一种葛根总黄酮的含量测定方法与流程

：
1.本发明属于中药材检测技术领域，具体涉及一种葛根总黄酮的含量测定方法。


背景技术：

2.葛根(puerariaelobataeradix)是豆科植物野葛(puerarialobata(willd)ohwi)的干燥根。葛根中含有丰富的营养成分，《神农本草经》中记载葛根可“主消渴、身大热、呕吐、诸痹、起阴气、解诸毒”。现代医学研究表明其在心血管疾病的治疗中具有显著作用，也被应用于解酒、免疫调节、肝脏保护、抗糖尿病、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等方面，是我国应用最为广泛的中药材之一。
3.现代科学研究证明，根中存在诸多化学成分，除淀粉外，还有异黄酮类、三萜类、香豆素类、皂苷类、生物碱类、多糖类及人体所必需的氨基酸和矿物质等。目前我国葛根种植地域众多，而各地种植的葛根药材的化学成分及含量均有差异，若化学成分和含量不能达到质量要求，势必会影响临床应用的安全性以及有效性。为确保中药使用的安全有效，对中药材进行准确可靠的质量检测是十分必要。
4.目前，《中国药典》仅制定了采用液相色谱对葛根中葛根素进行含量测定的方法，为了更好地控制药材质量，有必要对葛根中的主要药效成分总黄酮进行含量测定，以进一步有效地控制葛根质量，从而保证临床用药疗效。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种葛根总黄酮的含量测定方法。该方法操作简便，试剂和设备成本低廉，测定葛根总黄酮稳定性好，便于推广。
6.本发明提供的技术方案是：
7.一种葛根总黄酮的含量测定方法，包括如下步骤：
8.(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加溶剂制成80μg/ml的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用溶剂稀释为浓度为1.60～22.40μg/ml的系列标准溶液，以溶剂为空白对照，在190～400nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
9.(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入溶剂50ml，称定重量，提取15～45min，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加溶剂至刻度，摇匀，即得；
10.(3)供试品的测定：在190～400nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
11.优选为，所述紫外-可见分光光度计的检测波长为250～350nm。
12.进一步优选为，所述紫外-可见分光光度计的检测波长为250nm。
13.本发明所用溶剂为水或30％～95％乙醇。
14.优选为，溶剂为30％～75％乙醇。
15.进一步优选为，溶剂为30％乙醇。
16.上述步骤(2)中，所述提取方法为加热回流或超声提取。
17.优选为，步骤(2)中，提取方法为加热回流，提取时间为30min。
18.优选为，步骤(1)中，所述系列标准溶液浓度分别为1.6μg/ml,3.2μg/ml,4.8μg/ml,6.4μg/ml,8.0μg/ml,9.6μg/ml,12.8μg/ml,16.0μg/ml,19.2μg/ml,22.4μg/ml。
19.本发明的线性回归方程为y＝0.0709255x 0.00378142，r2＝0.99974。
20.本发明有益效果如下：
21.1、本发明提供了一种葛根总黄酮的含量测定方法，在《中国药典》制定的葛根中葛根素含量测定的基础上，增加了对葛根中总黄酮的含量测定，进一步完善了葛根药材的质量检测内容，对葛根药材及相关中成药质量检测标准具有重要意义；
22.2、本发明葛根总黄酮的检测方法经方法学验证结果表明：总黄酮(以葛根素计)在1.60～22.40μg/ml浓度范围内与吸光度线性关系良好，线性方程为y＝0.0709255x 0.00378142，r2＝0.99974；精密度rsd为0.02％，仪器精密度良好；稳定性rsd为1.10％，供试品溶液在180分钟内稳定；重复性rsd为1.79％，方法重复性良好；本发明供试品溶液与对照品溶液在250nm处均有最大吸收，但空白溶剂在此处无干扰，说明本发明的检测方法专属性强。
23.3、通过本发明的方法对不同地区的葛根中总黄酮(以葛根素计)进行测定，实验结果显示葛根素回收率范围为92％～105％，表明回收率良好。
24.4、本发明采用紫外-可见分光光度计对葛根中的总黄酮含量进行测定，该方法操作简便，试剂和设备成本低廉，测定葛根总黄酮稳定性好，便于推广。
附图说明
25.图1为葛根总黄酮专属性考察结果；
26.图2为葛根素标准曲线图。
具体实施方式：
27.下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不用于限制本发明的保护范围。
28.实施例1：
29.(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加30％乙醇制成80μg/ml的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用30％乙醇稀释为浓度为1.6μg/ml,3.2μg/ml,4.8μg/ml,6.4μg/ml,8.0μg/ml,9.6μg/ml,12.8μg/ml,16.0μg/ml,19.2μg/m l,22.4μg/ml的系列标准溶液，以30％乙醇为空白对照，在250nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
30.(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇50ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得；
31.(3)供试品的测定：在250nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液
的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
32.实施例2：
33.(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加水制成80μg/ml的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用水稀释为浓度为1.6μg/ml,
34.3.2μg/ml,4.8μg/ml,6.4μg/ml,8.0μg/ml,9.6μg/ml,12.8μg/ml,16.0μg/ml,19.2μg/m l,22.4μg/ml的系列标准溶液，以水为空白对照，在190nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
35.(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，称定重量，加热回流提取15min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得；
36.(3)供试品的测定：在190nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
37.实施例3：
38.(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加50％乙醇制成80μg/ml的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用50％乙醇稀释为浓度为1.6μg/ml,3.2μg/ml,4.8μg/ml,6.4μg/ml,8.0μg/ml,9.6μg/ml,12.8μg/ml,16.0μg/ml,19.2μg/m l,22.4μg/ml的系列标准溶液，以50％乙醇为空白对照，在300nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
39.(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，即得；
40.(3)供试品的测定：在300nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
41.实施例4：
42.(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加稀乙醇制成80μg/ml的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用稀乙醇稀释为浓度为1.6μg/ml,3.2μg/ml,4.8μg/ml,6.4μg/ml,8.0μg/ml,9.6μg/ml,12.8μg/ml,16.0μg/ml,19.2μg/m l,22.4μg/ml的系列标准溶液，以稀乙醇为空白对照，在350nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
43.(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，加热回流提取45min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，即得；
44.(3)供试品的测定：在350nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
45.实施例5：
46.(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加75％乙醇制成80μg/ml的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用75％乙醇稀释为浓度为1.6μg/ml,3.2μg/ml,4.8μg/ml,6.4μg/ml,8.0μg/ml,9.6μg/ml,12.8μg/ml,16.0μg/ml,19.2μg/m l,22.4μg/ml的系列
标准溶液，以75％乙醇为空白对照，在400nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
47.(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％乙醇50ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加75％乙醇至刻度，摇匀，即得；
48.(3)供试品的测定：在400nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
49.实施例6：
50.(1)绘制标准曲线：精密称定葛根素对照品10mg，加95％乙醇制成80μg/ml的葛根素对照品母液，取适量对照品母液用95％乙醇稀释为浓度为1.6μg/ml,3.2μg/ml,4.8μg/ml,6.4μg/ml,8.0μg/ml,9.6μg/ml,12.8μg/ml,16.0μg/ml,19.2μg/m l,22.4μg/ml的系列标准溶液，以95％乙醇为空白对照，在250nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程；
51.(2)供试品溶液的制备：精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量，置于具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置于50ml量瓶中，加95％乙醇至刻度，摇匀，即得；
52.(3)供试品的测定：在250nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
53.实施例7-12：
54.分别按实施例1-6的方法检测葛根总黄酮含量，区别在于，用超声提取替换加热回流。
55.实验例：
56.1、供试品溶液前处理方法考察
57.对葛根总黄酮含量测定方法的提取溶剂、提取方式以及提取时间进行考察，确定样品前处理方法。
58.1.1提取溶剂考察
59.取葛根药材粉末(样品批次：jy2021k001)适量，精密称定，平行4组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、30％乙醇、稀乙醇、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置50ml量瓶中，加相应溶剂至刻度，摇匀，即得。分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应溶剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在250nm波长处测定吸光度，计算，即得。实验结果见表1。
60.表1不同提取溶剂葛根总黄酮含量测定结果
61.[0062][0063]
实验结果表明：通过对比4种提取溶剂样品中总黄酮含量，可发现30％乙醇对葛根中总黄酮的提取率较高，故选择30％乙醇作为葛根总黄酮含量测定的最佳提取溶剂。
[0064]
1.2提取方式考察
[0065]
取葛根药材粉末(过三号筛)适量，精密称定，平行2组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30％乙醇50ml，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)60分钟，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，分别用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置50ml量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得。分别取供试品溶液和对照品溶液，以30％乙醇为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在250nm波长处测定吸光度，计算，即得。实验结果见表2。
[0066]
表2不同提取方式葛根总黄酮含量测定结果
[0067][0068]
实验结果表明：通过对比超声与回流两种提取方式的总黄酮含量，发现提取方式为加热回流时总黄酮含量最高，故选择加热回流为最佳提取方式。
[0069]
1.3提取时间考察
[0070]
取葛根药材粉末(过三号筛)适量，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加30％乙醇50ml，称定重量，分别加热回流15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，分别用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置50ml量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得。分别取供试品溶液和对照品溶液，以30％乙醇为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在250nm波长处测定吸光度，计算，即得。实验结果见表3。
[0071]
表3不同提取时间葛根总黄酮含量测定结果
[0072][0073]
实验结果表明：通过对比不同加热回流时间的总黄酮含量，发现加热回流30min效果最好，故选择30min为最佳加热回流提取时间。
[0074]
1.4供试品溶液制备方法的确定
[0075]
根据样品前处理考察实验结果，确定供试品最佳制备方法可确定为：
[0076]
取葛根药材粉末(过三号筛)适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加30％乙醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液0.5ml，置50ml量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得。
[0077]
2、本发明葛根总黄酮含量测定方法学验证试验
[0078]
2.1专属性考察
[0079]
精密吸取本发明葛根总黄酮供试品溶液、葛根素对照品溶液与空白溶剂，在190nm～400nm进行全波长扫描。结果见图1。
[0080]
实验结果表明：葛根总黄酮供试品溶液与葛根素对照品溶液在250nm处均有最大吸收，但空白溶剂在此处无干扰，故以本法测定葛根中总黄酮(以葛根素计)的含量具有专属性。
[0081]
2.2线性考察
[0082]
精密称定葛根素对照品10mg，加30％乙醇(溶剂)制成80μg/ml的葛根素对照品溶液母液。
[0083]
标准曲线的制备：分别将上述母液稀释为浓度1.6μg/ml,3.2μg/ml,4.8μg/ml，6.4μg/ml,8.0μg/ml,9.6μg/ml,12.8μg/ml,16.0μg/ml,19.2μg/ml,22.4μg/ml的标准溶液，以30％乙醇溶为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在250nm的波长处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，结果见表4、同时绘制标准曲线，标准曲线见图2。
[0084]
表4葛根素线性考察结果
[0085][0086]
本发明线性回归方程为：y＝0.0709255x 0.00378142，r2＝0.99974，表明在浓度为1.60μg/ml～22.40μg/ml的范围内葛根素浓度与吸光度线性关系良好。
[0087]
2.3精密度考察
[0088]
按照本发明的供试品制备方法，制备供试品溶液并测定，连续测定6次吸光度，经测定，精密度rsd为0.02％，结果表明仪器精密度良好，测定结果见表5。
[0089]
表5精密度考察结果
[0090][0091]
2.4稳定性考察
[0092]
按照“1.2.1.1”项下确定的供试品制备方法，制备供试品溶液并测定，分别在0，15，30，60，120，180分钟测定吸光度，经测定，稳定性rsd为1.10％，供试品溶液在180分钟内稳定，测定结果见表6。
[0093]
表6稳定性考察结果
[0094][0095]
2.5重复性考察
[0096]
取同一批葛根药材粉末约0.1g，精密称定，平行称定6份，按照“1.2.1.1”项下确定的供试品制备方法，制备供试品溶液及测定，测定供试品溶液中总黄酮含量，经测定，重复性rsd为1.79％，本发明的分析方法的重复性良好，测定结果见表7。
[0097]
表7重复性考察结果
[0098][0099][0100]
2.6总黄酮含量范围实验
[0101]
按照本发明的供试品制备方法，测定不同产地葛根总黄酮含量，结果见表8。
[0102]
表8贵州不同产地葛根总黄酮含量测定结果
[0103][0104]
本研究中，总黄酮的含量范围实验为含量的最大值和含量的最小值。根据不同产地葛根总黄酮含量测定结果可得：葛根黄酮含量最高批次为j22k0012，含量为21.58％，葛根黄酮含量最低批次为j22k0030，含量为0.92％。2020版中国药典要求本品按干燥品计算，含葛根素(c
21h20
o9)不得少于2.4％。故选取葛根素含量达到2.4％的药材批次jy2021k001作
为范围实验的最小值。
[0105]
2.6.1含量最大值
[0106]
(1)重复性实验
[0107]
取同一批葛根总黄酮含量最高的葛根药材粉末约0.1g(批号：j22k0012)，精密称定，按本发明的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量，计算rsd，测定结果见表9。
[0108]
表9重复性考察结果
[0109][0110]
实验结果表明该分析方法的重复性良好。
[0111]
(2)准确度实验
[0112]
取已知含量的样品(批号：j22k0012，含量：20.15％)约0.1g，精密称定，每份加入约1/3倍量的葛根素对照品，按本发明的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量，计算rsd，并按以下列公式计算回收率及rsd，结果见表10。
[0113][0114]
表10准确度试验
[0115][0116]
实验结果显示葛根素回收率为94.82％，根据《中国药典》2020版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为10％时，回收率限度为92％～105％，表明回收率良好。
[0117]
2.6.2含量最小值
[0118]
(1)重复性实验
[0119]
取同一批含量最低的葛根药材粉末(批号：jy2021k001，)0.1g，精密称定，按本发明的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量，计算rsd，测定结果见表11。
[0120]
表11重复性考察结果
[0121]
[0122]
实验结果表明该分析方法的重复性良好。
[0123]
(2)准确度实验
[0124]
取已知含量的样品(批号：jy2021k001)0.1g，精密称定，每份加入0.5倍量葛根素对照品，按本发明的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量，计算rsd，并按以下列公式计算回收率及rsd，结果见表12。
[0125][0126]
表12准确度试验
[0127][0128]
实验结果显示葛根素回收率为102.29％，根据《中国药典》2020版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为10％时，回收率限度为92％～105％，表明回收率良好。
[0129]
本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑地分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。