包含蒸熟柑橘果皮提取物作为有效成分的用于改善皮肤的化妆料组合物的制作方法

1.本发明涉及包含蒸熟柑橘果皮提取物作为有效成分的用于抗氧化、抗炎症、改善皱纹或弹性的化妆料、食品和医药外品组合物、其制备方法、通过上述方法制备的柑橘果皮提取物以及上述提取物的应用。


背景技术：

2.柑橘(citus，柑橘类)果皮中含有许多对人体有用的生理活性物质，例如包含果胶的膳食纤维和类胡萝卜素、维生素和多种类型的类黄酮(journal of the american chemical society,79(24),6561-6562.)等。最近报道了源自果皮的类黄酮的各种生理活性，报道了特别是被称为维生素p的橙皮苷(hesperidin)保护毛细血管，对预防动脉硬化和高血压有效果。这样，随着具有各种药理活性作用的有效成分在果皮中的含有量高于柑橘类的果肉这一事实的发现，在对源自柑橘类果皮的有效成分的功效进行研究的同时，对果皮在食用中的利用也进行了更多的研究。
3.类黄酮(flavonoid)作为源自植物的多酚系列的化合物，主要大多存在于果实表面、叶子的表面、花朵等，并且防御植物免受紫外线(uv)的侵害或参与植物的颜色、抗病虫害性(pest resistance)等。众所周知，类黄酮作为配糖体，如果通过体内代谢等转化为非配糖体(非糖体、无配糖体、糖苷配基(aglycone))，则能提供更强的生理学功效。然而，作为在原物中能够将其转化为非配糖体的方法，已报道了酸水解或发酵，但由于尚未详细阐明化学物质、微生物的额外混入而可能产生的杂质产生等意想不到的效果，因此作为非配糖体形式的提取物应用于化妆料中的方法目前受到限制。
4.众所周知，呋喃香豆素(furanocoumarin)因植物在人的皮肤上引起光毒性(光毒性效应，phototoxic effect)。由此发生类似日光灼伤的皮肤反应(红斑、浮肿、水泡等)或细胞坏死的现象(j food drug anal,25:71-83)。呋喃香豆素阻碍存在于肝脏和小肠中的细胞色素p450系统的酶(细胞色素(cytochrome)p450 3a4；cyp3a4)活性，从而出现使被cyp3a4活化的药物失活，相反使被cyp3a4失活的药物活化的现象。其结果，出现血液中存在的药物的适当浓度变得过低或过高的现象，从而可能不会出现预期的药物效果或发生严重的副作用(cmaj,185:309-316)。然而，对于可以选择性地减轻呋喃香豆素而无需对其的纯化等化学复杂过程的方法，尚不得而知。
5.在此背景下，本发明人为了改善柑橘果皮的成分组成，增强皮肤功效，以最优化的条件开发了蒸熟柑橘果皮提取物制备方法，并确认了由此制备的蒸熟柑橘果皮提取物在抗氧化、抗炎症以及改善皱纹或弹性方面优异，从而完成了本发明。


技术实现要素：

6.要解决的课题
7.本发明的目的在于提供一种包含蒸熟柑橘(citrus)果皮提取物作为有效成分的
化妆料组合物。
8.本发明的另一个目的在于提供一种包含蒸熟柑橘果皮提取物作为有效成分的食品组合物。
9.本发明的又一个目的在于提供一种包含蒸熟柑橘果皮提取物作为有效成分的医药外品组合物。
10.本发明的又一个目的在于提供一种柑橘果皮提取物制备方法，其包括将柑橘果皮在密封容器中在103℃至150℃下蒸熟1小时至15小时的步骤；以及对上述蒸熟的柑橘果皮进行提取的步骤。
11.本发明的又一个目的在于提供一种由上述方法制备的柑橘果皮提取物。
12.本发明的又一个目的在于提供一种化妆料组合物，其包含由上述方法制备的柑橘果皮提取物作为有效成分。
13.本发明的另一个目的在于提供蒸熟柑橘(citrus)果皮提取物在制备用于抗氧化、用于抗炎症、用于改善皱纹或弹性的化妆料组合物、食品组合物或医药外品组合物中的应用。
14.课题的解决手段
15.如下对其进行具体描述。另一方面，本发明中公开的各个描述和实施方式也可应用于各个不同的描述和实施方式。即，本发明中公开的多种要素的所有组合均属于本发明的范畴。另外，不能认为本发明的范畴由以下记述的具体叙述限制。
16.另外，相关技术领域的普通技术人员仅使用常规实验，意图将本发明中记载的本发明的特定方面的多数等同物包括在本发明中。
17.作为实现上述目的的一个方面，提供了一种包含蒸熟柑橘(citrus)果皮提取物作为有效成分的化妆料组合物。
18.本发明的术语“柑橘(citrus)”是橘科的橘属(citrus)、金橘属(fortunella)和枳属(pontirus)三个属的总称。柑橘是指橘子、金橘、枳、香橼(citron)、柚子(pomelo)、柑橘(mandarin)、红橘(tangerine)、蜜橘(sweety)、香橼(citron)、瀛橘、天惠香、四季橘(calamansi)、柚子(pomelo)、汉拿峰、橙子、苦橙、柠檬、葡萄柚、来檬、柚子等的包含在柑橘系列的果实及其未成熟果实，并且本发明的柑橘没有特别限制，只要其属于橘属(citrus)植物即可。具体地，在本发明中，柑橘可以使用橘子、柚子、橙子、苦橙、葡萄柚、柠檬或来檬，但不限于此。
19.本发明的术语“果皮”是指覆盖在果肉外侧的表皮，在植物学意义上分为外果皮(exocarp)、中果皮(mesocarp)和内果皮(endocarp)。柑橘(柑橘类)中存在的类黄酮根据分子结构分为黄酮类(flavones)、黄烷酮类(flavanones)、黄酮醇类(flavonols)、异黄酮类(isoflavones)、花青素类(anthocyanidins)、黄烷醇类(flavanols)等六个组，特别是，黄烷酮类在果皮和籽中比在果肉中更为丰富。在本发明中，果皮可以是指外果皮、中果皮、内果皮中的外果皮和中果皮，但不限于此。
20.在上述柑橘果皮中，作为类黄酮配糖体包括芸香柚皮苷(narirutin)、柚皮苷(naringin)和橙皮苷(hesperidin)，作为类黄酮非配糖体包括柚皮素(naringenin)和橙皮素(hesperetin)，作为呋喃香豆素包括佛手柑内酯(bergapten)和佛手柑素(bergamottin)等多种化合物。
21.本发明的术语“类黄酮(flavonoid)”是广泛分布于食品中的黄色系统的色素，是源自植物的多酚系列的化合物。类黄酮在动物中相对较少，在植物的叶、花、根、果实、茎等中包含较多，主要起到抗氧化、抗炎症、抗突变、抗癌作用以及调节主要酶功能的作用，因此被广泛用于健康辅助剂、医药用药物、化妆品产业中。
22.本发明的术语“配糖体(glycone)”是糖分子通过糖苷键与其他官能团结合的分子的总称，主要多见于植物中。已知许多配糖体在糖分子通过水解而被水解时表现出活性。配糖体在酸、碱或适当的水解酶等的作用下分解成糖部分和称为糖苷配基(aglycone)或苷元(genin)的非糖部分。
23.上述类黄酮配糖体可以没有限制地包括例如芸香柚皮苷(narirutin)、柚皮苷(naringin)、橙皮苷(hesperdin)、香蜂草苷(didymin)、柠檬黄素(limocitrin)、圣草次苷(eriocitrin)、新圣草次苷(neoeriocitrin)、新橙皮苷(neohesperdin)、枸橘苷(poncirin)和新枸橘苷(neoponcirin)等全部，代表性的柑橘的类黄酮配糖体可以包括芸香柚皮苷、柚皮苷或橙皮苷，但不限于此。
24.已知，上述“芸香柚皮苷”具有增加体内活性、抗癌作用和改善酒精性肝病的效果，上述“柚皮苷”具有抗癌活性和降低血脂的作用。已知，上述“橙皮苷”具有植物的防御作用，能镇定受到压力的皮肤细胞。
25.本发明的术语“非配糖体(糖苷配基(aglycone)、非糖体、无配糖体)”是指配糖体分子中的非碳水化合物(非糖成分)，已知，如果配糖体转化为非配糖体，则提供更强的生理学功效。
26.上述类黄酮非配糖体可以没有限制地包括例如柚皮素(naringenin)、橙皮素(hesperetin)、圣草酚(eriodictyol)、异樱花素(isosakuranetin)等全部，代表性的柑橘的类黄酮非配糖体可以包括柚皮素或橙皮素，但不限于此。
27.已知，上述“柚皮素”不仅具有抗菌、抗病毒活性，还具有抗癌活性，并且在酸、碱或适当的水解酶等的作用下，芸香柚皮苷或柚皮苷低分子化(转化)为柚皮素。上述“橙皮素”在柑橘类中丰富，具有肌肉再生功效，并且在酸、碱或适当的水解酶等的作用下，橙皮苷(橙皮素系配糖体)低分子化为橙皮素。
28.在本发明中，其特征在于，通过蒸熟过程将类黄酮配糖体转化为非配糖体，从而可以提高蒸熟柑橘果皮提取物中包含的类黄酮非配糖体的含量。
29.在本发明中，蒸熟可以在103℃至150℃、具体地105℃至130℃、更具体地120℃下进行，可以进行1小时至15小时或1小时至12小时、具体地2小时至8小时、更具体地4小时至8小时，但不限于此。
30.本发明的术语“呋喃香豆素(furanocoumarin)”作为植物产生的次级代谢产物，是由呋喃(furan)环结合而成的香豆素(coumarin)化合物的总称。已知，许多种类的呋喃香豆素具有光毒性(phototoxic)，因此可在人的皮肤上引起植物光皮炎(phytophtodermatitis)并可诱发药物相关副作用。
31.上述呋喃香豆素可以没有限制地包括例如佛手酚(bergaptol)、佛手柑内酯(bergapten)、佛手柑素(bergamottin)、环氧佛手柑素(epoxybergamottin)等全部，代表性的柑橘的呋喃香豆素可以包括佛手柑内酯或佛手柑素，但不限于此。
32.上述“佛手柑内酯”是非挥发性光毒性(光敏性)成分，可能成为皮炎的原因，并且
可增加皮肤的紫外线敏感性，促进红斑生成或增加黑色素色素(色素沉着)。上述“佛手柑素”阻碍药物在体内正常代谢过程中所需的细胞色素(cytochrome)p450，从而防止特定药物被酶氧化代谢，提高血流中的药物浓度。
33.在本发明中，其特征在于，通过蒸熟过程可以降低有害物质即呋喃香豆素的含量。
34.在本发明的一个具体实施例中，对于未进行蒸熟处理的柑橘种类，检测到类黄酮配糖体，而未检测到类黄酮非配糖体，并且仅在部分果皮中检测到呋喃香豆素(表1)。
35.本发明的术语“蒸熟”是指通过施加温度被蒸汽蒸煮(steaming)。作为蒸熟中使用的设备没有限制，只要其能够在恒定的温度和压力下进行蒸熟即可。
36.具体地，蒸熟可以在密封容器中进行，更具体地，可以在厚密封不锈钢容器中进行，但不限于此。由于蒸熟过程(蒸煮过程)是在完全密封的容器中进行的，因此本发明可以在维持较高压力的状态下发生反应，但不限于此。
37.在本发明的一个具体实施例中，在120℃下烘焙代替蒸熟8小时的情况下，类黄酮配糖体和非配糖体的含量变化不大，在温度更高的200℃下烘焙5分钟的情况下，原物外表面容易烧焦而没有显著的成分变化，从而确认橙皮苷无法转化为橙皮素。另外，在100℃以下的低温下进行蒸熟处理的情况下，水蒸气量没有产生太多，因此压力较低，并且在延长蒸熟处理时间进行更多的热处理(低压、低温)的情况下，类黄酮配糖体也不会低分子化为非配糖体，因此确认只有在密封容器中用105℃-130℃的高温条件进行蒸熟处理的情况下，非配糖体才会显著产生(表9)。
38.具体地，类黄酮配糖体呈以下趋势：在初期(蒸熟30分钟、蒸熟2小时或4小时)因热分解而减少，因提取效率增加而部分恢复后，再次减少(蒸熟4小时或8小时之后)。
39.上述提取效率增加是由物理化学变化引起的，具体地，上述物理化学变化是指将果皮蒸熟后粉末化时，通过每单位重量体积的减少而确认的颗粒的表面积增加。
40.类黄酮非配糖体从蒸熟2小时开始产生，在蒸熟8小时时与初期相比，最多增加6.5倍以上，从而确认类黄酮配糖体低分子化为非配糖体，该非配糖体为体内吸收有效的形式。对于呋喃香豆素，呈现在蒸熟处理时减少，在蒸熟8小时时部分量得到恢复，但在蒸熟8小时之后再次减少的趋势，从而确认有害物质的量减少(表2至8)。
41.本发明的术语“酚性化合物”是广泛分布于植物界的物质，具有多种结构和分子量，并且已知酚性化合物的酚性羟基(phenolic hydroxyl)通过与蛋白质等巨大分子结合而具有抗氧化、抗癌和抗菌等的生理功能，dpph自由基(radical)清除活性被认为与总酚化合物含量相关性较高。
42.在本发明的一个具体实施例中，总酚性化合物含量，与类黄酮配糖体类似，在蒸熟初期呈现减少趋势，之后减少的量部分恢复，在蒸熟8小时时与初期相比，总酚性化合物含量显著增加，从而可以看出抗氧化活性增加(表10)。
43.在本发明中，术语“提取物(extract)”是指将目标物质浸入各种溶剂中后，在室温、低温或加热状态下提取一定时间而获得的液体成分，从上述液体成分中去除溶剂而获得的固体成分等的产物。不仅如此，除了上述产物之外，可以概括性地解释为包括所有上述产物的稀释液、其浓缩液、其粗精制物、精制物等。因此，本发明中提供的柑橘果皮提取物可以被解释为包括通过对其进行提取处理而获得的提取液、上述提取液的稀释液或浓缩液、通过对上述提取液进行干燥而获得的干燥物、上述提取液的粗精制物或精制物、或它们的
混合物等，提取液本身以及可利用提取液而形成的所有剂型的提取物。
44.本发明的提取柑橘果皮的方法没有特别限制，可以根据相关技术领域中通常使用的方法提取。作为上述提取方法的非限制性实例，可以例举冷浸法、热水提取法、超声波提取法、过滤法、回流提取法、co2提取法等，这些可以单独进行或并用两种以上的方法进行。
45.用于上述提取的溶剂的种类没有特别限制，可以使用相关技术领域中公知的任意溶剂。作为上述提取溶剂的非限制性实例，可以例举水、醇或它们的混合溶剂等，这些可以单独使用或混合两种以上而使用，具体地可以使用水。当使用醇作为溶剂时，具体地可以使用碳数为1至4的醇。
46.另外，上述提取物在提取后可制备成干燥粉末形式并使用，但不限于此。
47.在本发明中，“蒸熟柑橘果皮提取物”可以是将干燥的柑橘蒸熟后，干燥，然后用甲醇或乙醇提取的，但不限于此。
48.在本发明的一个具体实施例中，在成分评价中使用甲醇提取物，甲醇和乙醇提取物的成分几乎相似，但考虑到实际工业应用时的安全性，使用乙醇提取物用于功效评价。
49.包含本发明的蒸熟柑橘果皮提取物的化妆料组合物可以具有皮肤改善用途。
50.本发明的术语“皮肤改善”可以是选自由抗氧化、抗炎症和改善皱纹或弹性组成的组中的任意一种以上，但不限于此。
51.本发明的术语“改善”是指至少减少与状态的缓解或治疗相关的参数、例如症状的程度的所有行为，并且可以包括所有抗氧化、抗炎症以及改善皱纹或弹性中的任意一种以上。
52.上述皮肤改善可以通过清除自由基(free radical)、抑制no生成、促进胶原蛋白合成来实现，但不限于此。
53.具体地，本发明人确认了，蒸熟柑橘果皮提取物与未进行蒸熟处理的情况相比，皮肤改善效果优异。更具体地，蒸熟柑橘果皮提取物的酚性化合物含量增加，并且清除自由基、抑制no生成和促进胶原蛋白合成的活性等显著增加。因此，在本发明中，确认了进行蒸熟处理的柑橘果皮提取物与未进行蒸熟处理的情况相比，抗氧化、抗炎症以及改善皱纹或弹性等的皮肤改善效果优异。
54.本发明的术语“抗氧化”是指包括所有抑制氧化的作用，具体地可以是指去除活性氧物种等的自由基的作用，但不限于此。人体实现氧化促进物质(促氧化剂，prooxidant)和氧化抑制物质(抗氧化剂，antioxidant)之间的平衡，但如果由于各种因素，这种平衡状态失衡并且倾向于氧化促进侧，则会诱发氧化应激(oxidative stress)，从而引起潜在的细胞损伤和病理性疾病。成为这种氧化应激的直接原因的活性氧物种(reactive oxygenspecies,ros)不稳定且反应性高，因此容易与多种活体物质发生反应并攻击体内高分子，从而对细胞和组织造成不可逆的损伤，或者导致突变、细胞毒性和致癌等。诸如no、hno2、onoo-等活性氮物种(reactivenitrogen species,rns)在炎症反应时因巨噬细胞嗜中性粒细胞和其他免疫细胞的免疫反应而大量生成，此时ros也一同生成。上述活性氧在体内使细胞氧化破坏，随之暴露于各种疾病。因此，包含本发明的蒸熟柑橘果皮提取物的组合物可以通过清除自由基和抑制no生成的抗氧化活性，有助于增强健康。
55.本发明的术语“自由基(free radical)”是具有一个不成对电子的原子或分子，氢原子、氯原子等是单原子的游离基，通常所称的自由基是指从无机或有机化合物分子中释
放出一个质子，从而在残基中有一个不成对电子。活性氧具有优异的化学反应性，由它们诱导的自由基会对活体内的各种反应产生影响，并导致老化等。生物体经常暴露于自由基引起的有害性，并且随着细胞年龄的增加，有害性逐渐积累，从而引发多种疾病。因此，自由基阻碍对抗氧化效果起重要作用。
56.在本发明的一个具体实施例中，对在120℃下蒸熟8小时的柑橘提取物进行处理的结果，自由基被清除，其水平优于未处理情况(表11)。
57.蒸熟柑橘提取物不仅增加了类黄酮含量和总酚性化合物含量，而且通过增加自由基清除能力确认了增强抗氧化活性的效果，因此通过上述蒸熟处理增强抗氧化活性的柑橘提取物可以有效地用于化妆料组合物中。
58.本发明的术语“抗炎症”是指包括所有抑制炎症的作用，一般是指预防、治疗或改善炎症。炎症反应是为了增强活体内修复体系以及减少损伤而引起的，如果其程度严重或持续较长时间，则会引起细胞的损伤，从而可导致多种炎症性疾病。具体地，可以抑制炎症相关介质或活性氧(ros)的生成，并且上述炎症相关介质可以是no(一氧化氮，nitric oxide)，但不限于此。
59.本发明的术语“no(一氧化氮(nitric oxide)，亚硝酸)”起到去除细菌和肿瘤、调节血压或介导神经传递等多种作用，但如果发生炎症反应，则相关细胞中inos(诱导型一氧化氮合成酶)的表达增加，从而生成大量的no，并且过度生成的no诱发组织的损伤、基因变异、神经损伤等，增加血管通透性，从而促进浮肿等的炎症反应。在诱发炎症的细胞中no的生成增加，而如果皮肤得到镇定，则no的生成受到抑制，因此它们存在必要的相关关系。
60.在本发明的一个具体实施例中，对在120℃下蒸熟8小时的柑橘提取物进行处理的结果，no生成受到抑制，其抑制水平优于未处理情况(表12)。
61.本发明的术语“皱纹”大致可分为用于做面部表情的表情肌引起的表情皱纹和因整体或局部皮肤衰老而产生的细纹。具体地，皱纹可由基因引起的原因、皮肤果皮中存在的胶原蛋白和弹性纤维的减少、外部环境等诱发。为了本发明的目的，皱纹可以用作包括所有表情皱纹和细纹的含义，但不限于此。
62.本发明的术语“弹性”是指用手指按压皮肤时保持绷紧的力，“弹性改善”或“弹性增强”是指通过强化个体的皮下脂肪层结构来提高皮肤的弹性，并且可以是指利用本发明的组合物提高皮肤的弹性。
63.本发明的术语“老化”是指活体结构和功能随着时间的推移而衰退的现象，并且对于本发明的防止老化，如果老化得到改善，例如预防、抑制、延缓老化等，则不限于其程度等。在本发明中，改善皱纹和防止老化可能是由促进胶原蛋白合成引起的，但不限于此。
64.本发明的术语“胶原蛋白(collagen)”是一种多见于大部分动物、特别是哺乳动物中的纤维蛋白质，占据皮肤和软骨等体内所有结缔组织的大部分，并且体内最常见的细胞成纤维细胞(fibroblasts)生成分泌胶原蛋白。在烹饪或食品和医药产业中广泛利用的明胶是由胶原蛋白不可逆水解而成的。胶原蛋白的减少是诱发皱纹、降低皮肤弹性的主要原因，因此胶原蛋白的合成对于改善皱纹和增强弹性至关重要。
65.在本发明的一个具体实施例中，对在120℃下蒸熟8小时的柑橘提取物进行处理的结果，胶原蛋白附加生成量增加，并且其增加水平优于未处理情况(表14)。
66.本发明的“化妆料组合物”基本上涂布于皮肤，因此还可以参考本领域化妆料组合
物制备成通常制备的任何剂型。例如，可以制备成选自由溶液、外用软膏、霜、泡沫、营养化妆水、柔肤水、面膜、乳液、妆前底乳、粉底、精华液、皂、液体清洁料、入浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、凝胶、露、粉、含有表面活性剂的清洁剂、贴片和喷雾组成的组中的剂型，但不限于此。
67.上述化妆料组合物除了本发明的蒸熟柑橘果皮提取物之外，还可以包括化妆料组合物中通常使用的抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜料、香料等常规辅助剂和载体。例如，上述化妆料组合物还可以进一步包括辅助成分，例如甘油、丁二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、生育酚乙酸酯、柠檬酸、泛醇、角鲨烷、柠檬酸钠、尿囊素等。
68.上述化妆料组合物可以剂型化为柔肤水、收敛化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华液、面膜、皮肤附着用贴片、皮肤附着用凝胶、粉、软膏、膏、凝胶、悬浮剂(suspension)、乳状液、喷雾、美容液或胶囊，但不特别限于此。
69.本发明的化妆料组合物可以进一步包括一种以上的一般皮肤化妆料中配入的化妆品学上可接受的载体，作为常规成分，可以适当地配入例如油分、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、色素、防腐剂、香料等，但不限于此。本发明的化妆料组合物中包含的化妆品学上可接受的载体根据剂型而多种多样。
70.当本发明的剂型为软膏、膏、霜或凝胶时，作为载体成分，可以利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶(tragacanth)、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌或它们的混合物。
71.当本发明的剂型为粉或喷雾时，作为载体成分，可以利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉或它们的混合物，特别是，当为喷雾时，可以附加地包含推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
72.当本发明的剂型为溶液或乳浊液时，作为载体成分，利用溶剂、溶解剂或乳浊剂，例如可以利用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油，特别是可以利用棉籽油、花生油、玉米胚种油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨醇的脂肪酸酯。
73.当本发明的剂型为悬浮液时，作为载体成分，可以利用诸如水、乙醇或丙二醇等液体稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯等悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。
74.另一方面，当本发明的剂型为胶囊时，可以剂型化为藻酸盐(alginate)胶囊、琼脂(agar)胶囊、明胶(gelatin)胶囊、蜡(wax)类胶囊或双胶囊的形式，但不特别限于此。
75.本发明的另一个方面提供了一种包含蒸熟柑橘果皮提取物作为有效成分的食品组合物。
76.本发明的术语“食品”包括所有通常意义上的食品，例如肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、小吃类、饼干类、披萨、方便面、其他面类、口香糖类、包含冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮料、茶、口服液、酒精饮料、维生素复合物、健康功能食品等，并且不受限制，只要其可以包括本发明的蒸熟柑橘果皮提取物即可。另外，可以通过将本发明的蒸熟柑橘果皮提取物作为主要成分添加到所制备的汁、茶、果冻和果汁等中来制备，并且可以包括丸剂、粉末、颗粒剂、片剂、胶囊或液剂等的形式。
77.在制备上述食品组合物时，可以通过添加本领域中通常添加的原料和成分来制
备，其种类没有特别限制。例如，像常规食品一样，可以包括多种生药提取物、食品学上可接受的食品辅助添加剂或天然碳水化合物等作为附加成分，但不限于此。有效成分的混合量可以根据使用目的适当地确定，并且本发明的组合物以来源于天然物的提取物为有效成分，因此对混合量不作特别限制。
78.上述“蒸熟”、“柑橘”、“果皮”和“提取物”如前所述。
79.上述食品组合物可以具有抗氧化、抗炎症、改善皱纹或弹性的用途，但不限于此。
80.本发明的另一个方面提供了一种包含蒸熟柑橘果皮提取物作为有效成分的医药外品组合物。
81.本发明的术语“医药外品”是指以要诊断、治疗、改善、减轻、处置或预防人或动物的疾病为目的而使用的物品中作用比医药品轻微的物品。例如，根据药事法的医药外品排除用于医药品用途的物品，包括用于治疗或预防人/动物疾病的产品、对人体的作用轻微或不直接作用的产品等。
82.具体地，上述医药外品可以包括皮肤外用剂和个人卫生用品。更具体地，可以是消毒清洁剂、沐浴泡沫、漱口水、湿纸巾、洗剂皂、洗手液或软膏剂，但不限于此。
83.当本发明的上述组合物用作医药外品添加剂时，可以将上述组合物直接添加或者与其他医药外品或医药外品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据使用目的适当地确定。
84.上述“蒸熟”、“柑橘”、“果皮”和“提取物”如前所述。
85.上述医药外品组合物可以具有抗氧化、抗炎症、改善皱纹或弹性的用途，但不限于此。
86.本发明的另一个方面提供了一种柑橘果皮提取物制备方法，其包括将柑橘果皮在密封容器中在103℃至150℃下蒸熟1小时至15小时的步骤；以及对上述蒸熟的柑橘果皮进行提取的步骤。
87.在本发明中，上述蒸熟可以在103℃至150℃、具体地105℃至130℃、更具体地120℃下进行，可以进行1小时至15小时或1小时至12小时、具体地2小时至8小时、更具体地4小时至8小时，但不限于此。
88.本发明的柑橘没有特别限制，只要其属于橘属(citrus)植物即可，具体地，在本发明中，柑橘可以使用橘子、柚子、橙子、苦橙、葡萄柚、柠檬或来檬，但不限于此。
89.在本发明中，柑橘提取物在蒸熟处理时与未处理的情况相比，可以将类黄酮配糖体低分子化为类黄酮非配糖体或者减少呋喃香豆素的产生，但不限于此。
90.本发明可以进一步包括蒸熟后干燥的步骤，但不限于此。
91.上述“蒸熟”、“柑橘”、“果皮”和“提取物”如前所述。
92.本发明的另一个方面提供了一种通过上述方法制备的柑橘果皮提取物。
93.上述“蒸熟”、“柑橘”、“果皮”和“提取物”如前所述。
94.本发明的另一个方面提供了一种化妆料组合物，其包含通过上述方法制备的柑橘果皮提取物作为有效成分。
95.上述“蒸熟”、“柑橘”、“果皮”、“提取物”和“化妆料组合物”如前所述。
96.本发明的蒸熟柑橘果皮提取物具有清除自由基、抑制no生成、促进胶原蛋白合成的效果，从而可以表现出抗氧化、抗炎症以及改善皱纹或弹性的效果，但不限于此。
97.本发明的另一个方面提供了蒸熟柑橘(citrus)果皮提取物在制备用于抗氧化、用于抗炎症、用于改善皱纹或弹性的化妆料组合物、食品组合物或医药外品组合物中的应用。
98.上述“抗氧化”、“抗炎症”、“皱纹”、“弹性”、“改善”、“化妆料组合物”、“食品”、“医药外品”、“蒸熟”、“柑橘”、“果皮”和“提取物”如前所述。
99.发明效果
100.本发明涉及增加酚性化合物以及增加类黄酮非配糖体的产生、减少有害物质即呋喃香豆素的蒸熟柑橘提取物，具有优异的抗氧化、抗炎症、改善皱纹或弹性的效果，从而可以用作对皮肤安全且改善皮肤状态的效果优异的化妆料组合物、食品组合物、医药外品组合物。
具体实施方式
101.在下文中，将通过实施例更详细地说明本发明。然而，这些实施例用于示例性地说明本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
102.实施例1.蒸熟柑橘(citrus)果皮提取物的制备
103.实施例1-1.柑橘果皮准备和蒸熟
104.将在韩国流通的橘子(citrus unshiu)、柚子(citrus junos)、橙子(citrus sinensis)、苦橙(citrus aurantium)、葡萄柚(citrus paradisi)、柠檬(citrus limonum)和来檬(citrus aurantifolia)的表面上附着的污染物仔细清洗，然后与内部果肉分离。将分离的果皮在40℃下完全干燥，然后切成约0.5cm的均匀大小。
105.并且，将切好的柑橘(citrus)果皮放入厚密封不锈钢容器中，在可通过少量纯净水进行浸湿的条件下，进行密封以使外部空气不流通，然后按多种蒸熟时间条件(未处理、30分钟、2小时、4小时、8小时和12小时)在120℃下实施蒸熟。之后，在40℃下充分干燥直至完全干燥。
106.实施例1-2.用于成分评价的蒸熟柑橘果皮提取物的制备
107.将10g经上述蒸熟处理的柑橘果皮粉末化，然后混合在100ml高效液相色谱(hplc)级甲醇中，超声(sonication)提取1小时，将该过程各重复3次，共获得300ml的提取溶剂。将获得的300ml提取溶剂浓缩并重新调节至100ml，然后经ptfe过滤器(0.45μm)过滤以制备柑橘果皮提取物。
108.在评价以下的类黄酮含量或呋喃香豆素含量的情况下，使用通过上述方法浓缩的蒸熟柑橘果皮提取物溶液，在评价总酚性化合物含量的情况下，利用甲醇将浓缩的蒸熟柑橘果皮提取物溶液的浓度稀释一半并使用。
109.实施例1-3.用于功效评价的蒸熟柑橘果皮提取物的制备
110.将10g经上述蒸熟处理的柑橘果皮粉末化，然后混合在100ml乙醇中，超声(sonication)提取1小时，将该过程各重复3次，共获得300ml的提取溶剂。将获得的300ml提取溶剂浓缩并重新调节至100ml，然后经ptfe过滤器(0.45μm)过滤以制备柑橘果皮提取物。
111.在确认以下的抗氧化效果的情况下，利用乙醇将浓缩的蒸熟柑橘果皮提取物溶液的浓度稀释一半并使用，
112.在确认抗炎症效果和促进胶原蛋白合成效果的情况下，将蒸熟柑橘果皮提取物溶液利用旋转蒸发浓缩器(rotary evaporator)去除全部乙醇，然后将残渣重新溶解在dmso
中并使用，使得提取物溶液最终达到50,000ppm的浓度。
113.实施例2.根据蒸熟处理时间和热处理条件的成分变化和含量比较
114.实施例2-1.根据柑橘种类的果皮成分分析
115.为了分析根据柑橘种类的果皮成分，比较了未进行蒸熟处理的橘子、柚子、橙子、苦橙、葡萄柚、柠檬和来檬的类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素含量(表1)。
116.旨在利用岛津公司的高效液相色谱仪(hplc)和二极管阵列检测器(dad)评价在干柑橘果皮100g中含有的3种类黄酮配糖体即芸香柚皮苷(narirutin)、柚皮苷(naringin)和橙皮苷(hesperidin)、2种类黄酮非配糖体即柚皮素(naringenin)和橙皮素(hesperetin)、2种呋喃香豆素即佛手柑内酯(bergapten)和佛手柑素(bergamottin)的含量(mg)。
117.具体地，使用安捷伦公司的zorbax eclipse plus反相柱(4.6x 150mm,3.5μm粒径)作为固定相，使用添加少量甲酸(formic acid)的水、乙腈组合作为流动相，通过梯度(gradient)洗脱方法分析提取物中的成分。在试料投入量为10μl，流速为1ml/min，检测波长为283、310nm下进行。用于定性和定量分析的标准品购自sigma-aldrich公司，通过根据5个以上的浓度的吸光度值制作校准曲线(calibration curve)，计算提取物中的含量(平均值，n＝3)。
118.[表1]
[0119][0120]
如表1所示，按柑橘种类，类黄酮配糖体的含量或组成存在差异，未进行蒸熟处理的果皮中未检出类黄酮非配糖体(未检出(not detected),n.d.)。7种果皮中有4种(苦橙、葡萄柚、柠檬、来檬)检出作为呋喃香豆素的佛手柑内酯或佛手柑素。
[0121]
在以下实施例2-2至2-8中，确认了按柑橘种类根据蒸熟处理时间条件的类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素成分的变化(100g柑橘中包含的mg)。
[0122]
实施例2-2.根据橘子果皮的蒸熟处理时间条件的成分变化
[0123]
对于作为柑橘种类的橘子，在多种蒸熟时间条件(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时、蒸熟8小时和蒸熟12小时)下比较了类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素的成分变化(表2)。
[0124]
其结果，对于类黄酮配糖体(芸香柚皮苷、橙皮苷)，确认了在蒸熟时间增加的初期(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时)因热分解而减少，但此后(蒸熟超过4小时、蒸熟8小时)由于蒸熟处理引起的果皮的物理化学变化，提取效率增加，减少的类黄酮配糖体的量增加，从而部分恢复。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。然而，对于柚皮苷，与热引起的分解相比，由于物理化学变化，提取效率的增加更占优势，从而呈现配糖体增加的趋
势。
[0125]
对于类黄酮非配糖体，从蒸熟2小时开始产生，在蒸熟8小时时与初期相比，增加约1.6倍-2倍以上，从而确认类黄酮配糖体低分子化为非配糖体。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0126]
呋喃香豆素成分在未处理和蒸熟处理条件下未检出。
[0127]
[表2]
[0128][0129]
实施例2-3.根据柚子果皮的蒸熟处理时间条件的成分变化
[0130]
对于作为柑橘种类的柚子，在多种蒸熟时间条件(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时、蒸熟8小时和蒸熟12小时)下比较了类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素的成分变化(表3)。
[0131]
其结果，对于类黄酮配糖体，确认了在蒸熟时间增加的过程中，因热分解，导致类黄酮配糖体含量减少。
[0132]
对于类黄酮非配糖体，从蒸熟2小时开始产生，在蒸熟8小时时与初期相比，增加约1.6倍-2倍以上，从而确认类黄酮配糖体低分子化为非配糖体。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0133]
呋喃香豆素成分在未处理和蒸熟处理条件下未检出。
[0134]
[表3]
[0135][0136]
实施例2-4.根据橙子果皮的蒸熟处理时间条件的成分变化
[0137]
对于作为柑橘种类的橙子，在多种蒸熟时间条件(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时、蒸熟8小时和蒸熟12小时)下比较了类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素的成分变化(表4)。
[0138]
其结果，对于类黄酮配糖体(芸香柚皮苷、橙皮苷)，确认了与芸香柚皮苷相比，橙皮苷的含量多12倍以上。另外，确认了上述两种物质在蒸熟时间增加的初期(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时)因热分解而减少，但此后(蒸熟超过4小时、蒸熟8小时、蒸熟12小时)由于蒸熟处理引起的果皮的物理化学变化，提取效率增加，减少的类黄酮配糖体的量增加，从而部分恢复。
[0139]
对于类黄酮非配糖体，橙子果皮中橙皮苷的量较多，但芸香柚皮苷和柚皮苷的总量较少，因此蒸熟结果仅检出橙皮素。对于橙皮素，从蒸熟2小时开始产生，在蒸熟8小时时与初期相比，增加约3倍以上，从而确认类黄酮配糖体低分子化为非配糖体。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0140]
呋喃香豆素成分在未处理和蒸熟处理条件下未检出。
[0141]
[表4]
[0142][0143]
实施例2-5.根据苦橙果皮的蒸熟处理时间条件的成分变化
[0144]
对于作为柑橘种类的苦橙，在多种蒸熟时间条件(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时、蒸熟8小时和蒸熟12小时)下比较了类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素的成分变化(表5)。
[0145]
其结果，对于类黄酮配糖体(芸香柚皮苷、柚皮苷)，确认了与芸香柚皮苷相比，柚皮苷的含量显著较多。另外，确认了上述两种物质在蒸熟时间增加的初期(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时)因热分解而减少，但此后(蒸熟超过4小时、蒸熟8小时)由于蒸熟处理引起的果皮的物理化学变化，提取效率增加，减少的类黄酮配糖体的量增加，从而部分恢复。蒸熟8小时之后，柚皮苷呈现再次减少的趋势，并且芸香柚皮苷未检出。
[0146]
对于类黄酮非配糖体，从蒸熟2小时开始产生，在蒸熟8小时时与初期相比，增加约4倍以上，从而确认类黄酮配糖体低分子化为非配糖体。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0147]
对于呋喃香豆素(佛手柑内酯)，从蒸熟2小时开始，与初期相比含量减少到一半以下，从而确认有害物质根据蒸熟处理而减少。在蒸熟8小时时确认佛手柑内酯的量得到部分恢复，但蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势，从而确认呈现与类黄酮配糖体变化类似的情况。
[0148]
[表5]
[0149][0150]
实施例2-6.根据葡萄柚果皮的蒸熟处理时间条件的成分变化
[0151]
对于作为柑橘种类的葡萄柚，在多种蒸熟时间条件(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时、蒸熟8小时和蒸熟12小时)下比较了类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素的成分变化(表6)。
[0152]
其结果，对于类黄酮配糖体，检出芸香柚皮苷和柚皮苷，而未检出橙皮苷。确认了芸香柚皮苷和柚皮苷在蒸熟时间增加的初期(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时)因热分解而减少，但此后(蒸熟超过2小时)由于蒸熟处理引起的果皮的物理化学变化，提取效率增加，减少的类黄酮配糖体的量增加，从而部分恢复。蒸熟4小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0153]
对于类黄酮非配糖体，由于未检出橙皮苷，因此也未检出橙皮素，并且仅检出柚皮素。对于柚皮素，从蒸熟2小时开始产生，在蒸熟8小时时与初期相比，增加约2.5倍以上，从而确认类黄酮配糖体低分子化为非配糖体。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0154]
对于呋喃香豆素(佛手柑素)，仅在未处理、蒸熟30分钟和蒸熟2小时时观察到，而蒸熟4小时之后未检出，因此确认有害物质根据蒸熟处理而减少。
[0155]
[表6]
[0156][0157]
实施例2-7.根据柠檬果皮的蒸熟处理时间条件的成分变化
[0158]
对于作为柑橘种类的柠檬，在多种蒸熟时间条件(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时、蒸熟8小时和蒸熟12小时)下比较了类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素的成分变化(表7)。
[0159]
其结果，对于类黄酮配糖体，确认了与芸香柚皮苷和柚皮苷相比，橙皮苷的含量显著较多。另外，确认了类黄酮配糖体在蒸熟时间增加的初期(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时)因热分解而减少，但此后(蒸熟超过4小时、蒸熟8小时)由于蒸熟处理引起的
果皮的物理化学变化，提取效率增加，减少的类黄酮配糖体的量增加，从而部分恢复。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0160]
对于类黄酮非配糖体，来檬果皮中芸香柚皮苷和柚皮苷的量显著低于橙皮苷，因此，蒸熟结果仅检出橙皮素。对于橙皮素，从蒸熟2小时开始产生，在蒸熟8小时时与初期相比，增加约6.5倍以上，从而确认类黄酮配糖体低分子化为非配糖体。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0161]
对于呋喃香豆素，仅在未处理和蒸熟30分钟时观察到，而蒸熟2小时之后未检出，因此确认有害物质根据蒸熟处理而减少。
[0162]
[表7]
[0163][0164]
实施例2-8.根据来檬果皮的蒸熟处理时间条件的成分变化
[0165]
对于作为柑橘种类的来檬，在多种蒸熟时间条件(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时、蒸熟8小时和蒸熟12小时)下比较了类黄酮配糖体、类黄酮非配糖体和呋喃香豆素的成分变化(表8)。
[0166]
其结果，对于类黄酮配糖体，确认了在蒸熟时间增加的初期(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时)因热分解而减少，但此后(蒸熟超过2小时)由于蒸熟处理引起的果皮的物理化学变化，提取效率增加，减少的类黄酮配糖体的量增加，从而部分恢复。
[0167]
对于类黄酮非配糖体，从蒸熟2小时开始产生，在蒸熟8小时时与初期相比，增加约2.2-3.5倍以上，从而确认类黄酮配糖体低分子化为非配糖体。蒸熟8小时之后，呈现再次减少的趋势。
[0168]
对于呋喃香豆素，确认了佛手柑内酯含量从蒸熟2小时开始，其量大幅减少，但蒸熟4小时之后，由于提取效率增加而部分恢复。佛手柑素含量也在蒸熟2小时时大幅减少到一半以下，在蒸熟4小时之后，与佛手柑内酯不同，未检出，因此确认有害物质根据蒸熟处理而减少。
[0169]
[表8]
[0170][0171]
通过上述实施例2-2至2-8的实施例，确认了类黄酮配糖体和类黄酮非配糖体含量根据蒸熟处理时间而变化，特别是直至蒸熟8小时处理时，类黄酮配糖体减少，类黄酮非配糖体增加，因此类黄酮配糖体低分子化为非配糖体。另外，确认了对于有害物质即呋喃香豆素，在蒸熟2小时以上处理时减少。
[0172]
实施例2-9.根据热处理条件的性状和成分变化
[0173]
为了确认实施例2-2至实施例2-8中出现的成分的变化是否为仅在本发明的特定条件下的蒸熟(105-130℃)中出现的特征，比较了在高温烘焙或100℃以下的低温蒸熟中的性状和成分变化。
[0174]
代表性地，在作为柑橘种类的橘子的多种热处理条件(未处理、120℃烘焙8小时、200℃烘焙5分钟、80℃蒸熟48小时、100℃蒸熟24小时、120℃蒸熟8小时)下，比较了橙皮苷和橙皮素的成分(100g橘子中包含的mg)，并确认了性状变化(平均值，n＝3，表9)。
[0175]
[表9]
[0176][0177]
如表9所示，在120℃下烘焙代替蒸熟8小时的情况下，确认了橙皮苷转化为橙皮素的量不大。在温度更高的200℃下烘焙5分钟的情况下，确认了没有显著的成分变化，并且原物表面容易烧焦，从而橙皮苷无法转化为橙皮素。即，确认了蒸熟过程对橙皮苷和橙皮素含量变化起重要作用。
[0178]
另一方面，在80℃蒸熟48小时、100℃蒸熟24小时处理的情况下，与120℃蒸熟8小时相比，类黄酮配糖体即橙皮苷大幅减少，类黄酮非配糖体即橙皮素的产生量也显著降低。由此可以看出，在密封容器中在100℃以下进行蒸熟处理时压力不高，因此不仅橙皮苷不会转化为橙皮素，而且即使在低温下长时间蒸熟并进行更多的热处理，类黄酮配糖体也不会低分子化为非配糖体，并且确认了仅在密封容器中以105℃-130℃的高温条件进行蒸熟处理的情况下，非配糖体才会显著产生。
[0179]
实施例3.根据蒸熟处理的酚性化合物含量变化以及根据清除自由基的抗氧化效果
[0180]
实施例3-1.根据柑橘果皮的蒸熟处理时间条件的酚性化合物含量变化
[0181]
总酚性化合物(总酚性化合物含量，total phenolic contents,tpc)的评价在多种蒸熟时间条件(未处理、蒸熟30分钟、蒸熟2小时、蒸熟4小时、蒸熟8小时和蒸熟12小时)下利用福林-西奥卡特(folin-ciocalteu)比色法进行。
[0182]
具体地，通过混合2ml蒸馏水、250μl柑橘果皮提取物和250μl福林酚试剂(福林-西奥卡特酚试剂,folin-ciocalteu's phenol reagent)(2n)来引发反应，5分钟后，添加500μl 7.5％碳酸钠(sodium carbonate)溶液并确认蓝色变色。反应90分钟后，在760nm处测量吸光度。
[0183]
用相同的程序对没食子酸(gallic acid)25、50、100、200、400、800ppm浓度下的吸光度进行评价，并制作校准曲线(calibration curve)，将提取物的吸光度代入校准曲线而计算的总酚性化合物的量用mg没食子酸当量/g干果皮(dried peel)表示(平均值，n＝3)。
[0184]
比较了橘子、柚子、橙子、葡萄柚和来檬的酚性化合物含量(表10)。
[0185]
[表10]
[0186][0187]
如表10所示，确认了柑橘果皮提取物中存在的酚酸和作为主要成分的类黄酮配糖体为酚性化合物，总酚性化合物含量变化与类黄酮配糖体的变化类似的倾向性。即，在蒸熟初期减少，此后减少的量部分恢复。
[0188]
与类黄酮配糖体不同，总酚性化合物在蒸熟8小时时与初期相比，tpc含量大部分增加，因此确认蒸熟过程增加总酚性化合物的量。
[0189]
在下文中，旨在确认柑橘果皮提取物的总酚性化合物的增加是否有助于抗氧化效果的增加。
[0190]
实施例3-2.根据清除自由基的抗氧化效果
[0191]
为了确认柑橘果皮提取物的抗氧化效果，在未处理、蒸熟30分钟或蒸熟8小时处理后，用1,1-二苯基-2-苦基肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl；dpph)方法测量了自由基清除能力。作为比较稳定的自由基，以自由基状态存在时在517nm处出现最大吸光，而如果自由基被清除则失去吸光能力的dpph以0.12mm的浓度溶解在甲醇中并使用。作为阳性对照群，使用维生素e水溶性类似物即trolox。
[0192]
将不同浓度的trolox溶液(0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/ml)各100μl分别放入24-孔板中，各1,900μl添加dpph溶液。在室温下遮光放置1小时，利用酶联免疫检测仪(elisa reader)测量在517nm处的吸光度，用7个浓度下的吸光度值制作根据浓度的校准曲线(calibration curve)。同样地，使100μl柑橘果皮提取物和1,900μl dpph溶液反应。将提取物的吸光度代入校准曲线，将1g该柑橘果皮所示的抗氧化效果的程度用troloxμmol当量/g表示，实验进行3次后计算平均值。
[0193]
[表11]
[0194][0195]
其结果，确认了在所有果皮种类中蒸熟8小时处理时，抗氧化功效大幅增加。特别是，橙子、葡萄柚、柠檬、来檬在未处理和蒸熟30分钟处理的情况下抗氧化功效较低，但蒸熟8小时处理的结果，其功效大幅增加约2-4倍以上，从而确认抗氧化效果优异。
[0196]
实施例4.根据no生成抑制的抗炎症效果
[0197]
实施例4-1.根据no生成抑制的抗炎症效果
[0198]
为了确认柑橘果皮提取物的抗炎症效果，在未处理、蒸熟30分钟或蒸熟8小时处理后，测量了no生成抑制率。为了培养raw264.7细胞，将dmem(杜氏改良eagle培养基，dulbecco's modified eagle's medium)和fbs(胎牛血清，fetal bovine serum)的混合物作为基本培养基，将raw264.7细胞以1～2x 105个细胞/ml的浓度分株到24-孔板(well plate)中，培养24小时。去除培养基，用无血清培养基饥饿(starvation)12小时，然后将各提取物的dmso溶解物处理至200ppm，30分钟后将脂多糖(lipopolysaccharide)以500ng/ml的浓度添加，培养18小时。将阳性对照群即l-nmma处理至20ppm。培养后，取上清液并转移至96-孔板，添加griess试剂，在室温下反应，利用酶联免疫检测仪(elisa reader)测量在540nm处的吸光度。将与对照群相比生成受到阻碍的no量计算为no生成抑制率(％)，实验进行3次后计算平均值。
[0199]
[表12]
[0200][0201]
其结果，如上表12所示，确认了在蒸熟8小时处理的情况下，与未处理和蒸熟30分钟的情况相比，抗炎症效果优异。
[0202]
实施例4-2.根据柑橘果皮成分和浓度的抗炎症效果
[0203]
为了确认进行蒸熟处理的柑橘果皮提取物成分中抗炎功效变化的原因，比较了类黄酮配糖体即橙皮苷和非配糖体即橙皮素的no生成抑制率(表13)。
[0204]
[表13]
[0205][0206]
其结果，如上表13所示，确认了当将橙皮苷和橙皮素以更高的浓度处理时，no生成抑制率进一步增加，并且在一定浓度以上(20ppm)下，特别是橙皮素的no生成抑制率显著增加，因此蒸熟柑橘果皮提取物中产生的类黄酮非配糖体可能是抗炎功效增加的原因。
[0207]
实施例5.胶原蛋白合成促进效果
[0208]
实施例5-1.胶原蛋白合成促进效果
[0209]
为了确认柑橘果皮提取物的胶原蛋白合成促进效果，在未处理、蒸熟30分钟或蒸熟8小时处理后，测量了胶原蛋白附加生成量。为了培养皮肤成纤维细胞(人真皮成纤维细胞，human dermal fibroblast)，将dmem和fbs的混合物作为基本培养基，将皮肤成纤维细胞以2～5x104个细胞/ml的浓度分株到48-孔板中，培养24小时。去除培养基，并在无血清培养基中处理各提取物的dmso溶解物至10ppm，然后培养24小时。促进胶原蛋白合成的阳性对照群用tgf-β处理至5ppb。取细胞培养液并利用人前胶原蛋白1α1duoset elisa试剂盒(人原胶原(human procollagen)1α1duoset elisa kit)(r&d systems公司)和酶联免疫检测仪(elisa reader)测量合成的胶原蛋白。对分离纯化的胶原蛋白在0.25、0.5、1、2、4、8ng/ml的浓度下进行测量并制作校准曲线，在此基础上，计算柑橘果皮提取物的dmso溶解物的胶原蛋白(ⅰ型胶原蛋白，type i collagen)生成量。将与对照群(dmso)相比生成的胶原蛋白量计算为胶原蛋白生成率(％)，实验进行3次后计算平均值(表14)。
[0210]
[表14]
[0211][0212]
其结果，如上表14所示，确认了在蒸熟8小时处理的情况下，与未处理和蒸熟30分钟的情况相比，胶原蛋白生成量优异。
[0213]
实施例5-2.根据柑橘果皮成分和浓度的胶原蛋白合成促进效果
[0214]
为了找出进行蒸熟处理的柑橘果皮提取物成分中胶原蛋白合成促进功效变化的原因，比较了类黄酮配糖体即橙皮苷和非配糖体即橙皮素的胶原蛋白附加生成量(表15)。
[0215]
[表15]
[0216][0217]
其结果，如上表15所示，确认了橙皮素与橙皮苷不同，在更低的浓度(0.1ppm、
1ppm)下显著增加胶原蛋白生成量，因此蒸熟柑橘果皮提取物中产生的类黄酮非配糖体可能是胶原蛋白合成促进功效增加的原因。
[0218]
基于以上说明，本发明所属技术领域的技术人员可以理解在没有变更本发明的技术思想或者必要的特征的情况下本发明还可以以其他具体方式实施。对此，应当理解，以上说明的实施例在所有的方面均为示例性的而非限制性的。本发明的范围应包括后述的权利要求书的意思以及范围和从其等同概念导出的所有的变更或者变形的方式，而不仅仅包括上述的详细描述。