝胶表面看上去更加相似，但是内体积显示出明显的差异。总体而言，与pbs制成的凝胶相比，用tb和eb制成的凝胶似乎具有更高的交联度、更均匀和更细的原纤维尺寸以及更均匀的原纤维分布。
[0068]
图12a-12c：用pbs、tb或eb制造的纤维蛋白凝胶的降解的评估。(图12a)随着时间的推移，用组织纤溶酶原激活剂(tpa)和纤溶酶原(p)降解的eb纤维蛋白凝胶的代表性光学相干断层扫描b扫描和en面视图。采用定制的聚甲醛(pom)模具，由40mg/ml纤维蛋白原、33u/ml凝血酶、0.12％eb终浓度制成纤维蛋白凝胶。降解溶液由pbs中的1.6u/ml p和17,000u/ml tpa组成，处于37℃。(图12b)降解过程中标准化纤维蛋白凝胶厚度随时间变化的代表图。(图12c)示出了由pbs、tb和eb制成的纤维蛋白凝胶的最终降解时间的图。尽管eb凝胶似乎需要更长的时间才能完全降解，但没有统计学差异(n＝3，p＝0.06)。
[0069]
图13a-13d：(图13a)用tb制造的纤维蛋白凝胶的显微照片。使用定制pom模具，利用压制方法制造凝胶，以在6孔细胞培养板的底部形成约200μm厚的片材。(图13b)诱导多能
干细胞衍生的视网膜色素上皮(ipsc-rpe)在用tb制成的纤维蛋白凝胶上培养1个月时的显微照片。即使使用tb铸造凝胶，纤维蛋白凝胶仍显得透明。(图13c)在纤维蛋白上培养的ipsc-rpe的显微照片。rpe以其特征化的着色、六角形鹅卵石单层显型出现。(图13d)在8周时在用tb制成的纤维蛋白水凝胶上培养的ipsc-rpe中b-肌动蛋白(β-a)、cralbp(cralb)、mertk、rpe65和bestl的代表性western印迹分析。
[0070]
图14a-14b：(图14a)用于使用注塑成型技术制造纤维蛋白凝胶的定制载片的示意图。载片的总深度为1/8”，腔体深度为0.008”(200μm)。浇口孔(左)的深度为1/16”，两个气孔(右)的深度为1/32”。(图14b)通过研磨聚碳酸酯片制造的载片。凝胶/培养表面积为15cm2。
[0071]
图15：使用干涉测量法来确认研磨的聚碳酸酯板的规格。干涉测量数据用于生成载片截面的3d渲染。对底、左边缘和右边缘的随机部分进行测量并绘制图表。沿底层的变化为约5μm。左边缘测量的深度为211μm，右边缘测量的深度为215μm。
[0072]
图16：铺在适合细胞培养的4孔矩形培养皿中的4块研磨的载片的显微照片。
[0073]
图17a-17c：(图17a)与盖板对齐的载片的显微照片，以可视化用于注塑成型纤维蛋白凝胶的浇口孔。(图17b)铝支架的显微照片，排列有5个载片并配有盖板以规模化生产的铝支架的显微照片。(图17c)使浇口孔可视化的铝支架的顶视图。
[0074]
图18a
–
18b：(图18a)用于放大生产的较大载片的显微照片。外尺寸为4”x 4”。总凝胶/培养表面积为96cm2。(图18b)装配在用于细胞培养的商购t150烧瓶中的较大载片的显微照片。
[0075]
图19a-19b：(图19a)铸造的纤维蛋白凝胶的显微照片。将载片浸没在4孔矩形板内的pbs中。(图19b)在纤维蛋白凝胶上培养1个月的ipsc-rpe的显微照片。rpe表现为有色作为显型特征。即使使用tb铸造凝胶，凝胶仍显得透明。
[0076]
图20：纤维蛋白凝胶载片的代表性oct b扫描和en面(体积强度投影)。b扫描显示出凝胶的光滑顶表面并具有208-214μm的深度。
[0077]
图21a-21b：示例性纤维蛋白载板(slide plate)。(图21a)附接到纤维蛋白载板的示例性遮罩板的计算机辅助绘图(cad)图像。(图21b)附接有盖玻片板的示例性遮罩板的顶视图、底视图和侧视图。
具体实施方式
[0078]
本文提供了制造和使用纤维蛋白水凝胶的方法和材料。例如，本文提供了纤维蛋白水凝胶，其包含tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含(a)一种或多种纤维蛋白原多肽，(b)一种或多种凝血酶多肽和(c)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。在一些情况中，本文提供了纤维蛋白水凝胶，其包含tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含(a)一种或多种纤维蛋白原多肽，(b)一种或多种凝血酶多肽和(c)式(i)的化合物：
[0079]
[0080]
或其药学上可接受的盐，其中，r
c1
和r
d1
各自独立地选自h和c
1-3
烷基，或者r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0081][0082]
其中，每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。例如，本文提供了包含式(ii)的化合物的纤维蛋白水凝胶：
[0083][0084]
或其药学上可接受的盐，其中，每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。在一些情况中，具有式(ii)的化合物的组合物可包括tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。例如，纤维蛋白水凝胶可包含纤维蛋白的交联网络，其通过在凝胶酶多肽以及tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的存在下，由纤维蛋白原多肽形成的纤维蛋白聚合来形成。
[0085]
本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何合适的纤维蛋白原多肽(例如，可由包含任何合适的纤维蛋白原多肽的胶凝混合物形成)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何合适的纤维蛋白原多肽(例如，可由包含任何合适的纤维蛋白原多肽的胶凝混合物形成)。在一些情况中，纤维蛋白原多肽可以是合成多肽。在一些情况中，纤维蛋白原多肽可以是重组多肽。在一些情况中，纤维蛋白原多肽可以是纤维蛋白原多肽的生物活性片断(例如，截短的纤维蛋白原多肽或剪接的纤维蛋白原多肽)。例如，纤维蛋白原多肽可以是纤维蛋白原多肽的α链多肽、β链多肽和/或γ链多肽。在一些情况中，纤维蛋白原多肽可以从一种或多种动物获得(例如，可从一种或多种动物中分离)。例如，可从鱼(鲑鱼)获得纤维蛋白原多肽。例如，可从哺乳动物，例如，待用本文提供的纤维蛋白水凝胶处理的哺乳动物获得纤维蛋白原多肽。可包含在本文提供的纤维蛋白水凝胶中(例如，可包含在本文提供的纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物中)的纤维蛋白原多肽的实例包括但不限于生物活性组分2(例如)，密封蛋白浓缩物(例如tisseel)，小瓶1纤维蛋白原浓缩物(例如)，纤维蛋白原浓缩物(例如)，在国家生物技术信息中心(ncbi)数据库中以登录号m64982(m64982.1版)、登录号x51473(x51473.1版)和登录号m64983(m64983.1版)列出的那些。
[0086]
本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何量的纤维蛋白原多肽(例如，在纤维蛋白水凝胶的胶凝之前，在胶凝混合物中可包含任何量的纤维蛋白原多肽)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何量的纤维蛋白原多肽(例如，在纤维蛋白水凝胶的胶凝之前，在胶凝混合物中可包含任何量的纤维蛋白原多肽)。在一些情况中，本文
提供的纤维蛋白水凝胶可包含纤维蛋白原多肽浓度，其大于血浆中(例如，人血浆中)通常发现的纤维蛋白原多肽浓度。例如，本文提供的用于纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物可包含大于约5毫克纤维蛋白原多肽/毫升胶凝混合物(大于5mg/ml)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含纤维蛋白原多肽浓度，其大于纤维蛋白胶中(例如，人纤维蛋白胶中)通常发现的纤维蛋白原多肽浓度。例如，本文提供的用于纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物可包含大于约30mg/ml的纤维蛋白原多肽。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含纤维蛋白原多肽浓度，其低于饱和纤维蛋白原多肽溶液浓度中的溶解浓度。例如，本文提供的用于纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物可包含小于约90mg/ml的纤维蛋白原多肽。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含约10mg/ml至约60mg/ml的纤维蛋白原多肽(例如，可由包含约10mg/ml至约60mg/ml的纤维蛋白原多肽的胶凝混合物形成)(例如，约10mg/ml至约50mg/ml、约10mg/ml至约40mg/ml、约10mg/ml至约30mg/ml、约10mg/ml至约20mg/ml、约20mg/ml至约60mg/ml、约30mg/ml至约60mg/ml、约40mg/ml至约60mg/ml、约50mg/ml至约60mg/ml、约15mg/ml至约55mg/ml、约20mg/ml至约50mg/ml、约25mg/ml至约45mg/ml、约30mg/ml至约40mg/ml、约20mg/ml至约30mg/ml或约40mg/ml至约50mg/ml的纤维蛋白原多肽)。例如，本文提供的用于纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物可包含约10mg/ml的纤维蛋白原多肽。例如，本文提供的用于纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物可包含约40mg/ml的纤维蛋白原多肽。
[0087]
本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何合适的凝血酶多肽(例如，可由包含任何合适的凝血酶多肽的胶凝混合物形成)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何合适的凝血酶多肽(例如，可由包含任何合适的凝血酶多肽的胶凝混合物形成)。在一些情况中，凝血酶多肽可以是合成多肽。在一些情况中，凝血酶多肽可以是重组多肽。在一些情况中，纤维蛋白原多肽可以是凝血酶多肽的生物活性片断(例如，凝血酶多肽的酶结构域)。在一些情况中，可从一种或多种动物，例如待用本文提供的纤维蛋白水凝胶处理的哺乳动物获得(例如，可从中分离)凝血酶多肽。可包含在本文提供的纤维蛋白水凝胶中(例如，可包含在本文提供的纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物中)的凝血酶多肽的实例包括但不限于凝血酶小瓶(例如)、凝血酶溶液(tisseel)、小瓶3凝血酶凝血酶小瓶(例如)，在国家生物技术信息中心(ncbi)数据库中以登录号bd189695(bd189695.1版)，登录号aagw02037995(aagw02037995.1版)和登录号af080065(af080065.1版)列出的那些。
[0088]
本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何量的凝血酶多肽(例如，在纤维蛋白水凝胶的胶凝之前，在胶凝混合物中可包含任何量的凝血酶多肽)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何量的凝血酶多肽(例如，在纤维蛋白水凝胶的胶凝之前，在胶凝混合物中可包含任何量的凝血酶多肽)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可
包含约0.1单位凝血酶多肽/ml的水凝胶(0.1u/ml)至约1200u/ml的凝血酶多肽(例如，可由包含约0.1u/ml至约1200u/ml凝血酶多肽的胶凝混合物形成)(例如，约0.1u/ml至约1000u/ml、约0.1u/ml至约800u/ml、约0.1u/ml至约600u/ml、约0.1u/ml至约400u/ml、约0.1u/ml至约200u/ml、约0.1u/ml至约100u/ml、约0.1u/ml至约50u/ml、约0.1u/ml至约25u/ml、约0.1u/ml至约1u/ml、约1u/ml至约1200u/ml、约25u/ml至约1200u/ml、约100u/ml至约1200u/ml、约250u/ml至约1200u/ml、约500u/ml至约1200u/ml、约750u/ml至约1200u/ml、约1u/ml至约1000u/ml、约50u/ml至约750u/ml、约100u/ml至约500u/ml、约200u/ml至约300u/ml、约0.5u/ml至约33u/ml的凝血酶多肽、约1u/ml至约100u/ml的凝血酶多肽、约10u/ml至约200u/ml、约200u/ml至约400u/ml、约300u/ml至约500u/ml、约400u/ml至约600u/ml、约500u/ml至约700u/ml、约600u/ml至约800u/ml,or from about 700u/ml至约900u/ml)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含约1u/ml的凝血酶多肽。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含约33u/ml的凝血酶多肽。
[0089]
当从一种或多种动物，例如待用本文提供的纤维蛋白水凝胶处理的哺乳动物获得(例如，从中分离)一种或多种纤维蛋白原多肽和/或一种或多种凝血酶多肽时，可使用任何合适的方法来获得纤维蛋白原多肽和/或凝血酶多肽。例如，可使用沉淀技术(例如冷沉淀、乙醇沉淀和硫酸铵沉淀)，超滤，亲和色谱法和高效液相色谱法(hplc)，从一种或多种动物(例如，待用本文提供的纤维蛋白水凝胶处理的哺乳动物)中获得的血浆中分离出一种或多种纤维蛋白原多肽和/或一种或多种凝血酶多肽。在一些情况中，可从单种动物获得纤维蛋白原多肽和/或凝血酶多肽。在一些情况中，可从两种或更多种动物(例如，两种或更多种动物的合并样品)获得纤维蛋白原多肽和/或凝血酶多肽。在一些情况中，可从如本文所述的待处理的哺乳动物中获得纤维蛋白原多肽和/或凝血酶多肽(例如，可以是自体纤维蛋白原多肽和/或自体凝血酶多肽)。在一些情况中，可从一种或多种供体动物获得纤维蛋白原多肽和/或凝血酶多肽(例如，可以是同种异体多肽和/或同种异体凝血酶多肽)。
[0090]
本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含(例如，可由包含其的胶凝混合物形成)式(i)的化合物：
[0091][0092]
或者其药学上可接受的盐，其中，r
c1
和r
d1
各自独立地选自h和c
1-3
烷基，或者r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0093][0094]
其中，每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。在一些实施方式中，r
c1
和r
d1
各自独立地选自h和c1‑‑3烷基。在一些实施方式中，式(i)的化合物具有下式：
[0095][0096]
或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0097][0098]
在一些实施方式中，r1是c
1-3
烷基。在一些实施方式中，r1是c
1-3
烷氧基。在一些实施方式中，r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0099][0100]
在一些实施方式中，式(i)的化合物具有下式：
[0101][0102]
或其药学上可接受的盐。
[0103]
在一些实施方式中，式(i)的化合物具有下式：
[0104][0105]
或其药学上可接受的盐。
[0106]
在一些实施方式中，式(i)的化合物具有下式：
[0107][0108]
或其药学上可接受的盐.
[0109]
在一些实施方式中，式(i)的化合物具有下式：
[0110][0111]
或其药学上可接受的盐。
[0112]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含(例如，可由包含其的胶凝混合物形成)式(ii)的化合物：
[0113][0114]
或其药学上可接受的盐，其中，每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。
[0115]
在一些实施方式中，式(ii)的化合物具有正式：
[0116][0117]
或其药学上可接受的盐。
[0118]
在一些实施方式中，式(ii)的化合物具有正式：
[0119][0120]
或其药学上可接受的盐。
[0121]
在一些实施方式中，式(ii)的化合物具有正式：
[0122][0123]
或其药学上可接受的盐。
[0124]
在一些实施方式中，式(ii)的化合物具有正式：
[0125][0126]
或其药学上可接受的盐。
[0127]
在一些实施方式中，式(ii)的化合物具有正式：
[0128][0129]
或其药学上可接受的盐。
[0130]
在一些实施方式中，式(ii)的化合物具有正式：
[0131][0132]
或其药学上可接受的盐。
[0133]
在一些实施方式中，式(ii)的化合物具有正式：
[0134][0135]
或其药学上可接受的盐。
[0136]
在本说明书各处，本发明化合物的取代基以组或范围方式公开。具体旨在表明本发明包括该组和范围中成员的每一种单独的亚组合。例如，术语“c
1-6
烷基”具体指独立甲基、乙基、c3烷基、c4烷基、c5烷基和c6烷基。
[0137]
在整个定义中，术语“c
n-m”指示包括端点的范围，其中，n和m是整数，并且指示碳的数目。实例包括c
1-4
、c
1-6
等。
[0138]
如本文所用的，单独或与其他术语组合使用的术语“c
n-m
烷基”是指具有n至m个碳的饱和烃基，其可以是直链或支链的。烷基部分的实例包括但不限于下述化学基团，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、异丁基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；更高级的同系物，例如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。在一些实施方式中，烷基包含1至6个碳原子、1至4个碳原子、1至3个碳原子或1至2个碳原子。
[0139]
如本文所用的，单独或与其他术语组合使用的术语“c
n-m
烷氧基”是指具有式-o-烷基的基团，其中，烷基具有n至m个碳。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如，正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基(例如，正丁氧基和叔丁氧基)等。在一些实施方式中，烷基具有1至6、1至4或1至3个碳原子。
[0140]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含tb、eb和/或它们的一种或多种异构体(例如，可由包含其的胶凝混合物形成)。tb和eb的化学结构可如图1所示。tb、eb及其异构体可具有化学式c
34h24
n6o
14
s4。在一些情况中，tb和eb的异构体可包括四个磺酸根/酯基团。在一些情况中，tb和eb的异构体可包括相似的磺酸根/酯基团的布置。在一些情况中，tb和eb的异构体可以是尺寸与tb和eb相似的分子。在一些情况中，tb、eb或其异构体可以是盐的形式。例如，tb、eb或其异构体可以是钠(na)盐或氢(h)盐的形式。作为tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的替代或附加，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含与tb、eb和/或它们的一种或多种异构体相关的一种或多种化合物。可包含在本文提供的纤维蛋白水凝胶中(例如，可包含在用于本文提供的纤维蛋白水凝胶的胶凝化合物中)的tb和eb的实例包括但不限于台盼蓝、直接蓝53、偶氮蓝(azovan blue)、具有pubchem化合物id号(cid)6296(tb)下列出的结构的化合物，以及具有pubchem cid 9409(eb)下列出的结构的化合物。可包含在本文提供的纤维蛋白水凝胶中(例如，可包含在用于本文提供的纤维蛋白水凝胶的胶凝化合物中)的tb和eb的异构体及相关化合物的实例包括但不限于直接蓝2(direct blue 2)、联苯胺蓝bh(melantherine bh)、滂胺天蓝5b、偶氮品红和酸性红99。
[0141]
本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何量的tb、eb和/或其一种或多种异构体(例如，在纤维蛋白水凝胶的胶凝之前，在胶凝混合物中可包含任何量的tb、eb和/或其一种或多种异构体)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝
胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含任何量的式(i)和/或式(ii)的化合物(例如，在纤维蛋白水凝胶的胶凝之前，在胶凝混合物中可包含任何量的式(i)和/或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或其一种或多种异构体)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含(例如，可由包含其的胶凝混合物形成)约0.0001％(w/v)至约0.5％(w/v)的式(i)或式(ii)的化合物(例如，约0.001％(w/v)至约0.5％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.5％(w/v)、约0.1％(w/v)至约0.5％(w/v)、约0.2％(w/v)至约0.5％(w/v)、约0.3％(w/v)至约0.5％(w/v)、约0.4％(w/v)至约0.5％(w/v)、约0.0001％(w/v)至约0.4％(w/v)、约0.0001％(w/v)至约0.3％(w/v)、约0.0001％(w/v)至约0.2％(w/v)、约0.0001％(w/v)至约0.1％(w/v)、约0.0001％(w/v)至约0.01％(w/v)、约0.001％(w/v)至约0.3％(w/v)、约0.001％(w/v)至约0.1％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.15％(w/v)或约0.1％(w/v)至约0.3％(w/v))。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含约0.01％(w/v)的式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含约0.15％(w/v)的式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的浓度，所述浓度低于tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的溶解度浓度。例如，本文提供的用于纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物可包含小于约10mg/ml的tb(例如，约10mg/ml tb、9mg/ml tb、8mg/ml tb、7mg/mltb、6mg/ml tb或5mg/ml tb)。例如，本文提供的用于纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物可包含小于约50mg/ml的eb(例如，约45mg/ml eb、约40mg/mleb、约35mg/ml eb、约30mg/ml eb、约25mg/ml eb、约20mg/ml eb、约15mg/ml eb或约10mg/ml eb)。
[0142]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含下述(例如，可由包含下述的胶凝混合物形成)：5至15mg/ml纤维蛋白原多肽、0.5至5u/ml凝血酶多肽和0.005至0.05％(w/v)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含下述(例如，可由包含下述的胶凝混合物形成)：5至15mg/ml纤维蛋白原多肽、0.5至5u/ml凝血酶多肽和0.005至0.05％(w/v)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。
[0143]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含下述(例如，可由包含下述的胶凝混合物形成)：10mg/ml纤维蛋白原多肽、1u/ml凝血酶多肽和0.01％(w/v)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含下述(例如，可由包含下述的胶凝混合物形成)：10mg/ml纤维蛋白原多肽、1u/ml凝血酶多肽和0.01％(w/v)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。
[0144]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可
包含下述(例如，可由包含下述的胶凝混合物形成)：20至60mg/ml纤维蛋白原多肽、20至40u/ml凝血酶多肽和0.05至0.5％(w/v)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含下述(例如，可由包含下述的胶凝混合物形成)：20至60mg/ml纤维蛋白原多肽、20至40u/ml凝血酶多肽和0.05至0.5％(w/v)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。
[0145]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含下述(例如，可由包含下述的胶凝混合物形成)：40mg/ml纤维蛋白原多肽、33u/ml凝血酶多肽和0.12％(w/v)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含下述(例如，可由包含下述的胶凝混合物形成)：40mg/ml纤维蛋白原多肽、33u/ml凝血酶多肽和0.12％(w/v)tb、eb和/或它们的一种或多种异构体。
[0146]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含一种或多种额外组分(例如，可由包含其的胶凝混合物形成)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含一种或多种额外组分(例如，可由包含其的胶凝混合物形成)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含一种或多种细胞外基质(ecm)组分(例如，纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白和胶原)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含一种或多种凝血因子(例如，生理浓度的一种或多种凝血因子)，例如因子ix、凝血酶原、因子xiii和因子viii。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含一种或多种肝素结合序列(例如，来自抗凝血酶iii的肝素结合序列、来自神经细胞粘附分子的肝素结合序列和来自血小板因子4的肝素结合序列)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含一种或多种纤维蛋白溶解剂(例如，组织纤溶酶原激活剂、纤溶酶原和尿激酶纤溶酶原激活剂)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含一种或多种抗纤维蛋白溶解剂(例如，抑肽酶、重组抑肽酶、氨甲环酸和ε-己酸)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含一种或多种生长因子(例如，成纤维细胞生长因子、神经营养蛋白3、转化生长因子β1、转化生长因子β2、神经生长因子、脑源性神经营养因子、色素上皮源性因子和血管内皮生长因子)。
[0147]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含一种或多种治疗剂(例如，可由包含其的胶凝混合物形成)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可包含一种或多种治疗剂(例如，可由包含其的胶凝混合物形成)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含一种或多种治疗剂并且可用于将所述一种或多种治疗剂递送给哺乳动物。可包含在本文提供的纤维蛋白水凝胶中的治疗剂的实例包括但不限于基因治疗病毒载体、抗体、小
分子和细胞。
[0148]
本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可使用任何合适的方法可视化(例如，在哺乳动物中可视化)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可使用任何合适的方法可视化(例如，在哺乳动物中可视化)。例如，可使用成像技术使本文提供的纤维蛋白水凝胶可视化，所述成像技术例如光学显微镜、眼底摄影、红外成像、光学相干断层扫描(oct)、计算机断层扫描(ct)和/或磁共振成像(mri)。
[0149]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有延迟的胶凝时间(例如，纤维蛋白水凝胶中的纤维蛋白延迟聚合)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有延迟的胶凝时间(例如，纤维蛋白水凝胶中的纤维蛋白延迟聚合)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的聚合时间可比缺少tb、eb和它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶中通常发现的聚合时间慢。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的聚合时间可大于约2秒。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的聚合时间可以是约2秒至约1200秒(例如，约2秒至约1000秒、约2秒至约800秒、约2秒至约600秒、约2秒至约400秒、约2秒至约200秒、约2秒至约100秒、约2秒至约75秒、约2秒至约60秒、约2秒至约45秒、约2秒至约30秒、约15秒至约1200秒、约30秒至约1200秒、约45秒至约1200秒、约60秒至约1200秒、约120秒至约1200秒、约400秒至约1200秒、约600秒至约1200秒、约800秒至约1200秒、约30秒至约600秒、约60秒至约120秒、约120秒至约360秒、约360秒至约480秒、约480秒至约600秒、约600秒至约720秒、约720秒至约840秒、或约840秒至约1200秒)。在一些情况中，聚合时间可受纤维蛋白水凝胶中的一种或多种纤维蛋白原聚合物的浓度影响。例如，包含约10mg/ml纤维蛋白原多肽的纤维蛋白水凝胶的聚合时间可以是约30秒至约400秒。例如，包含约40mg/ml纤维蛋白原多肽的纤维蛋白水凝胶的聚合时间可以是约1秒至约200秒。
[0150]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有增大的剪切强度。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有增大的剪切强度。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的剪切强度可与缺少tb、eb和它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶中通常发现的剪切强度相当或大于该剪切强度。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的剪切模量可以是约500帕斯卡(pa)至约50,000pa(例如，约500pa至约25,000pa、约500pa至约10,000pa、约500pa至约5,000pa、约500pa至约1,000pa、约1,000pa至约50,000pa、约5,000pa至约50,000pa、约10,000pa至约50,000pa、约25,000pa至约50,000pa、约1,000pa至约25,000pa、约5,000pa至约10,000pa、约1,000pa至约5,000pa、约5,000pa至约10,000pa、或约10,000pa至约25,000pa)。剪切模量可根据形成纤维蛋白水凝胶的装置的几何而变化。例
如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的剪切模量可以是约1000pa至约3000pa(例如，约2197
±
221pa)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的剪切模量可以是约1600pa至约2520pa(例如，约2077
±
441)。
[0151]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有小的原纤维。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有小的原纤维。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶原纤维的直径(例如，平均直径)可与缺少tb、eb和它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶中通常发现的原纤维的直径(例如，平均直径)相当或更小。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包含原纤维，其直径(例如平均直径)为约1纳米(nm)至约400nm(例如，约1nm至约400nm、约1nm至约300nm、约1nm至约200nm、约1nm至约100nm、约1nm至约75nm、约1nm至约50nm、约1nm至约25nm、约10nm至约400nm、约25nm至约400nm、约50nm至约400nm、约100nm至约400nm、约200nm至约400nm、约300nm至约400nm、或约100nm至约300nm)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包括直径(例如，平均直径)为约50nm至约100nm的原纤维。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可包括直径(例如，平均直径)为约40nm至约60nm的原纤维。
[0152]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有增加的交联密度。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有增加的交联密度。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的原纤维的交联密度可与缺少tb、eb和它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶中通常发现的原纤维交联密度相当或大于该原纤维交联密度。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的原纤维交联密度可以为1交联/μm2至约5,000交联/μm2(例如，约1交联/μm2至约4,000交联/μm2、约1交联/μm2至约3,000交联/μm2、约1交联/μm2至约2,000交联/μm2、约1交联/μm2至约1,000交联/μm2、约1交联/μm2至约750交联/μm2、约1交联/μm2至约500交联/μm2、约1交联/μm2至约100交联/μm2、约1交联/μm2至约50交联/μm2、约50交联/μm2至约5,000交联/μm2、约100交联/μm2至约5,000交联/μm2、约500交联/μm2至约5,000交联/μm2、约1,000交联/μm2至约5,000交联/μm2、约2,000交联/μm2至约5,000交联/μm2、约3,000交联/μm2至约5,000交联/μm2、约4,000交联/μm2至约5,000交联/μm2、约50交联/μm2至约3,000交联/μm2、约100交联/μm2至约2,000交联/μm2、约500交联/μm2至约1,000交联/μm2、约100交联/μm2至约400交联/μm2、约300交联/μm2至约500交联/μm2、约800交联/μm2至约1,000交联/μm2或约1,000交联/μm2至约3,000交联/μm2)。
[0153]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可以是可降解的(例如，可生物降解)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可以是可降解的(例如，可生物降解)。例如，纤维蛋白水凝胶(例如，已经递送给哺乳动物的纤维蛋白水凝胶)的体积可以随
着时间而减少。在一些情况中，已经递送给哺乳动物(例如人)的纤维蛋白水凝胶的体积可随着时间减少至少约25％(例如，至少约35％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约98％或者至少约99％)。在一些情况中，已经递送给哺乳动物(例如人)的纤维蛋白水凝胶的体积可在递送后减少，持续约5分钟至约12个月(例如，约5分钟至约6个月、约5分钟至约3个月、约5分钟至约1个月、约5分钟至约1周、约5分钟至约4天、约5分钟至约1天、约5分钟至约12小时、约5分钟至约6小时、约5分钟至约3小时、约5分钟至约60分钟、约1小时至约12个月、约1周至约12个月、约1个月至约12个月、约6个月至约12个月、约1小时至约1个月或约1天至约1周)。在一些情况中，当本文提供的纤维蛋白水凝胶的体积减少时，纤维蛋白水凝胶可能已经暴露于一种或多种纤维蛋白溶解酶(例如，纤溶酶原和组织纤溶酶原激活剂)。例如，当本文提供的纤维蛋白水凝胶暴露于约1.6u/ml纤溶酶原和/或约17,000u/ml组织纤溶酶原激活剂(例如，在37℃下暴露于约1.6u/ml纤溶酶原和/或约17,000u/ml组织纤溶酶原激活剂)时，纤维蛋白水凝胶的体积可随着时间减少。在一些情况中，已经暴露于一种或多种纤维蛋白溶解酶的纤维蛋白水凝胶的体积可减少，持续约5分钟至约200分钟(例如，约5分钟至约180分钟、约5分钟至约150分钟、约5分钟至约120分钟、约5分钟至约90分钟、约5分钟至约60分钟、约5分钟至约45分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约10分钟、约1分钟至约200分钟、约30分钟至约200分钟、约45分钟至约200分钟、约60分钟至约200分钟、约90分钟至约200分钟、约120分钟至约200分钟、约150分钟至约200分钟、约15分钟至约180分钟、约30分钟至约150分钟、约45分钟至约120分钟、约60分钟至约90分钟、约30分钟至约60分钟、约60分钟至约90分钟、约90分钟至约120分钟、约120分钟至约150分钟、或约150分钟至约180分钟)。
[0154]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有均匀的原纤维。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有均匀的原纤维。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶中的原纤维相比于缺少tb、eb和它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶中通常发现的原纤维可以更加均匀(例如，可具有更低的标准偏差值)。
[0155]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有光滑表面。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有光滑表面。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶相比于缺少tb、eb和它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶可具有更光滑的表面(例如，可具有更少和/或更小的表面异常，例如坑和丘。
[0156]
本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有任何尺寸。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有任何尺寸。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的宽度可
以是约0.5毫米(mm)至约6mm(例如，约0.5mm至约5mm、约0.5mm至约4mm、约0.5mm至约3mm、约0.5mm至约2mm、约0.5mm至约1mm、约1mm至约6mm、约2mm至约6mm、约3mm至约6mm、约4mm至约6mm、约5mm至约6mm、约1mm至约5mm、约2mm至约4mm、约1mm至约3mm或约3mm至约5mm)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的宽度可以是约1.5mm。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的长度可以是约1mm至约8mm(例如，约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约1mm至约6mm、约1mm至约5mm、约1mm至约4mm、约1mm至约3mm、约2mm至约8mm、约3mm至约8mm、约4mm至约8mm、约5mm至约8mm、约6mm至约8mm、约2mm至约7mm、约3mm至约6mm、约4mm至约5mm、约2mm至约4mm、约3mm至约5mm或约4mm至约6mm)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的长度可以是约5mm。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的厚度可以是约0.1μm至约1,000μm(例如，5μm至约1,000μm、10μm至约1,000μm、约25μm至约500μm、约25μm至约400μm、约25μm至约300μm、约25μm至约200μm、约25μm至约100μm、约25μm至约75μm、约25μm至约50μm、约50μm至约500μm、约75μm至约500μm、约100μm至约500μm、约200μm至约500μm、约300μm至约500μm、约400μm至约500μm、约50μm至约400μm、约100μm至约300μm、约50μm至约250μm、约150μm至约350μm或约250μm至约450μm)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的厚度可以是约150μm至约380μm(例如，约309
±
69μm)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的的厚度可以是约200μm。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的表面积可大于约1cm2。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的表面积可以是约0.05cm2至约300cm2(例如，约0.5cm2至约200cm2、约1cm2至约200cm2、约4cm2至约200cm2、约4cm2至约100cm2、约4cm2至约75cm2、约4cm2至约50cm2、约4cm2至约10cm2、约10cm2至约300cm2、约50cm2至约300cm2、约75cm2至约300cm2、约100cm2至约300cm2、约200cm2至约300cm2、约50cm2至约250cm2、约100cm2至约200cm2、约50cm2至约150cm2、约100cm2至约200cm2或者约150cm2至约250cm2)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的表面积可以为约15cm2。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶的表面积可以为约95cm2。
[0157]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有约1.5mm的宽度、约5mm的长度和约200μm的厚度。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有约1.5mm的宽度、约5mm的长度和约200μm的厚度。
[0158]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可以具有形状(例如，可使用模具成形)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可以具有形状(例如，可使用模具成形)。例如，可混合一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体，并且在聚合之前，可倒入模具(例如乙缩醛模具)以在模具中聚合，由此使纤维蛋白水凝胶成形。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可具有形状(例如，可使用成形)以适合在细胞培养容器(例如，细胞培养皿、细胞培养板和细胞培养瓶)中。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的可被成形成圆形以
适于在细胞培养皿的穴中。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶的可被成形成矩形以适于在细胞培养瓶中。
[0159]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可在基材的表面上形成。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可在基材的表面上形成。其上可形成纤维蛋白水凝胶的基材实例包括但不限于载板、模具、微、微阵列、微芯片和晶片。基材可包含任何合适的材料(例如，聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯和玻璃)。基材可具有任何尺寸。例如，其上可形成本文提供的纤维蛋白水凝胶的基材(例如，载板)可具有约0.05cm2至约300cm2的表面积(例如，约0.5cm2至约200cm2、约1cm2至约200cm2、约4cm2至约200cm2、约4cm2至约100cm2、约4cm2至约75cm2、约4cm2至约50cm2、约4cm2至约10cm2、约10cm2至约300cm2、约50cm2至约300cm2、约75cm2至约300cm2、约100cm2至约300cm2、约200cm2至约300cm2、约50cm2至约250cm2、约100cm2至约200cm2、约50cm2至约150cm2、约100cm2至约200cm2或者约150cm2至约250cm2)。
[0160]
本文还提供了制造本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)的方法。本文还提供了制造本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)的方法。在一些情况中，本文提供的制造纤维蛋白水凝胶的方法包括制造胶凝时间延迟(例如，纤维蛋白水凝胶中的纤维蛋白延迟聚合)的纤维蛋白水凝胶。例如，在纤维蛋白水凝胶中包含式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体可有效延迟纤维蛋白水凝胶的胶凝时间(例如，纤维蛋白水凝胶中的纤维蛋白延迟聚合)。本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可使用任何合适的方法制造。在一些情况中，式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体可与作为溶液的一种或多种纤维蛋白原多肽和/或一种或多种凝血酶多肽混合。在一些情况中，式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体可与作为粉末的一种或多种纤维蛋白原多肽和/或一种或多种凝血酶多肽混合。在一些情况中，式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体可首先与一种或多种纤维蛋白原多肽混合，然后可添加一种或多种凝血酶多肽。在一些情况中，式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体可首先与一种或多种凝血酶多肽混合，然后可添加一种或多种纤维蛋白原多肽。例如，可使用离心混合、静态混合、盘管/螺旋钻/叶轮混合、动态/磁力/棒搅拌、气雾化、容器倒置、板振动器、涡旋和/或批量混合来混合(例如，均质混合)一种或多种纤维蛋白原多肽、一种或多种凝血酶多肽以及式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体，以制造本文提供的纤维蛋白水凝胶。在一些情况中，可通过注塑成型、压制、喷漆和/或3d打印用于纤维蛋白水凝胶的胶凝混合物。在一些情况中，可如实施例1所述制造纤维蛋白水凝胶。
[0161]
本文还提供了使用本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白
原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)的方法。在一些情况中，本文还提供了使用本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)的方法。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架(例如，可降解支架)以用于细胞培养应用。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架(例如，可降解支架)以用于培养干细胞，例如，人胚胎干细胞(hesc)和诱导多能干细胞(ipsc)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架(例如，可降解支架)以用于培养视网膜色素上皮(rpe)细胞(例如，hesc来源的rpe细胞或ipsc来源的rpe细胞)。
[0162]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶用于细胞培养应用，该纤维蛋白水凝胶可在细胞培养容器中(例如，可在其中聚合)。可在其中使用本文提供的纤维蛋白水凝胶的细胞培养容器的实例包括但不限于细胞培养皿，细胞培养板，例如多孔细胞培养板(例如，4孔细胞培养板、6孔细胞培养板、8孔细胞培养板、12孔细胞培养板和24孔细胞培养板)，细胞培养瓶(例如，t25孔细胞培养瓶、t75孔细胞培养瓶、t115孔细胞培养瓶、t125孔细胞培养瓶、t150孔细胞培养瓶和t225细胞培养瓶)，定制载板、载玻片和盖玻片以及transwell型插入件(通透型插入件)。在一些情况中，细胞培养容器可如图14、图16、图17和/或图18中所示。
[0163]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架(例如，可降解支架)以用于细胞移植(例如，诸如hesc和ipsc的干细胞的视网膜下细胞移植)。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架(例如，可降解支架)以将rpe细胞(例如，hesc来源的rpe细胞或ipsc来源的rpe细胞)移植到有需要的哺乳动物(例如，人)中(例如，患有黄斑变性的哺乳动物，例如人)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架以用于如在别处所述的细胞移植(例如，参见第2020/0061246号美国专利申请公开和第2020/0157497号美国专利申请公开)。
[0164]
在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架(例如，可降解支架)以用于组织工程应用。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架(例如，可降解支架)以用于器官或组织，例如骨、肝、皮肤、肾和角膜。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可用作支架(例如，可降解支架)以用于伤口愈合。
[0165]
在一些情况中，本文提供了使用tb、eb和/或它们的一种或多种异构体来改变(例如减慢)哺乳动物中的纤维蛋白聚合(例如，使哺乳动物中的血液凝结减慢)的方法。在一些情况中，本文还提供了使用式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体来改变(例如减慢)哺乳动物中的纤维蛋白聚合(例如，使哺乳动物中的血液凝结减慢)的方法。例如，式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体可用于减慢凝块形成(例如，体内凝块形成)。例如，式(i)或式(ii)的化合物，例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体可用于减少或消除凝血酶形成(例如，在诸如减慢凝块形成(例如，中风、心肌梗塞和血栓形成之类的疾病中)。
[0166]
本文还提供了储存(例如运输)本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)的方法。在一些情况中，本文还提供了储存(例如运输)本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)
例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)的方法。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可在载板(例如，载片、板和模具)的表面上形成。在一些情况中，可将载板表面上的纤维蛋白水凝胶封装在容器(例如小袋)中。在一些情况中，可将载板表面上的两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)纤维蛋白水凝胶封装在单个容器(例如小袋)中。
[0167]
在一些情况中，在载板表面上的本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可覆盖有遮罩板。在一些情况中，在载板表面上的本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可覆盖有遮罩板。例如，遮罩板可附接于表面上具有纤维蛋白水凝胶的载板(例如，可卡扣到上面、旋到上面、磁性附接至或滑动到上面)，以使得纤维蛋白水凝胶在载板和遮罩板之间。在一些情况中，遮罩板可保护水凝胶的表面不受损伤。
[0168]
在一些情况中，可堆叠在载板表面上的两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)纤维蛋白水凝胶(例如，使得堆叠体交替载板和纤维蛋白水凝胶)。例如，当堆叠在载板表面上的两个或更多个纤维蛋白水凝胶时，该堆叠体中的任何一个或多个载板可包括附接于载板的遮罩。例如，当堆叠在载板表面上的两个或更多个纤维蛋白水凝胶时，可将单个遮罩板附接于堆叠体的载板。在一些情况中，当堆叠在载板表面上的两个或更多个纤维蛋白水凝胶时，该堆叠体中的任何一个或多个载板可包括在载板的表面(例如，与具有纤维蛋白水凝胶的表面相对的表面)上的一个或多个凹槽(例如，使得当在载板表面上的两个或更多个纤维蛋白水凝胶被堆叠时，载板的带凹槽表面可用作遮罩板)。
[0169]
在一些情况中，在载板表面上的本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有延长的储存期(例如，相比于不在载板上的纤维蛋白水凝胶而言)。在一些情况中，在载板表面上的本文提供的纤维蛋白水凝胶(例如，包括一种或多种纤维蛋白原多肽，一种或多种凝血酶多肽，和式(i)或式(ii)的化合物例如tb、eb和/或它们的一种或多种异构体的纤维蛋白水凝胶)可具有延长的储存期(例如，相比于不在载板上的纤维蛋白水凝胶而言)。例如，在载板表面上的本文提供的纤维蛋白水凝胶在储存(和运输)期间可以是稳定的(例如，不降解和/或失去含水量)。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶可被封装在一种或多种可稳定纤维蛋白水凝胶的试剂中(例如，一种或多种抗纤维蛋白溶解剂，例如抑肽酶、氨甲环酸和α-己酸)。在一些情况中，在载板表面上的本文提供的纤维蛋白水凝胶可稳定约1天至约24个月(例如，约1天至约18个月、约1天至约12个月、约1天至约6个月、约1天至约3个月、约1天至约1个月、约1天至约1周、约1周至约24个月、约1个月至约24个月、约3个月至约24个月、约6个月至约24个月、约12个月至约24个月、或约18个月至约24个月)。本文提供的纤维蛋白水凝胶可在任何合适的温度下稳定。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶在约4℃至约38℃下可以是稳定的。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶在约4℃下可以是稳定的。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶在约24℃下可以是稳定的。在一些情况中，本文提供的纤维蛋白水凝胶在约37℃下可以是稳定的。
[0170]
以下实施例将进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明
的范围。
[0171]
实施例
[0172]
实施例1：通过添加偶氮染料改变纤维蛋白水凝胶的胶凝和降解动力学
[0173]
纤维蛋白是一种可降解的生物聚合物，具有出色的临床安全表现。较高机械强度的纤维蛋白水凝胶的使用受到纤维蛋白聚合速度快的限制。较高机械强度(纤维蛋白原》30mg/ml)的纤维蛋白支架的使用可用于细胞的手术植入。然而，纤维蛋白在纤维蛋白原浓度下的快速聚合削弱了这些纤维蛋白支架的规模化生产的能力。
[0174]
本实施例描述了偶氮染料台盼蓝(tb)可减慢纤维蛋白胶凝动力学的发现，这允许在高浓度下更均匀地混合纤维蛋白原和凝血酶。对密切相关的化合物进行筛选鉴定出伊文思蓝(eb)(tb的一种异构体)具有相似的活性。tb和eb均表现出浓度依赖性的凝结时间增加，但eb的影响更大。虽然tb或eb增加了胶凝时间，但是总的聚合时间不受影响。扫描电子显微镜(sem)显示出相似的表面拓扑，但是透射em(tem)显示出通过tb或eb形成的凝胶相比于对照具有更高的交联密度。
[0175]
材料和方法
[0176]
通过血凝分析仪进行的纤维蛋白原凝结测定
[0177]
确定各种化合物对凝结时间的影响。通过将tb溶解在1x柠檬酸盐缓冲液(20mm柠檬酸钠、100mm氯化钠ph 7.4)中，在tb溶解点(4.58mm tb浓度)下进行初始测定。然后，在磷酸盐缓冲盐水(pbs；康宁公司(corning))中制备总共10种不同化学添加剂(sigma-aldrich；密苏里州圣路易斯)的4.58mm储备溶液，包括tb、eb、聚乙二醇1000(peg)、荧光素钠(sf)、俾斯麦棕r(bbr)、苯磺酸钠(sbs)、刚果红(cr)、阿尔新蓝(ab)、亮蓝r(bb)和吲哚菁绿(icg)。将化学添加剂添加到临床纤维蛋白原标准品(stago(斯塔高公司)；新泽西州帕西帕尼)或evicel生物活性组分2(bac2)(ethicon(爱惜康))的1:20稀释液中，其是纤维蛋白原溶液(60mg/ml)并用作各种样品。每个实验中使用相同批次的bac2，以最大程度地减少批次之间的差异。
[0178]
clauss(克劳斯)法用于测量纤维蛋白凝结时间。根据制造商的方案，使用stago血凝分析仪(stago；新泽西州帕西帕尼)进行凝结测定。stago start采用基于粘度的机械凝结检测，与样品颜色和混浊度无关。根据方案，将样品在owren-koller缓冲液(stago)中以1:20稀释并在37℃下平衡5分钟。将每个样品装入带有磁珠的比色皿中。为了开始凝结测定，将含有凝血酶的纤维蛋白原测定试剂(stago)添加到样品中，并通过仪器对凝结进行计时。
[0179]
在筛选期间显著影响凝结时间的化学物质(tb和eb)进行浓度依赖性效应测试。在pbs中制备浓度为0％(对照)、0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％和0.4％w/v稀释的tb和eb溶液。然后向溶液添加纤维蛋白原以建立1:20稀释样品，并且使用血凝分析仪进行凝结时间测定。
[0180]
流变学和分析
[0181]
使用discovery hybrid rheometer 2流变仪(ta instruments公司；特拉华州纽卡斯尔)上的振荡剪切流变学表征纤维蛋白凝胶的粘弹性机械性能，该流变仪具有20mm锥板几何，其具有1
°
角和20mm平台。在每次实验之前进行惯性、摩擦和旋转映射校准。帕尔贴(peltier)温控台保持37℃，并使用溶剂捕集器在持续超过20分钟的实验过程中控制蒸发。
通过在平台上混合规定浓度的纤维蛋白原、染料和凝血酶来制备凝胶。在开始第一次实验之前，在合并后立即将几何头降低至500μm(～1-3秒)。以1％应变和10rad/s角频率的时间扫描监测凝胶化动力学。应变扫描在1hz频率下从0.01-1000％应变测量。使用在1％应变下从0.01-3hz测量的频率扫描来确认纤维蛋白与频率的无关性。
[0182]
对不含染料(仅pbs)、tb、eb和peg的样品进行流变学测定。储液纤维蛋白原(evicel)按原样使用或用pbs稀释。在具有或不具有各种染料的情况下，在pbs中稀释凝血酶。为了确定胶凝时间，使用10mg/ml纤维蛋白原、1u/ml凝血酶和0.01％w/v染料浓度的最终混合物浓度。时间扫描进行最长达20分钟，在这之后，非胶凝样品中的一些微小的蒸发影响引入噪音，并且无法可靠地检测储能模量(g')。胶凝时间定义为g'超过g"(粘性模量)并随时间继续增加的点。
[0183]
为了确定最终的聚合时间和所得的剪切模量，使用40mg/ml纤维蛋白原、33u/ml凝血酶和0.12％w/v染料的最终浓度，以模拟其他地方描述的纤维蛋白支架参数(参见，例如，gandhi等人，2018acta biomater.,67:134-46)。进行2小时的时间扫描，并在时间扫描之后测量应变扫描以确认最终聚合已经发生。剪切模量通过应变扫描线性区域(0.01％至0.5％应变)内的平均值来确定。针对最终剪切模量定义95％置信区间，并将范围下限值用作确定最终聚合时间的阈值。
[0184]
电子显微技术(em)
[0185]
进行扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)来研究化学添加剂对原纤维形成微观结构的影响。如其他地方所述用pbs、tb或eb制造凝胶(参见，例如gandhi等人,2018acta biomater.,67:134-46)，并且具有以下修改。简而言之，将终浓度为40mg/ml的纤维蛋白原、33u/ml凝血酶和0.12％w/v染料的混合物铺覆(plate)到定制的乙缩醛模具中，以形成300μm的片材。在37℃下孵育2小时后，凝胶在pbs中水合至少15分钟。
[0186]
然后使凝胶在含有1.0mm mgcl2和0.13mm cacl2的0.1m磷酸盐缓冲液(ph 7)中的2.5％多聚甲醛和1％戊二醛中固定过夜。固定后，处理凝胶以用于扫描电子显微镜法(sem)。通过首先将凝胶脱水，嵌入塑料树脂中，并切成100nm的厚度来处理用于tem的样品。使用hitachi s-4700(日立公司高新技术公司；伊利诺伊州绍姆堡)显微镜进行sem成像。使用jeol 1400显微镜(jeol；马萨诸塞州皮博迪)对针对tem处理的切片进行成像。
[0187]
建模
[0188]
使用剪切模量(g')对比时间数据进行建模，所述时间数据是使用终浓度为40mg/ml纤维蛋白原、33u/ml凝血酶和0.12％染料的凝胶进行每次时间扫描时的时间数据。如其他地方所述使用双指数模型(参见，例如，wedgwood等人,macromolecular symposia,334:117-25(2013)；和moreno-arotzena等人,materials(basel),8:1636-51(2015)。采用以下方程：
[0189][0190]
该方程模型假设有快(1)和慢(2)的动力学速率。因此，g'1和g'2是各自的速率相关参数，r1和r2是各自的速率常数，并且xc是时间位移参数。使用matlab(mathworks；马萨诸塞州纳提克)利用模型拟合函数进行建模。参数定义为r1》r2且xc为正。每个样品运行都与模型最佳拟合以生成r2》0.98。
[0191]
降解
[0192]
如上文电子显微技术部分所述铸造纤维蛋白凝胶并在pbs中水合。使用冲头产生5.0mm x 1.5mm的凝胶。所有凝胶的测量厚度为309
±
69μm。
[0193]
然后将纤维蛋白凝胶浸没在玻璃底皮氏培养皿(mattek)中的含有1.6u/ml纤溶酶原(sigma-aldrich；密苏里州圣路易斯)和17,000u/ml组织纤溶酶原激活剂(sigma-aldrich)的pbs溶液中，在37℃下孵育以引发降解，如其他地方所述(参见，例如，gandhi等人，2018acta biomater 67：134-46)。通过使用envisu r2110(leica；德国韦茨拉尔)光学相干断层扫描仪(oct)成像来监测纤维蛋白凝胶厚度随时间的变化，并使用随附的invivovue软件(leica)中的卡尺工具进行量化。每10分钟连续测量凝胶厚度，直到没有留下不溶性凝胶的物理证据。在每个截面的3个不同位置(左、中、右)测量凝胶的厚度。对每个位置的测量值归一化为其初始值，然后取平均值。
[0194]
统计
[0195]
所有数据以平均值
±
标准偏差来提供。使用jmp 14(sas公司；北科罗拉多州凯利)分析数据。对于柠檬酸盐和柠檬酸盐 tb的血凝分析仪测定以及针对tb和eb胶凝时间的流变测定，使用学生t检验。对于所有其他分析，使用单向anova测试。在anova分析后，使用tukey hsd测试在组间测试显著性。p《0.05被认为有统计学显著性。
[0196]
结果
[0197]
筛选改变纤维蛋白凝胶动力学的化合物
[0198]
为了提高手术植入期间纤维蛋白凝胶的可见度，观察到在凝胶混合物中包含tb改善了胶凝反应的液相的处理。为了确定tb是否改变胶凝动力学，使用血凝分析仪检查纤维蛋白的凝结时间。血凝分析仪是一种专门的临床仪器，用于通过克劳斯方法(clauss，acta haematol.，17：237-46(1957))量化患者血液样品中的纤维蛋白原浓度。该方法遵循纤维蛋白原和凝血酶的混合物初始凝结所需的时间。由于与使用各种颜色染料的潜在相互作用，本工作选择的血凝分析仪采用机械检测，而不是更常见的光学检测器系统。使用制造商的临床标准品来测试添加tb是否会改变胶凝动力学。仅在1x柠檬酸盐缓冲液(20mm柠檬酸钠、100mm氯化钠ph 7.4)中稀释的样品的胶凝时间为9.2
±
0.4秒，在柠檬酸盐 tb中稀释的样品的胶凝时间较慢，为14.6
±
1.5秒(平均值
±
sd,n＝8,p《0.001)(图3a)。
[0199]
为了更好地理解tb如何改变胶凝动力学以及鉴定出其他可能在减慢纤维蛋白凝胶动力学方面表现更好的小分子，进行相关化合物的筛选。筛选的化学库的组成基于tb的特性，包括摩尔大小、电荷和化学结构中的官能团。表1列出了选择用于筛选的化学试剂，其结构概括于图2中。筛选使用血凝分析仪进行，但不使用临床标准品，而是以固定浓度使用来自组织胶的纤维蛋白原和凝血酶。所有试剂均在最高可达4.58mm(tb的溶解点)的多个浓度下进行测试，苯磺酸钠(sbs)除外，其也在18.32mm下进行了测试，以匹配tb的总电荷。刚果红(cr)、阿尔新蓝(ab)、亮蓝(bb)和吲哚菁绿(icg)在测定过程中均反复引起蛋白质沉淀，因此被排除在进一步分析之外(表1)。其余化合物的胶凝时间如下：对照(pbs)为18.4
±
1.0秒，tb为46.3
±
3.2秒，eb为》70秒，peg为16.6
±
3.0秒，sf为18.5
±
2.6秒，bbr为18.9
±
3.3秒，并且sbs为17.8
±
1.1秒(n＝10，p《0.001)(图3b)。根据事后tukeys hsd检验，tb与所有其他组有统计学差异(p《0.001)。每次试验的eb测试时间超过70秒，超出了分析仪的检测限，但在测定完成后，手动确认含有eb的纤维蛋白已胶凝。尽管eb延长的凝胶时间超出了仪器准确测量的能力，但由于eb缺乏准确的凝结时间，因此将其排除在统计分析之外。这些数
据表明tb和eb改变了纤维蛋白的凝胶动力学，但这并不是相关化合物的普遍特性。
[0200]
表1：通过筛选研究化合物对纤维蛋白凝结时间的影响。
[0201][0202][0203]
tb和eb的影响/作用是剂量依赖性的。
[0204]
由于tb和eb似乎对凝结时间有影响，因此使用上一节中描述的凝结测定，以组织胶作为纤维蛋白原和凝血酶的来源，改变添加的染料的浓度，看是否与凝结时间存在关系。如图4a所示，在不具有染料(0％w/v)的情况下，凝胶的凝结时间为17.5
±
1.1秒(n＝10)。用0.01％、0.05％和0.1％(w/v)eb制造的凝胶的凝结时间分别是19.4
±
0.7秒、34.8
±
4.7秒和43.6
±
2.5秒(n＝10)。使用0.2-0.4％eb制备的凝胶观察到凝结，但凝结时间》70秒，因此超出了血凝分析仪的检测范围。用0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％和0.4％(w/v)tb制造的凝胶的凝结时间分别为17.6
±
0.3秒、18.1
±
1.4秒、24.4
±
2.3秒、26.2
±
4.2秒、25.2
±
2.9秒和29.8
±
1.2秒(n＝10)。相对于纤维蛋白原浓度增加染料浓度使得凝结时间增加。
[0205]
为了检查tb或eb对胶凝动力学的影响与纤维蛋白原浓度无关，改变纤维蛋白原浓度，同时保持将染料浓度固定在0.1％w/v并且确定凝结时间(图4b)。在10.0mg/ml的纤维蛋白原浓度下，pbs、tb和eb的凝结时间分别为13.3
±
0.3秒、15.7
±
3.1秒和50.9
±
4.9秒。在10.9mg/ml的纤维蛋白原浓度下，pbs、tb和eb的凝结时间分别为10.3
±
0.2秒、16.3
±
0.4秒和39.5
±
3.3秒。在12.0mg/ml的纤维蛋白原浓度下，pbs、tb和eb的凝结时间分别为7.3
±
0.2秒、11.6
±
3.7秒和31.7
±
1.8秒。在13.3mg/ml的纤维蛋白原浓度下，pbs、tb和eb的凝结时间分别为6.0
±
0.3秒、18.1
±
0.4秒和25.7
±
1.0秒。在17.1mg/ml的纤维蛋白原浓度下，pbs、tb和eb的凝结时间分别为4.4
±
0.1秒、7.4
±
0.1秒和14.8
±
0.4秒。最后，在24.0mg/ml
的纤维蛋白原浓度下，pbs、tb和eb的凝结时间分别为3.6
±
0.1秒、5.6
±
0.1秒和8.9
±
2.3秒。所有3组趋势都证实了凝结时间与纤维蛋白原浓度之间成反比关系，正如clauss方法所预测的。染料似乎保持了它们增加的凝结时间而与纤维蛋白原浓度无关。
[0206]
通过流变仪确定较低纤维蛋白原浓度下的胶凝动力学
[0207]
流变仪用于证实使用血凝分析仪以及高机械强度支架中使用的较高纤维蛋白原浓度的测试条件所获得的结果。虽然凝结时间和胶凝时间有相似的特性，但由于各自测定中的差异，这些术语的使用是有区别的。然而，在较高纤维蛋白原浓度的凝胶对照中，凝血酶浓度降低了几个数量级，以根据流变仪的灵敏度评估初始胶凝时间。为了一致地检测胶凝时间，当g'值(剪切模量)变得大于g"值(粘性模量)时，对所有样品使用组织胶，将条件设置为10g/ml纤维蛋白原和1u/ml凝血酶终浓度。使用流变仪测试的样品条件包括使用pbs(对照)、tb、eb或peg溶液来稀释凝血酶，以使染料的最终凝胶浓度为0.01％w/v。对于具有较高染料浓度的eb样品，由于蒸发效应，胶凝时间太长而不能可靠地检测，即使当使用溶剂捕集器时也如此。然而，在将混合物静置后，通过机械方法确认了凝胶特性。除了pbs之外，由于潜在的质量摩尔浓度效应，使用peg作为阴性对照。
[0208]
总体而言，尽管时间尺度不同，但所有四个测试样品在流变测量中都显示出一些相似的趋势。最初，g'和g"值处于同一尺度(《2pa)。虽然有个别数据点报告g'值大于g"，但与没有凝血酶的测试条件(无初始胶凝)相比，这些值被认为是背景。因此，胶凝化时间计算为当g'值超过g"值并随时间继续增长时的时间(箭头，图5a)。所有四个测试样品都显示出清晰的点，g'值在该点开始随着时间而相对于g"值增加(图5a)。具有pbs和peg的样品显示出一旦胶凝化开始，则g'呈指数增长，而tb和eb显示出一旦胶凝化开始，则有更渐进的增长，然后是更加呈指数的增长。含有pbs的样品的胶凝时间为53.8
±
9.7秒(图5b)。含有tb的样品的胶凝时间为168.7
±
19.9秒。含有eb的样品的胶凝时间为232.1
±
19.3秒。含有peg的样品的胶凝时间为58.5
±
14.4秒。从统计学上看，存在着明显的趋势(n＝3,p《0.001)。在各组内，tb组与pbs和peg组(p《0.001)和eb组(p＝0.006)显著不同，而eb组与pbs和peg组显著不同(p《0.001)。pbs和peg组没有差异(p＝0.98)。
[0209]
在不同染料浓度下测试tb证实了先前建立的染料浓度和凝胶时间之间的剂量依赖性关系(图6)。在tb浓度为0％、0.005％、0.01％和0.12％w/v时，胶凝时间分别为53.8
±
9.7秒、106.4
±
22.5秒、168.7
±
19.9秒和206.7
±
31.3秒(n＝3)。
[0210]
通过流变仪确定较高纤维蛋白原浓度下的胶凝动力学
[0211]
在确认tb和eb(而非peg)造成胶凝时间显著增加后，测量聚合时间。聚合时间是水凝胶完全形成且不残留可溶性纤维蛋白单体的总时间。从功能上讲，这被定义为剪切模量不再变化的点。从定量上计，这定义为g'达到最大值并随时间趋于平台的点。
[0212]
为了测试包含tb和eb是否会改变聚合时间，在较长的时间范围内使用之前的流变仪设置。不幸的是，早在2小时就发现了蒸发效应。在10mg/ml纤维蛋白原、1u/ml凝血酶浓度下，pbs组在2小时内没有胶凝，并且在设置中可以看到蒸发效应，并且凝胶随时间收缩。当顶板被移除时，凝胶的机械操作显示聚合未完成，存在液体集中。表面是粘着的，并且明显存在非交联的纤维蛋白。为了可靠地测量聚合时间，增加纤维蛋白原和凝血酶的浓度。40mg/ml纤维蛋白原和33u/ml凝血酶终浓度能够在2小时内完全聚合(参见，例如，gandhi等人，acta biomater.,67:134-46(2018))。因此，在这些浓度下重复流变实验。使用0.12％w/
v的tb、eb和peg的终浓度。
[0213]
在纤维蛋白原和凝血酶浓度较高的情况下，tb和eb继续对胶凝时间产生影响。这可以在log(g')与log(时间)的图(图7a)上可视化，其中tb和eb组在位移了的时间延迟后显示初始胶凝化(图7b)。在这些较高浓度下，用tb制造的凝胶的胶凝时间为42.4
±
19.4秒，用eb制造的凝胶的胶凝时间为89.6
±
17.9秒，存在显著性差异(n＝3，p＝0.037)(图7c)。
[0214]
与之前的实验类似，剪切模量(g')在所有四种条件下都显示出随着时间而增加(图8a)。pbs和peg组在第一个可检测时间点(12秒)时均显示g'值大于g"值，表明两组均已过了初始胶凝时间。tb和eb显示胶凝延迟，但似乎很快接近pbs和peg组。接近1000秒标记时，所有四个组似乎都显示出类似的g'随着时间的增长。在时间扫描结束时测量应变扫描，以确认凝胶在2小时的时间范围内完成聚合。使用其他地方描述的流变数据验证应变扫描线性部分的剪切模量值(参见，例如，wedgwood等人，macromolecular symposia，334：117-25(2013)；以及moreno-arotzena等人,materials(basel),8:1636-51(2015))，并用于确定最终的凝胶剪切模量。使用该剪切模量值，计算每个样品的聚合时间。pbs、tb、eb和peg组的聚合时间分别为97.0
±
14.9分钟、94.6
±
8.3分钟、106.2
±
10.7分钟、93.8
±
17.0分钟(n＝3,p＝0.654)(图8b)。这些数据的结论是，包含tb或eb不会改变最终的聚合时间。
[0215]
流变剪切模量
[0216]
剪切模量(g')通常被认为是纤维蛋白水凝胶机械性能的指标，剪切模量值越高表明凝胶越强或越硬。在时间扫描数据中，剪切模量随着时间而增加，最初呈指数增长，随后迅速进入平台状态(图8a)。图7a和8a显示了相同的数据，但是图7a使用对数尺度，而图8a没有使组间差异可视化。在高浓度凝胶的时间扫描结束时测量应变扫描以获得最终的剪切模量。应变扫描证实平台数据为最终剪切模量(g')。pbs、tb、eb和peg组的最终剪切模量为1664
±
308pa、2197
±
221pa、2077
±
441pa和1606
±
169pa(图8b)。虽然tb似乎大于pbs和peg对照，但没有统计学显著结果(n＝3，p＝0.089)。
[0217]
建模动力学
[0218]
先前的工作已经将纤维蛋白水凝胶动力学拟合为双指数模型(参见，例如，moreno-arotzena et al.,materials(basel),8:1636-51(2015))。在该模型中，通过随时间的剪切模量所测量的胶凝化由快反应速率和慢反应速率组成。每个时间扫描系列都被拟合到双指数模型，以确定快(1)和慢(2)相关参数、反应速率和时间位移参数(表2和图9)。pbs、tb、eb和peg组的时间位移参数为19.7
±
7.2秒、62.9
±
9.7秒、110.6
±
7.6秒和20.3
±
5.0(n＝3,p《0.001)(图9a)。在各组内，除peg组和pbs组之间(p＝0.999)外，所有组均彼此显著不同(p《0.001)。这再次证实了tb组和eb组胶凝起始延迟的变化，并证实该效应不是由于摩尔浓度的变化造成的。为了了解反应速率是否发生变化，比较了快反应速率与慢反应速率的比值。pbs、tb、eb和peg组的r
l
/r2比值别为10.2
±
1.6秒-1
、6.1
±
1.0秒-1
、5.2
±
1.2秒-1
和11.0
±
4.6秒-1
、(n＝3,p＝0.654)(图9b)。这些数据表明反应速率可能发生变化，尽管数据并不显著。
[0219]
表2：使用双指数模型(avg
±
sd,n＝3)拟合不同研究组的剪切模量(g')与时间(t)数据得出的建模参数。
[0220]
[0221] pbstbebpegg
′11020
±
5251555
±
92927
±
395880
±
467g
′2822
±
98800
±
186787
±
210895
±
233xc20
±
763
±
10111
±
820
±
5r13287
±
2952679
±
3663720
±
7323707
±
1120r2325
±
26455
±
131739
±
205345
±
37
[0222]
电子显微技术成像
[0223]
为了检测由tb和eb制造的凝胶中的微结构变化，对用定制模具制造的高浓度凝胶进行扫描电子显微技术(sem)和透射电子显微技术(tem)。用pbs制造的纤维蛋白凝胶似乎具有出乎意料的表面拓扑，具有显著的原纤维排列，以产生具有坑状网状空隙的更光滑表面。由于这是出乎意料的，对在没有模具的情况下的pbs纤维蛋白凝胶进行sem。这些凝胶表现为不同直径原纤维的随机网络交联形成网状物。
[0224]
用tb和eb制造的凝胶看上去具有类似sem的形貌(图10)。原纤维与顶表面平面平行对齐，表面上出现了相当不均匀的坑状空隙。在更高的放大倍数下，可以在凝胶的本体体积内看到单独的原纤维。
[0225]
进行tem以使纤维蛋白的截面可视化。三种条件的tem图像显示，用pbs制造的凝胶与用tb或eb制造的凝胶之间存在显著差异(图11)。pbs纤维蛋白凝胶似乎具有更大的网孔空间，具有大范围的原纤维直径和取向。存在许多直径在100-200nm范围内的原纤维。tb纤维蛋白凝胶在原纤维直径、原纤维长度、原纤维密度和交联密度方面似乎更加均匀。原纤维直径看起来比pbs凝胶中的原纤维直径小得多，最大的直径在50-75nm的范围内。eb原纤维凝胶与tb纤维蛋白凝胶相似，并具有更加均匀的截面形貌。在eb纤维蛋白凝胶中，网尺寸似乎小于tb纤维蛋白凝胶的网尺寸。在eb纤维蛋白凝胶中，很难辨别单独的原纤维，这表明原纤维直径更小，交联密度更高。在eb纤维蛋白凝胶中，最大的直径在40-60nm的范围内。所有三种凝胶的边缘看上去非常暗，表明填充密度增加，这再次证实了sem图像的发现结果。
[0226]
这些数据的结论是tb和eb改变了纤维蛋白凝胶的微结构，产生了更均匀的原纤维尺寸和交联密度。
[0227]
纤维蛋白凝胶降解动力学
[0228]
利用纤维蛋白凝胶作为细胞移植支架的原因之一是其富有吸引力的降解特性。例如，植入猪眼视网膜下腔的纤维蛋白凝胶可以在8周内安全降解(参见gandhi等人，plos one,15:e0227641(2020))。由于这一发现，评估了tb或eb是否会在体外改变凝胶的降解动力学。
[0229]
使用pbs、tb或eb生成几何为1.5mm宽x 5.0mm长x 0.2mm厚的纤维蛋白凝胶。凝胶在pbs中水合，然后在37℃下，在组织纤溶酶原激活剂(tpa)和纤溶酶原(p)的溶液孵育。使用光学相干断层扫描(oct)对凝胶随时间的变化进行成像，以使截面厚度可视化(图12a)。随着时间的推移，凝胶的厚度看上去有所减少。随着厚度减少，凝胶看上去略微弯曲。表面降解看上去不均匀，其中，沿表面不同点的降解水平不同。三组的oct成像看上去没有出现定性差异，但是tb和eb在任何给定截面中看上去比pbs具有更均匀的降解。
[0230]
从量上看，eb纤维蛋白凝胶似乎比tb和pbs凝胶降解得更慢(图12b)。随着时间的推移，所有三组的剩余凝胶厚度看上去大多呈线性。对于pbs、tb和eb凝胶，降解时间分别为
23
±
10分钟、33
±
18分钟和78
±
37分钟(图12c)。虽然eb凝胶似乎具有更长的降解时间，但是结果没有统计学显著性(n＝3，p＝0.068)。
[0231]
这些结果共同证明，tb和eb可以增加纤维蛋白水凝胶的胶凝时间，而不会不利地改变最终的聚合时间或剪切模量。例如，tb和eb可以改变纤维蛋白凝胶的微结构，产生更小、更均匀的原纤维并具有更高的交联密度。因此，在纤维蛋白凝胶溶液中添加tb和eb可以改善纤维蛋白制造的处理时间，从而提供替代方法来生成高机械强度的纤维蛋白凝胶，用于商业规模的细胞支架应用。
[0232]
实施例2：制造纤维蛋白水凝胶载板的方法
[0233]
纤维蛋白水凝胶由于其生物相容性和可生物降解特性，因此可用于再生医学应用。本实施例描述了用于生成和密封纤维蛋白凝胶载片的示例性方案。
[0234][0235][0236][0237]
设备生物安全柜孵育器冰箱37℃水浴1ml移液器移液辅助器带盖板和12个螺丝的铝载片支架
[0238]
[0239][0240][0241]
实施例3：封装纤维蛋白水凝胶支架板的方法
[0242]
该实施例描述了制造本文提供的纤维蛋白水凝胶的规模化方法，其具有更稳定的
储存期并且使得载板的运输更容易。
[0243]
按照实施例2在载板内制造纤维蛋白水凝胶。将遮罩板卡扣到每个载板上以保护凝胶的顶表面免受损伤。提供足够的间隙以防止遮罩板和凝胶表面接触并允许液体保持凝胶水合。3”x 5”预灭菌箔袋中装有5ml含2.5mg/ml氨甲环酸的pbs。将带有遮罩板的载板放置在箔内以完全浸没在液体中。对箔袋进行热密封。然后将密封的产品储存在不同温度(4℃至37℃范围)下。然后在不同的时间点使用封装的产品以测试储存期。
[0244]
该程序可以使用现行的良好生产规范(cgmp)来执行。最终的封装产品的无菌性可以通过在生物安全柜内无菌地执行封装步骤来维持。
[0245]
实施例4：示例性实施方式
[0246]
实施方式1：一种纤维蛋白水凝胶，包括(a)纤维蛋白原多肽、(b)凝血酶多肽和(c)台盼蓝或其异构体。
[0247]
实施方式2：实施方式1的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含所述台盼蓝。
[0248]
实施方式3：实施方式1的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含所述异构体。
[0249]
实施方式4：实施方式1-3中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约10mg/ml至约60mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0250]
实施方式5：实施方式4的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含40mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0251]
实施方式6：实施方式1-3中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.1u/ml至约1200u/ml的所述凝血酶多肽。
[0252]
实施方式7：实施方式6的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约33u/ml的所述凝血酶多肽。
[0253]
实施方式8：实施方式1-3中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.0001％(重量/重量)至约0.5％(重量/重量)的所述台盼蓝。
[0254]
实施方式9：实施方式8的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.15％(重量/重量)的所述台盼蓝。
[0255]
实施方式10：实施方式1-9中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的聚合时间为约2秒至约1200秒。
[0256]
实施方式11：实施方式1-9中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。
[0257]
实施方式12：实施方式1-9中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。
[0258]
实施方式13：实施方式1-9中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约1900pa至约2420pa的剪切模量。
[0259]
实施方式14：实施方式1-9中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的表面积为约0.05cm2至约300cm2。
[0260]
实施方式15：实施方式1-9中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的厚度为约0.1μm至约1,000μm。
[0261]
实施方式16：实施方式1-9中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶通过注塑成型制造。
[0262]
实施方式17：一种纤维蛋白水凝胶，包括(a)纤维蛋白原多肽、(b)凝血酶多肽和(c)伊文斯蓝或其异构体。
[0263]
实施方式18：实施方式17的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含所述伊文斯蓝。
[0264]
实施方式19：实施方式17的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含所述异构体。
[0265]
实施方式20：实施方式17-19中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约10mg/ml至约60mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0266]
实施方式21：实施方式17的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含40mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0267]
实施方式22：实施方式17-19中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.1u/ml至约1200u/ml的所述凝血酶多肽。
[0268]
实施方式23：实施方式22的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约33u/ml的所述凝血酶多肽。
[0269]
实施方式24：实施方式17-22中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.0001％(重量/重量)至约0.5％(重量/重量)的所述伊文斯蓝。
[0270]
实施方式25：实施方式24的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.15％(重量/重量)的所述伊文斯蓝。
[0271]
实施方式26：实施方式17-25中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的聚合时间为约2秒至约1200秒。
[0272]
实施方式27：实施方式17-25中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。
[0273]
实施方式28：实施方式17-25中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。
[0274]
实施方式29：实施方式17-25中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约1600pa至约2520pa的剪切模量。
[0275]
实施方式30：实施方式17-25中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的表面积为约0.05cm2至约300cm2。
[0276]
实施方式31：实施方式17-25中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的厚度为约0.1μm至约1,000μm。
[0277]
实施方式32：实施方式17-25中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶通过注塑成型制造。
[0278]
实施方式33：一种纤维蛋白水凝胶，其包括(a)大于约30mg/ml的纤维蛋白原多肽；和(b)凝血酶多肽；其中，纤维蛋白水凝胶包括约1900pa至约2420pa的剪切模量。
[0279]
实施方式34：实施方式33的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约30mg/ml至约60mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0280]
实施方式35：实施方式34的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含
40mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0281]
实施方式36：实施方式33-35中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.1u/ml至约1200u/ml的所述凝血酶多肽。
[0282]
实施方式37：实施方式36的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约33u/ml的所述凝血酶多肽。
[0283]
实施方式38：实施方式33-35中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含台盼蓝或其异构体。
[0284]
实施方式39：实施方式38的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.0001％(重量/重量)至约0.5％(重量/重量)的所述台盼蓝或其异构体。
[0285]
实施方式40：实施方式33-37中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含伊文斯蓝或其异构体。
[0286]
实施方式41：实施方式40的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.0001％(重量/重量)至约0.5％(重量/重量)的所述伊文斯蓝或其异构体。
[0287]
实施方式42：实施方式33-41中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的聚合时间为约2秒至约1200秒。
[0288]
实施方式43：实施方式33-41中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。
[0289]
实施方式44：实施方式33-41中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。
[0290]
实施方式45：实施方式33-41中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的表面积为约0.05cm2至约300cm2。
[0291]
实施方式46：实施方式33-41中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的厚度为约0.1μm至约1,000μm。
[0292]
实施方式47：实施方式33-41中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶通过注塑成型制造。
[0293]
实施方式48：一种纤维蛋白水凝胶，其包括(a)大于约30mg/ml的纤维蛋白原多肽；和(b)凝血酶多肽；其中，所述纤维蛋白水凝胶的聚合时间为约2秒至约1200秒。
[0294]
实施方式49：实施方式48的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约30mg/ml至约60mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0295]
实施方式50：实施方式49的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含40mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0296]
实施方式51：实施方式48-50中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.1u/ml至约1200u/ml的所述凝血酶多肽。
[0297]
实施方式52：实施方式51的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约33u/ml的所述凝血酶多肽。
[0298]
实施方式53：实施方式48-52中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含台盼蓝或其异构体。
[0299]
实施方式54：实施方式53的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.0001％(重量/重量)至约0.5％(重量/重量)的所述台盼蓝或其异构体。
[0300]
实施方式55：实施方式48-52中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含伊文斯蓝或其异构体。
[0301]
实施方式56：实施方式55的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.0001％(重量/重量)至约0.5％(重量/重量)的所述伊文斯蓝或其异构体。
[0302]
实施方式57：实施方式48-56中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约1900pa至约2420pa的剪切模量。
[0303]
实施方式58：实施方式48-56中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。
[0304]
实施方式59：实施方式48-56中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。
[0305]
实施方式60：实施方式48-56中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的表面积为约0.05cm2至约300cm2。
[0306]
实施方式61：实施方式48-56中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的厚度为约0.1μm至约1,000μm。
[0307]
实施方式62：实施方式48-56中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶通过注塑成型制造。
[0308]
实施方式63：一种纤维蛋白水凝胶，包括(a)纤维蛋白原多肽、(b)凝血酶多肽和(c)式(i)的化合物：
[0309][0310]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0311]rc1
和r
d1
各自独立地选自h和c
1-3
烷基，或者
[0312]rc1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0313][0314]
其中，每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。
[0315]
实施方式64：实施方式63的纤维蛋白水凝胶，其中，r
c1
和r
d1
各自独立地选自h和c1‑‑3烷基。
[0316]
实施方式65：实施方式63的纤维蛋白水凝胶，其中，式(i)的化合物具有下式：
[0317][0318]
或其药学上可接受的盐。
[0319]
实施方式66：实施方式63的纤维蛋白水凝胶，其中，r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0320][0321]
实施方式67：实施方式66的纤维蛋白水凝胶，其中，r1是c
1-3
烷基。
[0322]
实施方式68：实施方式66的纤维蛋白水凝胶，其中，r1是c
1-3
烷氧基。
[0323]
实施方式69：实施方式66的纤维蛋白水凝胶，其中，r
c1
和r
d1
与它们连接的n原子一起形成下式的基团：
[0324][0325]
实施方式70：实施方式63的纤维蛋白水凝胶，其中，式(i)的化合物具有下式：
[0326][0327]
或其药学上可接受的盐。
[0328]
实施方式71：实施方式63的纤维蛋白水凝胶，其中，式(i)的化合物具有下式：
[0329][0330]
或其药学上可接受的盐。
[0331]
实施方式72：实施方式63的纤维蛋白水凝胶，其中，式(i)的化合物具有下式：
[0332][0333]
或其药学上可接受的盐。
[0334]
实施方式73：实施方式63的纤维蛋白水凝胶，其中，式(i)的化合物具有下式：
[0335][0336]
或其药学上可接受的盐。
[0337]
实施方式74：实施方式63-73中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约10mg/ml至约60mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0338]
实施方式75：实施方式74的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含
40mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0339]
实施方式76：实施方式63-73中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.1u/ml至约1200u/ml的所述凝血酶多肽。
[0340]
实施方式77：实施方式76的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约33u/ml的所述凝血酶多肽。
[0341]
实施方式78：实施方式63-77中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的聚合时间为约2秒至约1200秒。
[0342]
实施方式79：实施方式63-77中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。
[0343]
实施方式80：实施方式63-77中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。
[0344]
实施方式81：实施方式63-77中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约1900pa至约2420pa的剪切模量。
[0345]
实施方式82：实施方式63-77中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的表面积为约0.05cm2至约300cm2。
[0346]
实施方式83：实施方式63-77中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的厚度为约0.1μm至约1,000μm。
[0347]
实施方式84：实施方式63-77中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶通过注塑成型制造。
[0348]
实施方式85：一种纤维蛋白水凝胶，包括(a)纤维蛋白原多肽、(b)凝血酶多肽和(c)式(ii)的化合物：
[0349][0350]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0351]
每个r1独立地选自c
1-3
烷基和c
1-3
烷氧基。
[0352]
实施方式86：实施方式85的纤维蛋白水凝胶，其中，式(ii)的化合物具有下式：
[0353][0354]
或其药学上可接受的盐。
[0355]
实施方式87：实施方式85的纤维蛋白水凝胶，其中，式(ii)的化合物具有下式：
[0356][0357]
或其药学上可接受的盐。
[0358]
实施方式88：实施方式85的纤维蛋白水凝胶，其中，式(ii)的化合物具有下式：
[0359][0360]
或其药学上可接受的盐。
[0361]
实施方式89：实施方式85的纤维蛋白水凝胶，其中，式(ii)的化合物具有下式：
[0362][0363]
或其药学上可接受的盐。
[0364]
实施方式90：实施方式85的纤维蛋白水凝胶，其中，式(ii)的化合物具有下式：
[0365][0366]
或其药学上可接受的盐。
[0367]
实施方式91：实施方式85的纤维蛋白水凝胶，其中，式(ii)的化合物具有下式：
[0368][0369]
或其药学上可接受的盐。
[0370]
实施方式92：实施方式85的纤维蛋白水凝胶，其中，式(ii)的化合物具有下式：
[0371][0372]
或其药学上可接受的盐。
[0373]
实施方式93：实施方式85-92中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约10mg/ml至约60mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0374]
实施方式94：实施方式93的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含40mg/ml的所述纤维蛋白原多肽。
[0375]
实施方式95：实施方式85-92中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约0.1u/ml至约1200u/ml的所述凝血酶多肽。
[0376]
实施方式96：实施方式95的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约33u/ml的所述凝血酶多肽。
[0377]
实施方式97：实施方式85-96中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的聚合时间为约2秒至约1200秒。
[0378]
实施方式98：实施方式85-96中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含直径为约1纳米(nm)至约400nm的原纤维。
[0379]
实施方式99：实施方式85-96中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含交联密度为约1交联/μm2至约5,000交联/μm2的原纤维。
[0380]
实施方式100：实施方式85-96中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶包含约1600pa至约2520pa的剪切模量。
[0381]
实施方式101：实施方式85-96中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的表面积为约0.05cm2至约300cm2。
[0382]
实施方式102：实施方式85-96中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶的厚度为约0.1μm至约1,000μm。
[0383]
实施方式103：实施方式85-96中任一项的纤维蛋白水凝胶，其中，所述纤维蛋白水凝胶通过注塑成型制造。
[0384]
其他实施方式
[0385]
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在所附权利要求的范围内。