一种PT检测试剂制备方法与流程

一种pt检测试剂制备方法
技术领域
1.本发明涉及检测试剂技术领域，具体为一种pt检测试剂制备方法。


背景技术：

2.试剂又称生物化学试剂或试药，主要是实现化学反应、分析化验、研究试验、教学实验、化学配方使用的纯净化学品，一般按用途分为通用试剂、高纯试剂、分析试剂、仪器分析试剂、临床诊断试剂、生化试剂、无机离子显色剂试剂等。
3.凝血酶原时间(pt)检测试剂是一种旨在通过凝血活酶替代反应物，与血浆样品混合，在钙离子条件下启动凝血反应，产生凝块，通过凝血仪检测，来测定样品中凝块形成时间的经典的技术方法，是临床抗凝治疗的重要监测指标。
4.pt试剂主要成分为组织凝血活酶(含组织因子和磷脂)，现有简便的制备方法通常是从兔脑粉中提取获得，中国专利201410093404.x中公开了pt试剂的制备方法，处理新鲜兔脑得到兔脑粉，在生理盐水中，37℃热激活，再离心得到上清液，冻干得到兔脑组织因子冻干制剂，但是这种方法的到的抽提液浑浊，里面有分散不均的大大小小的颗粒悬浮物，易聚集沉淀，活性低。
5.专利cn110887970a通过外加电解质，增加了磷脂间电荷的斥力，使pt试剂不容易形成沉淀，但是该发明并未提出怎样解决抽提液浑浊、颗粒悬浮物大大小小分散不均和活性不高的问题，因此，需要有新的工艺来得到一种清亮、稳定性好且活性更高且敏感度更优异的pt试剂。


技术实现要素：

6.本发明提供的发明目的在于提供一种pt检测试剂制备方法。通过本发明一种pt检测试剂制备方法，该pt检测试剂制备方法，通过在兔脑粉抽提液中加入固相化的胰蛋白酶进行搅拌，使其充分作用后，再使用布氏漏斗真空过滤分离去掉，胰蛋白酶充分作用于抽提液中包裹成团的活性颗粒物(含组织因子和磷脂)，将其切割成均匀细小的活性颗粒，活性颗粒数量增加试剂活性提高，试剂敏感度得以提高；活性颗粒细小后，分散均匀，难以沉淀，稳定性得以提高且液体清亮。
7.为了实现上述效果，本发明提供如下技术方案：一种pt检测试剂制备方法，包括以下步骤：
8.步骤一、称取兔脑粉待用。
9.步骤二、对抽提缓冲液进行预加热。
10.步骤三、水浴条件下对兔脑粉进行抽提。
11.步骤四、对抽提液进行离心，分离获得上清液。
12.步骤五、取上清液加入固相化的胰蛋白酶，搅拌。
13.步骤六、真空过滤去除固相化的胰蛋白酶，得到pt试剂。
14.步骤七、观察pt试剂液体清亮度，验证其稳定性，对比检测，验证其活性。
15.进一步的，包括以下步骤：根据步骤一中的操作步骤，所述抽提缓冲液由hepes：0.05摩尔每升、nacl：4/万、nan3：0.5％、甘氨酸：5％、海藻糖3％。
16.进一步的，包括以下步骤：根据步骤一中的操作步骤，所述抽提缓冲液ph值范围7.3～7.5。
17.进一步的，包括以下步骤：根据步骤二中的操作步骤，所述抽提缓冲液预加热温度为37摄氏度。
18.进一步的，包括以下步骤：根据步骤三中的操作步骤，所述兔脑粉水浴抽提时间为60分钟。
19.进一步的，包括以下步骤：根据步骤四中的操作步骤，所述离心参数为转速4000转每分钟，离心时间10分钟。
20.进一步的，包括以下步骤：根据步骤五中的操作步骤，所述的固相化载体为4b。
21.进一步的，包括以下步骤：根据步骤五中的操作步骤，所述固相化胰蛋白酶的浓度范围为0.05～0.20mg/dl。
22.进一步的，包括以下步骤：根据步骤六中的操作步骤，所述采用布氏漏斗真空过滤。
23.本发明提供了一种pt检测试剂制备方法，具备以下有益效果：该pt检测试剂制备方法，通过在兔脑粉抽提液中加入固相化的胰蛋白酶进行搅拌，使其充分作用后，再使用布氏漏斗真空过滤分离去掉，胰蛋白酶充分作用于抽提液中包裹成团的活性颗粒物(含组织因子和磷脂)，将其切割成均匀细小的活性颗粒，活性颗粒数量增加试剂活性提高，试剂敏感度得以提高；活性颗粒细小后，分散均匀，难以沉淀，稳定性得以提高且液体清亮。
附图说明
24.图1为本发明的制备流程示意图，
具体实施方式
25.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，
26.实施例1：一种pt检测试剂制备方法，包括以下步骤：
27.步骤一、称取兔脑粉待用，抽提缓冲液由hepes：0.05摩尔每升、nacl：4/万、nan3：0.5％、甘氨酸：5％与海藻糖3％，抽提缓冲液利用氢氧化钠将ph调至7.3-7.5，100毫升的抽提缓冲液预加热至37摄氏度，步骤二、对抽提缓冲液进行预加热，步骤三、水浴条件下对兔脑粉进行抽提，兔脑粉水浴37摄氏度抽提60分钟，步骤四、对抽提液进行离心，分离获得上清液，离心参数为转速4000转每分钟，离心时间10分钟，步骤五、取上清液加入固相化的胰蛋白酶，搅拌，步骤六、真空过滤去除固相化的胰蛋白酶，得到pt试剂，步骤七、观察pt试剂液体清亮度，验证其稳定性，对比检测，验证其活性，对比检测所需待测血浆：取新鲜待测静脉血，采血过程所使用的器具为一次性塑料器具，待测血浆与0.109摩尔每升的枸橼酸钠按
9:1的体积比迅速混匀，获得混合液，混合液加入缓冲液混匀后放入低温离心机内，以3000转每分钟的转速离心15分钟，静置血浆，待分层，静置血浆用塑料移液管取上层血浆作为待测血浆，将新鲜兔脑彻底除去软脑膜及血管网，用生理盐水洗净，置乳钵中研碎，除去研不碎的杂质，加3倍量的丙酮，研磨0.5min(注意不要研磨太久，致成胶状，丙酮不易分离，如已成胶状，则需要加少量丙酮，轻轻混匀即可分离)，静置数分钟后，倒去上清液，再加适量丙酮，如此反复5～6次，使脑组织完全脱水成灰白色微细粉末状，用滤纸过滤：)可能挤去丙酮，将脑粉摊开，在空气中干燥成为无粘着性的颗粒状粉末(亦可用真空抽气机或置于37℃温箱中1小时使其干燥)，干脑粉制成后应分装密封，保存于普通冰箱4℃内，甘氨酸(glycine，缩写gly)又名氨基己酸，其化学式为c2h5no2，常温常压下为白色固体，是氨基酸系列中结构最为简单，人体非必需的一种氨基酸，在分子中同时具有酸性和碱性官能团，在水中可电离，具有很强的亲水性，但属于非极性氨基酸，溶于极性溶剂，而难溶于非极性溶剂，而且具有较高的沸点和熔点，通过水溶液酸碱性的调节可以使甘氨酸呈现不同的分子形态，在医学上已经成功地应用海藻糖替羧甲淀粉蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂，不仅可以常温条件下干燥存放，海藻糖可应用于研究用生物试剂的保存，例如各种工具酶、细胞膜、细胞器、抗体、抗原及病毒等等，使得生命科学研究更为方便快捷有效，英国大学camilo.c等详细的研究了海藻糖对dna限制性内切酶dna连接酶和dna聚合酶的保护作用，结果表明，所有加入海藻糖干燥的酶样，在70℃保存35天或在37℃保存9个月后，其活力并无损失，仍能精确的将dna截断，我国中科院微生物研究所应用海藻糖干燥制备、用于人血清胆固醇测定的三种诊断工具酶，在室温下长期保存后，活性保持率都在90％以上，现已成功的进入于临床应用，这是目前其它种类的保护剂都不可能达到的效果，利用海藻糖作为诊断工具酶等生物试剂的稳定剂和保护剂，可置于常温条件下干燥并保存。
28.实施例2：
29.采用本发明提取方法提取凝血活酶；
30.称取两份兔脑粉，分别向两份兔脑粉中加入已经预热抽提缓冲液100ml，待混合均匀后，37℃热激活，再离心得到上清液：
①
冻干得到兔脑组织因子冻干制剂pt1，
②
上清液中加入固相化的胰蛋白酶作用，真空过滤去除固相化的胰蛋白酶得到清亮液体，向其加入缓冲液稀释3.2倍，冻干得到兔脑组织因子冻干制剂pt2。
31.1、活性：
32.用冻干得到的试剂pt1、试剂pt2分别对正常人血浆和异常值人血浆进行检测，制备待测血浆：取新鲜待测静脉血，采血过程所使用的器具为一次性塑料器具，静脉血与0.109摩尔每升的枸橼酸钠按9:1的体积比迅速混匀，并加入缓冲液b混匀后放入低温离心机内，以3000转每分钟的转速离心15分钟，并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆)，结果如下：
33.表一：
[0034][0035]
同等质量的原料，采用本发明得到的pt试剂量为原来方法制备的三倍。
[0036]
2、重复性：
[0037]
采用本发明方法得到的冻干得到的试剂与西门子冻干pt试剂去检测西门子正(异)常值质控血浆，重复检测10次，结果如下：
[0038]
表二：正常值质控血浆检测结果：
[0039][0040]
表三：异常值质控血浆检测结果：
[0041][0042]
3、敏感度
[0043]
采用本发明方法得到的冻干得到的试剂与西门子冻干pt试剂去检测西门子质控血浆l1、l2与l3，分别重复检测10次，结果如下：
[0044] l1l2l3西门子pt11.539.865.4本发明pt11.238.964.8
[0045]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。