对P95HER2具有特异性的嵌合抗原受体和其用途的制作方法

对p95her2具有特异性的嵌合抗原受体和其用途
技术领域
1.本发明包括在生物技术和生物医学领域内。本发明具体地涉及一种针对her2的p95片段具有特异性的抗体以及包括所述抗体的嵌合抗原受体和其在癌症治疗中的用途。


背景技术：

2.癌症是全球发病率和死亡率的主要原因之一。目前，全球近六分之一的死亡是由癌症造成的，预计在未来20年内，新增病例的数量将增加约70％。
3.现在有许多药物可用于癌症治疗。然而，在许多情况下，癌症对抗癌疗法没有反应或者其生长和/或转移仅被减缓。即使肿瘤最初通过减小大小或进入缓解期对抗癌疗法有反应，肿瘤也经常对药物产生耐药性。由于这些原因，需要新的抗癌剂和药物，其可以用于治疗仍无法治疗的癌症和多药耐药性癌症。
4.her2是在约25％的乳腺癌和胃癌中过度表达的受体酪氨酸激酶。尽管抗her2疗法取得了成功，如单克隆抗体曲妥珠单抗或抑制剂拉帕替尼，但仍有高比例(40％)的晚期乳腺癌病例最终进展。此外，由于her2在心肌细胞中的表达，在接受治疗的患者中经常观察到心脏毒性。因此，临床上需要开发针对her2驱动的肿瘤的更有效且更安全的治疗。还开发了靶向her2的car。然而，针对her2的过继性细胞疗法受到her2在健康组织中表达的限制，这导致严重的副作用。
5.p95her2是仅在一些her2阳性肿瘤中表达的her2的片段。已经表明，t细胞可以通过t细胞双特异性抗体安全地针对p95her2。然而，尚未开发出针对p95her2特异性的基于嵌合抗原受体(car)的过继性细胞疗法。事实上，早期产生p95her2 car的尝试未能在t细胞表面表达，并且无法杀伤表达p95her2的细胞(《研究公开(research disclosure)》，数据库号667070)。因此，本领域需要特异性靶向表达p95her2的细胞的抗肿瘤疗法。


技术实现要素：

6.本发明的作者已经获得嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体能够靶向表达p95her2的细胞并诱导针对p95her2阳性肿瘤的有效抗肿瘤活性，但对表达正常水平her2的细胞没有明显活性。使用来自抗p95her2 scfv的scfv已经获得car，所述抗p95her2 scfv先前未能提供功能性car并且需要将scfv人源化并将scfv内的vh区和vl区的顺序修饰成特定的布置。这在本文档的实例1中示出，其中证明了本发明的car在表达p95her2的细胞中诱导特异性细胞毒性效应，并且相反，对不表达p95her2的细胞没有任何效应。
7.另外，本发明的作者已经从不同的抗p95her2 scfv产生car并表明car能够对表达p95her2的细胞诱导强烈的细胞毒性效应。这在本文档的实例2和3中示出。此外，人源化scfv版本的使用产生对p95her2更具特异性的car t，因为与非人源化版本相比，表达正常水平her2的细胞的杀伤减少，如图6和8所示。因此，在第一方面，本发明涉及一种嵌合抗原受体(car)，其包括：
8.(i)抗原结合结构域，所述抗原结合结构域对p95her2具有特异性；
9.(ii)跨膜结构域；以及
10.(iii)至少一个细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域，
11.其中所述抗原结合结构域选自由以下组成的组：
12.(i)scfv(scfv1)，其特征在于：
[0013]-vl区和vh区的框架区是人源化的；
[0014]-所述vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：1、2和3的序列或其功能等效变体或seq id no：1、174和3的序列或其功能等效变体，并且
[0015]-所述vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：4、5和6的序列或其功能等效变体或seq id no：175、5和6的序列或其功能等效变体，
[0016]
(ii)抗原结合结构域(抗原结合结构域1)，其特征在于：
[0017]-其具有至少一个vh区和至少一个vl区，
[0018]-所述至少vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：7、8和9的序列或其功能等效变体，并且
[0019]-所述至少vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：10、11和12的序列或其功能等效变体，以及
[0020]
(iii)抗原结合结构域(抗原结合结构域2)，其特征在于：
[0021]-其具有至少一个vh区和至少一个vl区，
[0022]-所述至少vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：13、14和15的序列或其功能等效变体，并且
[0023]-所述至少vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：16、17和18的序列或其功能等效变体或seq id no：179、17和18的序列或其功能等效变体。
[0024]
在第二方面，本发明涉及一种核酸，其编码本发明的所述car。
[0025]
在第三方面，本发明涉及一种表达载体，其包括本发明的所述第二方面的所述核酸。
[0026]
在第四方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包括本发明的所述第二方面的所述核酸或本发明的所述第三方面的所述载体。
[0027]
在第五方面，本发明涉及一种scfv，其特征在于：
[0028]-vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：1、2和3的序列或其功能等效变体或seq id no：1、174和3的序列或其功能等效变体，并且
[0029]-vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：4、5和6的序列或其功能等效变体或seq id no：175、5和6的序列或其功能等效变体。
[0030]
在第六方面，本发明涉及一种抗原结合结构域，其特征在于：
[0031]-其具有至少一个vh区和至少一个vl区，
[0032]-所述至少vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：7、8和9的序列或其功能等效变体，并且
[0033]-所述至少vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：10、11和12的序列或其功能等效变体。
[0034]
在第七方面，本发明涉及一种抗体或其片段，其特征在于：
[0035]
其具有至少一个vh区和至少一个vl区，
[0036]-所述至少vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：13、14和15的序列或其功能等效变体，并且
[0037]-所述至少vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：16、17和18的序列或其功能等效变体或seq id no：179、17和18的序列或其功能等效变体。
[0038]
一方面，本发明涉及一种核酸，其编码根据本发明的所述第五方面、所述第六方面和所述第七方面的所述scfv、所述抗原结合结构域或所述抗体。
[0039]
在第九方面，本发明涉及一种表达载体，其包括本发明的所述第八方面的所述核酸。
[0040]
在第十方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包括本发明的所述第八方面的所述核酸或本发明的所述第九方面的所述表达载体。
[0041]
在第十一方面，本发明涉及一种针对患者的癌症诊断方法，所述癌症诊断方法包括：
[0042]
(i)使含有肿瘤细胞的所述患者的样品与根据本发明的所述第五方面、所述第六方面或所述第七方面的scfv、抗原结合结构域或抗体接触；以及
[0043]
(ii)检测所述样品中所述scfv、所述抗原结合结构域或所述抗体与细胞的结合，
[0044]
其中结合的存在指示所述患者患有癌症。
[0045]
在第十二方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的所述第四方面的所述宿主细胞和/或根据本发明的所述第五方面、所述第六方面或所述第七方面的scfv、抗原结合结构域或抗体以及至少一种药学上可接受的赋形剂和/或媒剂。
[0046]
在第十三方面，本发明涉及本发明的所述第四方面的所述宿主细胞和/或本发明的所述第五方面、所述第六方面和所述第七方面的所述scfv、所述抗原结合结构域或所述抗体，其用于医学中。
[0047]
在最后一个方面，本发明涉及本发明的所述第四方面的所述宿主细胞和/或本发明的所述第五方面、所述第六方面和所述第七方面的所述scfv、抗原结合结构域或所述抗体，其在预防或治疗癌症的方法中使用。
附图说明
[0048]
图1.本文档中公开的三种p95her2 car的示意图。(a、)人源化32h2 p95her2 car。(b)214d8 p95her2 car。(c)215c2 p95her2 car。
[0049]
图2. 32h2 p95her2 car t的设计、表达和细胞毒性。(a)含有与全长her2或p95her2结合的scfv的嵌合受体的示意图。(b)转导后第5天t细胞上a中所指示的car的表面表达；指示了总t细胞中阳性car t的百分比。(c)将mcf10a p95her2细胞与car t细胞以所指示的比率共培养。在48小时，通过流式细胞术评估活靶细胞。utd-未经转导的t细胞；trast：基于曲妥珠单抗的car。
[0050]
图3.人源化32h2 p95her2 car t的设计和表达。(a)含有与全长her2或p95her2结合的scfv的嵌合受体的示意图。(b)转导后第5天t细胞上a中所指示的car的表面表达；指示了总t细胞中阳性car t的百分比。utd-未经转导的t细胞；trast：基于曲妥珠单抗的car。
[0051]
图4.h32h2 p95her2 car t的设计、表达和细胞毒性。(a)含有与全长her2或p95her2结合的scfv的嵌合受体的示意图。(b)转导后第5天t细胞上a中所指示的car的表面
表达；指示了总t细胞中阳性car t的百分比。(c)将mcf10a p95her2细胞与car t细胞以所指示的比率共培养。在48小时，通过流式细胞术评估活靶细胞。(d)将mcf10a细胞与car t细胞以所指示的比率共培养。在48小时，通过流式细胞术评估活靶细胞。utd：未经转导的t细胞；trast：基于曲妥珠单抗的car。
[0052]
图5. 214d8 p95her2 car t的设计、表达和细胞毒性。(a)含有与全长her2或p95her2结合的scfv的嵌合受体的示意图。(b)转导后第5天t细胞上a中所指示的car的表面表达；指示了总t细胞中阳性car t的百分比。(c)将mcf10a p95her2细胞与car t细胞以所指示的比率共培养。在48小时，通过流式细胞术评估活靶细胞。utd：未经转导的t细胞；trast：基于曲妥珠单抗的car。
[0053]
图6.人源化214d8 p95her2 car t的设计、表达和细胞毒性。(a)含有与p95her2结合的scfv的嵌合受体的示意图。(b)转导后第5天t细胞上a中所指示的car的表面表达；指示了总t细胞中阳性car t的百分比。(c)将mcf10a p95her2细胞或mcf10a野生型与car t细胞以所指示的比率共培养。在48小时，通过流式细胞术评估活靶细胞。utd：未经转导的t细胞。
[0054]
图7. 215c2 p95her2 car t的设计、表达和细胞毒性。(a)含有与全长her2或p95her2结合的scfv的嵌合受体的示意图。(b)转导后第5天t细胞上a中所指示的car的表面表达；指示了总t细胞中阳性car t的百分比。(c)将mcfl0a p95her2细胞与car t细胞以所指示的比率共培养。在48小时，通过流式细胞术评估活靶细胞。utd：未经转导的t细胞；trast：基于曲妥珠单抗的car。
[0055]
图8.人源化215c2 p95her2 car t的设计、表达和细胞毒性。(a)含有与p95her2结合的scfv的嵌合受体的示意图。(b)转导后第5天t细胞上a中所指示的car的表面表达；指示了总t细胞中阳性car t的百分比。(c)将mcf10a p95her2细胞或mcf10a野生型与car t细胞以所指示的比率共培养。在48小时，通过流式细胞术评估活靶细胞。utd：未经转导的t细胞。
[0056]
图9：m215源性p95her2 car t对体内p95her2阳性肿瘤牛长的影响。(a)用mcf7p95her2细胞原位植入小鼠。当肿瘤达到大约300mm3时，用3
×
106个car t细胞处理所述小鼠。(b)在第144天，每μl血液中循环的人cd3 t细胞相对于总白细胞的百分比。
[0057]
图10.h1_214源性p95her2 car t对p95her2阳性(mcf7p95her2)和p95her2阴性(mcf7)肿瘤牛长的特异性抗肿瘤作用。将小鼠原位植入mcf7p95her2细胞(a)或mcf7细胞(d)。当肿瘤达到大约300mm3时，通过尾静脉注射用3
×
106个car t细胞或utd t细胞处理小鼠，并且在10天后所述小鼠接受相同数量的t细胞的第二剂量。在施用第二剂量之后10天，确定每μl血液中循环的人cd3 t细胞的数量(b,e)。在指定时间点评估每毫克肿瘤的肿瘤浸润cd3细胞的数量(c,f)。
[0058]
图11.本文档公开的p95her2-car的完整氨基酸序列。
[0059]
图12.概述scfv氨基酸序列。
具体实施方式
[0060]
本发明涉及提供用于治疗癌症的新化合物。
[0061]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
[0062]
在本发明的一方面的上下文中公开的所有实施例和定义也适用于本发明的其它
方面。
[0063]
嵌合抗原受体(car)
[0064]
在第一方面，本发明涉及一种嵌合抗原受体(car)，其包括：
[0065]
(i)抗原结合结构域，所述抗原结合结构域对p95her2具有特异性；
[0066]
(ii)跨膜结构域；以及
[0067]
(iii)至少一个细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域，
[0068]
其中所述抗原结合结构域选自由以下组成的组：
[0069]
(i)scfv1，其特征在于：
[0070]-vl区和vh区的框架区是人源化的，
[0071]-所述vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：1、2和3的序列或其功能等效变体或seq id no：1、174和3的序列或其功能等效变体；并且
[0072]-所述vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：4、5和6的序列或其功能等效变体或seq id no：175、5和6的序列或其功能等效变体。
[0073]
(ii)抗原结合结构域(抗原结合结构域1)，其特征在于：
[0074]-其具有至少一个vh区和至少一个vl区，
[0075]-所述至少vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：7、8和9的序列或其功能等效变体，并且
[0076]-所述至少vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：10、11和12的序列或其功能等效变体，以及
[0077]
(iii)抗原结合结构域(抗原结合结构域2)，其特征在于：
[0078]-其具有至少一个vh区和至少一个vl区，
[0079]-所述至少一个vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：13、14和15的序列或其功能等效变体，并且
[0080]-所述至少一个vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：16、17和18的序列或其功能等效变体或seq id no：179、17和18的序列或其功能等效变体。
[0081]
如本文所使用的，“嵌合抗原受体(car)”也被称为嵌合t细胞受体、t体、人工t细胞受体和嵌合免疫受体(cir)，所述嵌合抗原受体是工程化的受体，所述工程化的受体将任意特异性移植到免疫效应细胞上。在经典的car中，将单克隆抗体的特异性移植到t细胞上。因此，car是融合蛋白，所述融合蛋白至少包括细胞外结构域或能够与抗原结合的抗原结合结构域，源自不同于细胞外结构域源自的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个细胞内共刺激结构域。
[0082]
根据本发明，表达“细胞外结构域”、“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”或“抗体片段”可互换使用并且是指可以与某一抗原结合的任何寡肽或多肽。其可以包括抗体片段，所述抗体片段是指完整抗体的至少一部分或其重组变体，例如完整抗体的抗原可变区，所述完整抗体足以允许抗体片段与靶标的识别和特异性结合。本发明的所述抗原结合结构域至少包括vh区和vl区。抗体片段的实例包含但不限于fab、fab
′‑
、f(ab
′
)2和fv片段、scfv抗体片段和线性抗体。在本发明的上下文中，所述抗原结合结构域或抗体片段包括至少一个vh和一个vl区，但是其可以包括两个vl区和两个vh区。因此，例如，在一实施例中，所述抗原结合结构域是scfv，并且因此，其将仅包括一个vl和一个vh区。在另一实施例中，所述抗原
结合结构域是fab片段，在这种情况下，所述片段将包括一个vl和vh(fab或fab
′
)或两个vh和两个vl区(fab2或f(ab
′
)2)。
[0083]
在特定实施例中，所述抗原结合结构域是人源化的。
[0084]
如本文所使用的，非人(例如，鼠类)抗体或抗原结合结构域的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列或不含源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体或抗原结合结构域。在大多数情况下，人源化抗体或抗原结合结构域是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体或抗原结合结构域可以包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。通常进行这些修饰以进一步优化抗体或抗原结合结构域性能。通常，人源化抗体或抗原结合结构域将包括至少一个并且典型地两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有高变环与非人免疫球蛋白的那些环相对应，并且所有或基本上所有fr残基是人免疫球蛋白序列的那些残基。人源化抗体还可以包括免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。
[0085]
本发明的car的抗原结合结构域特异性识别her2的羧基末端片段，p95her2。
[0086]
术语“her2”和“her2受体”在本文中可互换使用并且是指erbb2蛋白(在文献中也被称为her2/neu)。如本文所使用的，所述术语旨在包含her2的变体(例如，剪接变体)、同种型和同源物(直系同源物和旁系同源物两者)。在一些方面，本文公开的抗her2结合分子与her2的结合通过抑制her2与其它erbb家族成员之间的异聚体复合物的形成，例如抑制与egfr或her3的异二聚体化，抑制表达her2的细胞(即典型的肿瘤细胞，特别是表达低水平her2的癌细胞)的生长。
[0087]
her2是受体酪氨酸激酶并且由细胞外结构域(ecd)；跨膜结构域；和细胞内酪氨酸激酶结构域构成，所述细胞外结构域由(i)负责配体结合的两个富含亮氨酸的结构域(结构域i/l1和结构域iii/l2)，和(ii)负责受体二聚化的两个富含半胱氨酸的结构域(结构域ii/cr1和结构域iv/cr2)构成。存在her2的选择性剪接变体并且也可以是本发明的一部分。
[0088]
如本文所使用的术语“p95her2”是指her2受体蛋白的羧基末端片段(ctf)，也被称为“611-ctf”或“100-115kda p95her2”。p95her2片段通过在全长her2分子的密码子位置611处启动her2 mrna的翻译在细胞中产生(anido等人，《欧洲分子生物学组织杂志(embo j)》25；3234-44(2006))。所述片段的分子量为100至115kda并且在细胞膜上表达，在所述细胞膜上，所述片段可以形成由分子间二硫键维持的同源二聚体。
[0089]
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体与抗原结合所涉及的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为vh和vl)通常具有类似的结构，其中每个结构域包括四个保守框架区(fr)和三个高变区(hvr)或互补决定区(cdr)。单个vh或vl结构域可以足以赋予抗原结合特异性。
[0090]
如本文所使用的术语“高变区”、“hvr”、“互补决定区”或“cdr”是指序列高变和/或形成结构限定环(“高变环”)的抗体可变结构域的区中的每个区。通常，天然四链抗体包括六个cdr；三个在vh中(h1、h2、h3)，并且三个在vl中(l1、l2、l3)。因此，cdr确定蛋白质对特异性抗原的亲和力(大致上，结合强度)和特异性。每对的两条链的cdr由框架区比对，获得
与特定表位结合的功能。因此，重可变链和轻可变链两者的特征在于三个cdr，分别为vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3和vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3。
[0091]
可以根据常规标准确定cdr序列，例如通过igblast标准：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/(ye等人，2013，《核酸研究(nucleic acids res)》41(web服务器问题：w34-40)，通过遵循kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)》，第5版，马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院公共卫生局(public health service，national institutes of health，bethesda，md.)(1991)提供的编号，或通过遵循chothia等人(1989，《自然(nature)》342：877-83)提供的编码。该特定区已经由kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》，第5版马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院公共卫生局(1991)和chothia等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》196：901-917(1987)描述，其中当相互比较时，定义包含氨基酸残基的重叠或亚群。涵盖特定cdr的确切残基数将根据cdr的序列和大小而变化。本领域技术人员可以在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下常规地确定哪些残基包括特定cdr。本文给出的cdr序列通常符合kabat定义。
[0092]“框架”或“fr”是指除高变区(hvr)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常由四个fr结构域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，hvr和fr序列通常以下列顺序出现在vh(或vl)中：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。
[0093]
在特定实施例中，本发明的car的抗原结合结构域是scfv。
[0094]
如本文所使用的，“单链可变片段(scfv)”意指源自保留与抗原结合的能力的抗体的单链多肽。scfv的实例包含通过重组dna技术形成的抗体多肽并且在所述重组dna技术中，免疫球蛋白重链片段(vh链)和轻链片段(vl链)的可变(fv)区通过间隔子序列连接。用于制备scfv的各种方法是已知的，并且包含美国专利第4694778号；《自然》，第334卷，第54454页(1989)；和《科学(science)》，第242卷，第1038-1041页(1988)中描述的方法。
[0095]
根据本发明的car的第二元件是与car的细胞外结构域连接的跨膜结构域。
[0096]
如本文所使用的，“跨膜结构域”(tmd)是指穿过细胞膜的car区域。本发明的car的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如，i型跨膜蛋白)、人工疏水序列或其组合的跨膜结构域。跨膜结构域可以包含与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区缔合的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个至多15个氨基酸)和/或与衍生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区缔合的一个或多个另外的氨基酸(例如，细胞内区的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个至多15个氨基酸)。一方面，跨膜结构域是与所使用的car的其它结构域之一缔合的结构域。在一些实例中，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。一方面，跨膜结构域能够与cart细胞表面上的另一个car同源二聚化。在不同的方面，可以修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以便最小化与同一cart中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
[0097]
跨膜结构域可以源自天然的或重组的来源。在所述来源是天然的情况下，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。一方面，每当car与靶标结合时，跨膜结构域能够向细胞内结构域进行信号传导。本发明中特别使用的非限制性实例或跨膜结构域可以至
少包含以下的跨膜区：例如t细胞受体的α、β或ξ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、cd3ζ、kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd1 la、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、ctla4、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrfl)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7ra、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4 cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdga、cdga、cd103、itgal、cdla、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd1c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、lga itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crt am、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a)、lyl08、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkp44、kp30、nkp46，包含nkg2d和/或选自nkg2c的跨膜结构域的跨膜结构域。
[0098]
在特定实施例中，所述跨膜结构域选自由以下组成的组：cd4跨膜结构域、cd8跨膜结构域、cd28跨膜结构域、4-1bb跨膜结构域、ctla4跨膜结构域、cd27跨膜结构域和cd3ζ跨膜结构域。
[0099]
在特定实施例中，所述跨膜结构域是所述cd28跨膜结构域。在特定实施例中，所述cd28跨膜结构域包括序列fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seq id no：113)。
[0100]
根据本发明的car包括至少一个细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。
[0101]
如本文所使用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分并且更具体地是指任何已知的寡肽或多肽，其作为传递信号以引起细胞中生物过程的活化或抑制的结构域。细胞内信号传导结构域产生刺激含car细胞，例如，car-t细胞的免疫效应子功能的信号。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解功能或辅助活性，包含细胞因子的分泌。因此，细胞内信号传导结构域可以是蛋白质的转导效应子功能信号并引导细胞(例如t细胞)执行专门功能的一部分。
[0102]
通常，可以使用整个细胞内信号传导结构域；然而，应当理解，只要所使用的信号传导结构域的任何部分仍然能够转导效应子功能信号，就没有必要使用整个结构域。还应当理解，也可以使用具有基本上相同或更大的功能能力的此类细胞内信号传导结构域的变体。由此，包含变体应该具有基本上相同或更大的效应子功能信号的含义。通常，基本上相同或更大的信号转导包含未经修饰的细胞内信号传导结构域的信号转导的至少80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％或120％或更多，其中未经修饰的细胞内信号传导结构域的信号转导与100％相对应。用于评估效应子功能信号转导的方法是本领域技术人员众所周知的并且包含例如评估指示转导的信号的分子(例如，蛋白质，如细胞因子)的量和/或活性。因此，当信号是t细胞的细胞溶解功能时，所述方法可以涉及测量由t细胞分泌的一种或多种细胞因子，已知所述一种或多种细胞因子具有细胞溶解活性(例如i fnγ)。评估细胞溶解功能的另一种方法是通过cfse染色并通过流式细胞术或通过本领域众所周知的铬释放测定来对阳性细胞进行计数。
[0103]
用于本发明的car的细胞内信号传导结构域的实例可以包含t细胞受体(tcr)和共受体的胞质序列，所述受体在抗原受体结合后协同作用以启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何重组序列。
[0104]
已知的是，单独通过tcr产生的信号通常不足以完全活化t细胞，并且可能还需要次级和/或共刺激信号。因此，可以说t细胞活化由两种不同类别的细胞内信号传导序列介
导：通过tcr(初级细胞内信号传导结构域)启动抗原依赖性初级活化的那些序列和以抗原非依赖性方式提供次级或共刺激信号(次级细胞内信号传导结构域，如共刺激结构域)的那些序列。共刺激结构域促进效应子功能的活化并且还可以促进效应子功能的持久性和/或细胞的存活。
[0105]
初级细胞内信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调节tcr复合物的初级活化。以刺激性方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有信号传导基元，所述信号传导基元被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam(例如，2个、3个、4个、5个或更多个itam)。因此，细胞内信号传导结构域可以包括一个或多个itam。本发明中特别使用的含有初级细胞内信号传导结构域的itam的实例包含cd3ζ、fc受体γ、fc受体β、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些itam。
[0106]
在一个实施例中，本发明的car的细胞内信号传导结构域是cd3-ζ，并且更具体地，本发明的car包括序列rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no：114)。
[0107]
术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“cd3-ζ”或“tcr-ζ”被定义为基因库条目号bag36664.1所表示的蛋白质，或来自如小鼠、啮齿动物、猴子、灵长类动物等非人物种的等效残基，并且“ζ刺激结构域”或可替代地“cd3ζ刺激结构域”或“tcrζ刺激结构域”被定义为ζ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以进行活化t细胞等所需的初级信号的功能性传输。一方面，ζ胞质结构域包括包含bag36664.1的基因库条目蛋白的残基52到164，或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴子、灵长类动物等的等效残基，其是其功能性直系同源物。
[0108]
应当理解，可以修饰细胞内信号传导结构域的一个或多个itam，例如通过突变。与天然itam结构域相比，修饰可以用于增加或减少itam的信号传导功能。
[0109]
如上所述，细胞内信号传导结构域可以单独包括初级细胞内信号传导结构域，或者其可以与如一个或多个共刺激信号传导结构域等一个或多个次级细胞内信号传导结构域组合包括初级细胞内信号传导结构域。因此，car的细胞内信号传导结构域可以单独或与如一个或更多个共刺激信号传导结构域等一个或多个其它细胞内信号传导结构域组合包括cd3ζ信号传导结构域。
[0110]
共刺激信号传导结构域是指car的一部分，其包括共刺激分子的细胞内结构域。
[0111]
术语“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合的可识别的t细胞结合配偶体，由此介导t细胞产生的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原特异性受体或其配体以外的细胞表面分子，所述细胞表面分子是有效免疫应答所必需的。共刺激分子可以是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，所述细胞表面分子是免疫细胞(例如淋巴细胞)对抗原的有效应答所必需的。共刺激分子可以用以下蛋白家族表示：tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、淋巴细胞活化信号分子(slam蛋白)和nk细胞活化受体。此类分子的实例包含但不限于4-1bb(cd137)、ox40、icos、dap10、cd27、cd28、cds、cd30、cd137(4-1bb)、cd40、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、gitr、nkg2c、slamf7、nkp80、baffr、hvem、btla、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、b7-h3以及与cd83特异性结合的配体等。例如，cd27共刺激已被证明体外增强人cart细胞的扩增、效应子功能和存活并且体内增强人t细胞持久性和抗肿瘤活性(song等人《血液(blood)》2012；119(3)：696-706)。
[0112]
在特定实施例中，本发明的car包括共刺激分子cd28的细胞内结构域，并且更具体地包括序列rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no：115)。
[0113]
在优选实施例中，所述至少一个细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域、初级信号传导结构域或其组合。
[0114]
在另一实施例中，所述至少一个细胞内信号传导结构域包括选自以下的共刺激分子的细胞内结构域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd1la/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap 12和4-1bb(cd137)或其任何组合。
[0115]
在特定实施例中，所述至少一个细胞内信号传导结构域进一步包括cd3-ζ细胞内结构域。
[0116]
在另一实施例中，所述至少一个细胞内信号传导结构域相对于所述cd3-ζ细胞内结构域布置在n末端侧上。在另一实施例中，所述至少一个细胞内信号传导结构域是所述共刺激分子cd28的所述细胞内结构域，并且相对于所述cd3-ζ细胞内结构域布置在n末端侧上。
[0117]
本发明的car的细胞内部分内的细胞内信号传导序列可以以随机或指定顺序彼此连接。任选地，短寡或多肽连接子，例如长度在2个与10个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)之间的连接子可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的连接子。在另一实施例中，如丙氨酸或甘氨酸等单个氨基酸可以用作合适的连接子。
[0118]
在一个实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包括两个或多个，例如3个、4个、5个或更多个共刺激信号传导结构域。在一实施例中，两个或更多个，例如2个、3个、4个、5个或更多个共刺激信号传导结构域被连接子分子隔开，如本文所描述的连接子分子。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包括两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，连接子分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，连接子是丙氨酸残基。
[0119]
在优选实施例中，car的细胞内部分包括：
[0120]-cd3ζ的信号传导结构域和cd28的信号传导结构域；
[0121]-cd3-ζ的信号传导结构域和4-1bb的信号传导结构域；
[0122]-cd3-ζ的信号传导结构域和ox40的信号传导结构域；
[0123]-cd3-ζ的信号传导结构域和icos的信号传导结构域；
[0124]-cd3-ζ的信号传导结构域和dap10的信号传导结构域；
[0125]-cd3-ζ的信号传导结构域、4-1bb的信号传导结构域和ox40的信号传导结构域；
[0126]-4-1bb的信号传导结构域和cd28的信号传导结构域。
[0127]
在另一实施例中，car的细胞内部分包括cd3-ζ的信号传导结构域、4-1bb的信号传导结构域和cd28的信号传导结构域。
[0128]
细胞内信号传导结构域可以包含整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域、其来源的分子或其功能片段。
[0129]
本发明的car的抗原结合结构域选自scfv1和两个抗原结合结构域，抗原结合结构域1和抗原结合结构域2。
[0130]
所述scfv1的特征在于：
[0131]-所述v
l
区和所述vh区是人源化的，
[0132]-所述vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：1、2和3的序列或其功能等效变体或seq id no：1、174和3的序列或其功能等效变体，并且
[0133]-所述v
l
区的cdrl、cdr2和cdr3分别包括seq id no：4、5和6的序列或其功能等效变体或seq id no：175、5和6的序列或其功能等效变体。
[0134]
在特定实施例中，所述scfvl的所述v
l
区相对于所述vh区位于n末端或c末端。在更优选的实施例中，所述scfv1的所述v
l
区相对于所述vh区位于n末端。
[0135]
具有至少一个vh区和至少一个vl区的抗原结合结构域1的特征在于：
[0136]-所述至少一个vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：7、8和9的序列或其功能等效变体，并且
[0137]-所述至少v
l
区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：10、11和12的序列或其功能等效变体。
[0138]
具有至少一个vh区和至少一个vl区的抗原结合结构域2的特征在于：
[0139]-所述vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：13、14和15的序列或其功能等效变体，并且
[0140]-所述v
l
区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：16、17和18的序列或其功能等效变体或seq id no：179、17和18的序列或其功能等效变体。
[0141]
如本文所使用的，术语“cdr序列的功能等效变体”是指特定cdr序列的序列变体，其具有与其基本上类似的序列同一性，并且当作为如本文所描述的scfv的抗体、抗体片段或抗原结合结构域的一部分时，基本上维持其与其同源抗原结合的能力。例如，cdr序列的功能等效变体可以是包括一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代的所述序列的多肽序列衍生物。在一个实施例中，功能等效变体中的一个氨基酸被另一个氨基酸取代是保守取代。
[0142]
如本文所使用的，术语“保守性取代”是指一个氨基酸被另一个具有类似化学性质的氨基酸替代。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。以下六个基团各自含有彼此保守取代的氨基酸：
[0143]
1)丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；
[0144]
2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
[0145]
3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；
[0146]
4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
[0147]
5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)、缬氨酸(v)；以及
[0148]
6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)。
[0149]
根据本发明的cdr序列的功能等效变体包含与上述参考序列之一中所示的对应的氨基酸序列具有至少70％％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的cdr序列。还经考虑，cdr序列的功能等效变体在上述参考序列之一中所示的对应的氨基酸序列的n末端处、或c末端处或n末端和c末端两者处包括由至少1个氨基酸、或至少2个氨基酸、或至少3个氨基酸、或至少4个氨基酸、或至少5个氨基酸、或至少6个氨基酸、或至少7个氨基酸、或至少8个氨基酸、或至少9个氨基酸、或至少10个氨基酸或更多个氨基酸组成的添加。同样，还经考虑，变体在上述参考序列之一中所示的对应的氨基酸序列的n末端处、或c末端处或n末端和c末端两者处包括由至少1个氨基酸、或至少2个氨基酸、或至少3个氨
基酸、或至少4个氨基酸、或至少5个氨基酸、或至少6个氨基酸、或至少7个氨基酸、或至少8个氨基酸、或至少9个氨基酸、或至少10个氨基酸或更多个氨基酸组成的缺失。
[0150]
根据本发明的cdr序列的功能等效变体将优选地维持seq id no：1至18和174-179之一中所示的对应的氨基酸序列在作为如本发明的car的scfv等抗体片段或抗原结合结构域的一部分时与其同源抗原结合的能力的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少200％或更多。这种与其同源抗原结合的能力可以被确定为抗体或抗体片段与其同源抗原的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性的值。
[0151]
在特定实施例中，所述scfv1的所述vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：19、20、21和22的序列或其功能等效变体，并且所述scfv1的所述vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：23、24、25和26的序列或其功能等效变体。
[0152]
在另一特定实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：31、32、33和34的序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：35、36、37和38的序列或其功能等效变体。
[0153]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：31、32、33和34、seq id no：65、66、67和68或seq id no：73、74、75和76的序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl区的fri、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：35、36、37和38、seq id no：69、70、71和72或seq id no：77、78、79和80的序列或其功能等效变体。
[0154]
在另一特定实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：42、43、44和45的序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域2的所述至少vl区的frl、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：46、47、48和49的序列或其功能等效变体。
[0155]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：42、43、44和45、seq id no：89、90、91和92或seq id no：97、98、99和100的序列或其功能等效变体，并且抗原的所述至少一个vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：46、47、48和49或seq id no：93、94、95和96的序列或其功能等效变体。
[0156]
如本文所使用的，术语“fr序列的功能等效变体”是指特定fr序列的序列变体，其具有与其基本上类似的序列同一性，并且当作为如本文所描述的抗体或抗原结合结构域的一部分时，基本上维持其与其同源抗原结合的能力。例如，fr序列的功能等效变体可以是包括一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代的所述序列的多肽序列衍生物。
[0157]
根据本发明的fr序列的功能等效变体包含与上述参考序列之一中所示的对应的氨基酸序列具有至少大约70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的fr序列。还经考虑，fr序列的功能等效变体在上述参考序列之一中所示的对应的氨基酸序列的n末端处、或c末端处或n末端和c末端两者处包括由至少1个氨基酸、或至少2个氨
基酸、或至少3个氨基酸、或至少4个氨基酸、或至少5个氨基酸、或至少6个氨基酸、或至少7个氨基酸、或至少8个氨基酸、或至少9个氨基酸、或至少10个氨基酸或更多个氨基酸组成的添加。同样，还经考虑，变体在上述参考序列之一中所示的对应的氨基酸序列的n末端处、或c末端处或n末端和c末端两者处包括由至少1个氨基酸、或至少2个氨基酸、或至少3个氨基酸、或至少4个氨基酸、或至少5个氨基酸、或至少6个氨基酸、或至少7个氨基酸、或至少8个氨基酸、或至少9个氨基酸、或至少10个氨基酸或更多个氨基酸组成的缺失。
[0158]
根据本发明的fr序列的功能等效变体将优选地维持seq id no：19-26、31-38和42-49之一中所示的对应的氨基酸序列在作为本发明的抗原结合结构域的一部分时与其同源抗原结合的能力的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少200％或更多。这种与其同源抗原结合的能力可以被确定为抗体或抗体片段与其同源抗原的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性的值。
[0159]
在一实施例中，所述scfv1的所述vl包括seq id no：27或180的序列或其功能等效变体，并且所述scfc1的所述vh包括seq id no：28或181的序列或其功能等效变体。
[0160]
在一实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl包括seq id no：39的序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域1的所述vh包括seq id no：40的序列或其功能等效变体。
[0161]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl区包括seq id no：39、54或56的序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh区包括seq id no：40、53或55的序列或其功能等效变体。
[0162]
在一实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vl包括seq id no：50或184的序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh包括seq id no：51的序列或其功能等效变体。
[0163]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vl区包括seq id no：50、184、60或62的序列并且所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh区包括选自seq id no：51、59或61的序列或其功能等效变体。
[0164]
scfv1的vl区和vh区的优选实施例定义如下：
[0165]
1.在一个实施例中，根据本发明的scfv1的vl的特征在于，cdr1区：
[0166]
1.1.不含序列kasqnvgtava(seq id no：10或16)，并且任选地，其显示与序列kasqsvgtava(seq id no：4)或与序列rasqsvgtava(seq id no：175)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0167]
1.2.不含在位置5处的asn残基，并且任选地，其显示与序列kasqsvgtava(seq id no：4)或与序列rasqsvgtava(seq id no：175)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0168]
1.3.相对于kasqsvgtava的序列(seq id no：4)或序列rasqsvgtava(seq id no：175)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9
个或至少10个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列kasqsvgtava(seq id no：4)或与序列rasqsvgtava(seq id no：175)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0169]
1.4.不含序列kasqnvgtava(seq id no：10或16)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸或所有氨基酸是在序列kasqsvgtava(seq id no：4)或序列rasqsvgtava(seq id no：175)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0170]
1.5.不含序列kasqnvgtava(seq id no：10或16)，并且其含有与kasqsvgtava的序列(seq id no：4)或与序列rasqsvgtava(seq id no：175)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸。
[0171]
2.在一个实施例中，根据本发明的scfv1的vl的特征在于，cdr2区：
[0172]
2.1.不含序列sasnryt(seq id no：11或17)，并且任选地，其显示与序列sasnrft(seq id no：5)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0173]
2.2.不含在位置6处的tyr残基，并且任选地，其显示与序列sasnrft(seq id no：5)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0174]
2.3.相对于sasnrft的序列(seq id no：5)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列sasnrft(seq id no：5)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0175]
2.4.不含序列sasnryt(seq id no：11或17)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有氨基酸是在序列sasnrft(seq id no：5)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0176]
2.5.不含序列sasnryt(seq id no：11或17)，并且其含有与sasnrft的序列(seq id no：5)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸。
[0177]
3.在一个实施例中，根据本发明的scfv1的vl的特征在于，cdr3区：
[0178]
3.1.不含含有序列qqystyplt(seq id no：12)或序列qqyssyplt(seq id no：18)的序列，并且任选地，其显示与序列qqystypla(seq id no：6)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0179]
3.2.不含在位置9处的thr残基和/或在位置5处的ser残基，并且任选地，其显示与序列qqystypla(seq id no：6)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0180]
3.3.相对于qqystypla的序列(seq id no：6)的序列，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列qqystypla(seq id no：6)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0181]
3.4.不含序列qqystyplt(seq id no：12)或序列qqyssyplt(seq id no：18)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有氨基酸是在序列qqystypla(seq id no：6)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0182]
3.5.不含序列qqystyplt(seq id no：12)或序列qqyssyplt(seq id no：18)，并且其含有与qqystypla的序列(seq id no：6)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸。
[0183]
4.在一个实施例中，根据本发明的scfv1的vh的特征在于，cdr1区：
[0184]
4.1.不含序列tygma(seq id no：7)或序列dygms(seq id no：13)，并且任选地，其显示与序列dfgms(seq id no：1)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0185]
4.2.不含在位置1处的thr残基、在位置2处的tyr残基和/或在位置5处的ala残基，并且任选地，其显示与序列dfgms(seq id no：1)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0186]
4.3.相对于dfgms的序列(seq id no：1)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列dfgms(seq id no：1)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0187]
4.4.不含序列tygma(seq id no：7)或序列dygms(seq id no：13)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸是在序列dfgms(seq id no：1)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0188]
4.5.不含序列tygma(seq id no：7)或序列dygms(seq id no：13)，并且其含有与dfgms的序列(seq id no：1)共有的至少1个、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸。
[0189]
5.在一个实施例中，根据本发明的scfv1的vh的特征在于，cdr2区：
[0190]
5.1.不含序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)或序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)，并且任选地，其显示与序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)或与序列tintnggtthypdsvkg(seq id no：174)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0191]
5.2.不含在位置4处的ser或gly残基、在位置7处的val残基、在位置8处的lys残基、在位置9处的ile残基、在位置10处的tyr残基、在位置11处的his残基、在位置12处的val残基，并且任选地，其显示与序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)或与序列tintnggtthypdsvkg(seq id no：174)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、
至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0192]
5.3.相对于tintnggtthypdnvkg的序列(seq id no：8)或序列tintnggtthypdsvkg(seq id no：14)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)或与序列tintnggtthypdsvkg(seq id no：174)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0193]
5.4.不含序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)或序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个氨基酸或所有是在序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)或序列tintnggtthypdsvkg(seq id no：174)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0194]
5.5.不含序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)或序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)，并且其含有含有与tintnggtthypdnvkg的序列(seq id no：2)或与序列tintnggtthypdsvkg(seq id no：174)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个氨基酸。
[0195]
6.在一个实施例中，根据本发明的scfv1的vh的特征在于，cdr3区：
[0196]
6.1.不含序列egfdy(seq id no：9或15)，并且任选地，其显示与序列egldy(seq id no：3)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0197]
6.2.不含在位置3处的phe残基，并且任选地，其显示与序列egldy(seq id no：3)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0198]
6.3.相对于egldy的序列(seq id no：3)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列egldy(seq id no：3)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0199]
6.4.不含序列egfdy(seq id no：9或15)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸是在序列egldy(seq id no：3)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0200]
6.5.不含序列egfdy(seq id no：9或15)，并且其含有与egldy的序列(seq id no：3)共有的至少1个、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸。
[0201]
抗原结合结构域1的vl区和vh区的优选实施例定义如下：
[0202]
1.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域1的vl的特征在于，cdr1区：
[0203]
1.1.不含序列kasqsvgtava(seq id no：4)，并且任选地，其显示与序列kasqnvgtava(seq id no：10)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0204]
1.2.不含在位置5处的ser残基，并且任选地，其显示与序列kasqnvgtava(seq id no：10)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0205]
1.3.相对于kasqnvgtava的序列(seq id no：10)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列kasqnvgtava(seq id no：10)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0206]
1.4.不含序列kasqsvgtava(seq id no：4)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸或所有氨基酸是在序列kasqnvgtava(seq id no：10)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0207]
1.5.不含序列kasqsvgtava(seq id no：4)，并且其含有与kasqnvgtava的序列(seq id no：10)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸。
[0208]
2.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域1的vl的特征在于，cdr2区：
[0209]
2.1.不含序列sasnrft(seq id no：5)，并且任选地，其显示与序列sasnryt(seq id no：11)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0210]
2.2.不含在位置6处的phe残基，并且任选地，其显示与序列sasnryt(seq id no：11)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0211]
2.3.相对于sasnryt的序列(seq id no：11)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列sasnryt(seq id no：11)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0212]
2.4.不含序列sasnrft(seq id no：5)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有氨基酸是在序列sasnryt(seq id no：11)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0213]
2.5.不含序列sasnrft(seq id no：5)，并且其含有与sasnryt的序列(seq id no：11)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸。
[0214]
3.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域1的vl的特征在于，cdr3区：
[0215]
3.1.不含序列qqystypla(seq id no：6)或序列qqyssyplt(seq id no：18)，并且任选地，其显示与序列qqystyplt(seq id no：12)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0216]
3.2.不含在位置9处的ala残基和/或在位置5处的丝氨酸残基，并且任选地，其显示与序列qqystyplt(seq id no：12)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0217]
3.3.相对于qqystyplt的序列(seq id no：12)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列qqystyplt(seq id no：12)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0218]
3.4.不含序列qqystypla(seq id no：6)或序列qqyssyplt(seq id no：18)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有氨基酸是在序列qqystyplt(seq id no：12)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0219]
3.5.不含序列qqystypla(seq id no：6)或序列qqyssyplt(seq id no：18)，并且其含有与qqystyplt的序列(seq id no：12)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸。
[0220]
4.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域1的vh的特征在于，cdr1区：
[0221]
4.1.不含序列dfgms(seq id no：1)或序列dygms(seq id no：13)，并且任选地，其显示与序列tygma(seq id no：7)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0222]
4.2.不含在位置1处的asp残基、在位置2处的phe残基和/或在位置5处的ser残基，并且任选地，其显示与序列tygma(seq id no：7)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0223]
4.3.相对于tygma的序列(seq id no：7)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列tygma(seq id no：7)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0224]
4.4.不含序列dfgms(seq id no：1)或序列dygms(seq id no：13)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸是在序列tygma(seq id no：7)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代，
[0225]
4.5.不含序列dfgms或序列dygms，并且其含有与tygma的序列(seq id no：7)共有的至少1个、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸。
[0226]
5.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域1的vh的特征在于，cdr2区：
[0227]
5.1.不含序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)或序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)，并且任选地，其显示与序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0228]
5.2.不含在位置4处的thr或gly残基、在位置7处的val残基、在位置8处的thr、在位置9处的ile残基、在位置10处的his残基、在位置12处的val残基和/或在位置14处的asn残基，并且任选地，其显示与序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0229]
5.3.相对于tinsnggktyhpdsvkg的序列(seq id no：8)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0230]
5.4.不含序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)或序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个氨基酸或所有是在序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0231]
5.5.不含序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)或序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)，并且其含有含有与tinsnggktyhpdsvkg的序列(seq id no：8)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个氨基酸。
[0232]
6.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域1的vh的特征在于，cdr3区：
[0233]
6.1.不含序列egldy(seq id no：3)，并且任选地，其显示与序列egfdy(seq id no：9)或与序列dy至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0234]
6.2.不含在位置3处的leu残基，并且任选地，其显示与序列egfdy(seq id no：9)或与序列dy至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0235]
6.3.相对于egfdy的序列(seq id no：9)或序列dy，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列egfdy(seq id no：9)或与序列dy至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0236]
6.4.不含序列egldy(seq id no：3)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸是在序列egfdy(seq id no：9)或序列dy中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0237]
6.5.不含序列egldy(seq id no：3)，并且其含有与egfdy的序列(seq id no：9)或与序列dy共有的至少1个、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸。
[0238]
抗原结合结构域2的vl区和vh区的优选实施例定义如下。
[0239]
1.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域2的vl的特征在于，cdr1区：
[0240]
1.1.不含序列kasqsvgtava(seq id no：4)，并且任选地，其显示与序列kasqnvgtava(seq id no：16)或序列rasqnvgtava(seq id no：179)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0241]
1.2.不含在位置5处的ser残基，并且任选地，其显示与序列kasqnvgtava(seq id no：16)或序列rasqnvgtava(seq id no：179)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0242]
1.3.相对于kasqnvgtava的序列(seq id no：16)或序列rasqnvgtava(seq id no：179)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列kasqnvgtava(seq id no：16)或序列rasqnvgtava(seq id no：179)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0243]
1.4.不含序列kasqsvgtaa(seq id no：4)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸或所有氨基酸是在序列kasqnvgtava(seq id no：16)或序列rasqnvgtava(seq id no：179)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0244]
1.5.不含序列kasqsvgtava(seq id no：4)，并且其含有与kasqnvgtava的序列(seq id no：16)或序列rasqnvgtava(seq id no：179)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸。
[0245]
2.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域2的vl的特征在于，cdr2区：
[0246]
2.1.不含序列sasnrft(seq id no：5)，并且任选地，其显示与序列sasnryt(seq id no：17)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0247]
2.2.不含在位置6处的phe残基，并且任选地，其显示与序列sasnryt(seq id no：17)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0248]
2.3.相对于sasnryt的序列(seq id no：17)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列sasnryt(seq id no：17)至少约
70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0249]
2.4.不含序列sasnrft(seq id no：5)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有氨基酸是在序列sasnryt(seq id no：17)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0250]
2.5.不含序列sasnrft(seq id no：5)，并且其含有与sasnryt的序列(seq id no：17)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸。
[0251]
3.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域2的vl的特征在于，cdr3区：
[0252]
3.1.不含含有序列qqystypla(seq id no：6)或序列qqystyplt(seq id no：12)的序列，并且任选地，其显示与序列qqyssyplt(seq id no：18)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0253]
3.2.不含在位置9处的ala残基和/或在位置5处的thr残基，并且任选地，其显示与序列qqyssyplt(seq id no：18)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0254]
3.3.相对于qqyssyplt的序列(seq id no：18)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列qqyssyplt(seq id no：18)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0255]
3.4.不含序列qqystypla(seq id no：6)或序列qqystyplt(seq id no：12)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有氨基酸是在序列qqyssyplt(seq id no：18)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0256]
3.5.不含序列qqystypla(seq id no：6)或序列qqystyplt(seq id no：12)，并且其含有与qqyssyplt的序列(seq id no：18)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸。
[0257]
4.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域2的vh的特征在于，cdr1区：
[0258]
4.1.不含序列tygma(seq id no：7)或序列dfgms(seq id no：1)，并且任选地，其显示与序列dygms(seq id no：13)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0259]
4.2.不含在位置1处的thr残基、在位置2处的phe残基和/或在位置5处的ala残基，并且任选地，其显示与序列dygms(seq id no：13)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0260]
4.3.相对于dygms的序列(seq id no：13)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列dygms(seq id no：13)至少约70％、至
少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0261]
4.4.不含序列tygma(seq id no：7)或序列dfgms(seq id no：1)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸是在序列dygms(seq id no：13)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0262]
4.5.不含序列tygma(seq id no：7)或序列dfgms(seq id no：1)，并且其含有与dygms的序列(seq id no：13)共有的至少1个、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸。
[0263]
5.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域2的vh的特征在于，cdr2区：
[0264]
5.1.不含序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)或序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)，并且任选地，其显示与序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0265]
5.2.不含在位置4处的ser或thr残基、在位置7处的gly残基、在位置8处的thr残基、在位置9处的thr残基、在位置10处的his残基、在位置11处的his残基、在位置12处的pro残基和/或在位置14处的asn残基，并且任选地，其显示与序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0266]
5.3.相对于tingngvkiyyvdsvkg的序列(seq id no：14)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0267]
5.4.不含序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)或序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个氨基酸或所有是在序列tingngvkiyyvdsvkg(seq id no：14)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0268]
5.5.不含序列tinsnggktyhpdsvkg(seq id no：8)或序列tintnggtthypdnvkg(seq id no：2)，并且其含有含有与tingngvkiyyvdsvkg的序列(seq id no：14)共有的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个氨基酸。
[0269]
6.在一个实施例中，根据本发明的抗原结合结构域2的vh的特征在于，cdr3区：
[0270]
6.1.不含序列egldy(seq id no：3)，并且任选地，其显示与序列egfdy(seq id no：15)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0271]
6.2.不含在位置3处的leu残基，并且任选地，其显示与序列egfdy(seq id no：15)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性，
[0272]
6.3.相对于egfdy的序列(seq id no：15)，在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸上不同，并且任选地，其显示与序列egfdy(seq id no：15)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
[0273]
6.4.不含序列egldy(seq id no：3)，并且至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸是在序列egfdy(seq id no：15)中的对应的位置中发现的氨基酸的保守取代。
[0274]
6.5.不含序列egldy(seq id no：3)，并且其含有与egfdy的序列(seq id no：15)共有的至少1个、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸。
[0275]
在另一实施例中，所述scfv1包括seq id no：30或182的序列或其功能等效物。
[0276]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域1包括序列seq id no：41或其功能等效。
[0277]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域1包括seq id no：41、187、188或189的序列或其功能等效变体。
[0278]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域2包括序列seq id no：52或186或其功能等效。
[0279]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域2包括seq id no：52、186、190或191的序列或其功能等效变体。
[0280]
在特定实施例中，所述scfv1的所述vl包括与seq id no：27或180具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述scfv1的所述vl包括seq id no：27或180的序列或与seq id no：27或180具有至少85％序列同一性的功能等效变体。
[0281]
在特定实施例中，所述scfv1的所述vh包括与seq id no：28或181具有至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述scfvl的所述vh包括seq id no：28或181的序列或与seq id no：28或181具有至少67％序列同一性的功能等效变体。
[0282]
在特定实施例中，所述scfv1包括seq id no：28的序列或其功能等效变体。在另一实施例中，所述scfv1包括与seq id no：30或182具有至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述scfv1包括seq id no：30或182的序列或与seq id no：30或182具有至少76％序列同一性的功能等效变体。
[0283]
在另一特定实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl包括seq id no：39的序列并且所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh包括seq id no：40的序列或其功能等效变体。
[0284]
在特定实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl包括与seq id no：39具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl包括seq id no：39的序列或与seq id no：39具有至少39％序列同一性的功能等效变体。
[0285]
在特定实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh包括与seq id no：40具有至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh包括seq id no：40的序列或与seq id no：40具有至少74％序列同一性的功能等效变体。
[0286]
在特定实施例中，所述抗原结合结构域1包括seq id no：41的序列或其功能等效变体。在另一实施例中，所述抗原结合结构域1包括与seq id no：41具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述抗原结合结构域1包括seq id no：41的序列或与seq id no：41具有至少85％序列同一性的功能等效变体。
[0287]
在另一特定实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vl包括seq id no：50或184的序列或其功能等效并且所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh包括seq id no：51的序列或其功能等效变体。
[0288]
在特定实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vl包括与seq id no：50或184具有至少、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述抗原结合结构域的所述至少一个vl包括seq id no：50或184的序列或与seq id no：50或184具有至少89％序列同一性的功能等效变体。
[0289]
在特定实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh包括与seq id no：51具有至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh包括seq id no：51的序列或与seq id no：51具有至少67％序列同一性的功能等效变体。
[0290]
在特定实施例中，所述抗原结合2包括seq id no：52或186的序列或其功能等效变体。在另一实施例中，抗原结合结构域2包括与seq id no：52或186具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在优选实施例中，所述抗原结合结构域包括seq id no：52或186的序列或与seq id no：52或186具有至少78％序列同一性的功能等效变体。
[0291]
在特定实施例中，本发明的所述car的所述抗原结合结构域1和2的所述vh区和/或所述vl区是人源化的。
[0292]
因此，在特定实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh区包括选自seq id no：53和55的人源化序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl区包括选自seq id no：54和56的人源化序列或其功能等效变体。
[0293]
在特定实施例中，所述抗原结合结构域1包括选自seq id no：187、188和189的人源化序列。
[0294]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh区和vl区包括人源化fr1、fr2、fr3和fr4区，其中所述至少一个vh区的fri、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：65、66、67和68或其功能等效变体，并且所述至少vl区的fri、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：69、70、71和72或其功能等效变体。
[0295]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh区和vl区包括人源化fr1、fr2、fr3和fr4区，其中所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：73、74、75和76或其功能等效变体，并且所述至少一个vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：77、78、79和80或其功能等效变体。
[0296]
在另一实施例中，本发明的所述car的所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh区包括至少一个人源化fr区、至少2个人源化fr区、至少3个人源化fr区或至少4个人源化fr区，并且其中所述fr区选自：
[0297]
fr1：seq id no：65和73；
[0298]
fr2：seq id no：66和74；
[0299]
fr3：seq id no：67和75；以及
[0300]
fr4：seq id no：68和76；
[0301]
或其功能等效变体。
[0302]
在另一实施例中，本发明的所述car的所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl区包括至少一个人源化fr区、至少2个人源化fr区、至少3个人源化fr区或至少4个人源化fr区，并且其中所述fr区选自：
[0303]
fr1：seq id no：69和77；
[0304]
fr2：seq id no：70和78；
[0305]
fr3：seq id no：71和79；以及
[0306]
fr4：seq id no：72和80；
[0307]
或其功能等效变体。
[0308]
同样，在特定实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh区包括选自seq id no：59和61的人源化序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域1的所述至少一个vh区包括选自seq id no：60和62的人源化序列或其功能等效变体。
[0309]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域2包括选自seq id no：190和191的人源化序列。
[0310]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh区和vl区包括人源化fri、fr2、fr3和fr4区，其中所述至少一个vh区的fri、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：89、90、91和92或其功能等效变体，并且所述至少一个vl区的fri、fr2、fr3和fr4分别包
括序列seq id no：93、94、95和96或其功能等效变体。
[0311]
在另一实施例中，所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh区和vl区包括人源化fr1、fr2、fr3和fr4区，其中所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：97、98、99和100或其功能等效变体，并且所述至少一个vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：101、102、103和104或其功能等效变体。
[0312]
在另一实施例中，本发明的所述car的所述抗原结合结构域2的所述至少一个vh区包括至少一个人源化fr区、至少2个人源化fr区、至少3个人源化fr区或至少4个人源化fr区。在一些实施例中，人源化fr区选自由以下组成的组：fri的seq id no：89和97、fr2的seq id no：90和98、fr3的seq id no：91和99以及fr4的seq id no：92和100或其功能等效变体。
[0313]
在另一实施例中，本发明的所述car的所述抗原结合结构域2的所述至少一个vl区包括至少一个人源化fr区、至少2个人源化fr区、至少3个人源化fr区或至少4个人源化fr区。在一些实施例中，人源化fr区选自由以下组成的组：fr1的seq id no：93和101、fr2的seq id no：94和102、fr3的seq id no：95和103以及fr4的seq id no：96和104或其功能等效变体。
[0314]
在一些情况下，car包含任何两个相邻结构域之间的连接子。例如，连接子可以安置在抗原结合结构域的跨膜结构域与共刺激结构域之间。作为另一实例，连接子可以安置在抗原结合结构域与细胞内信号传导结构域之间。
[0315]
在特定实施例中，当所述抗原结合结构域是scfv时，所述抗原结合结构域的所述vh区和所述vl区通过包括seq id no：29的连接子区连接。
[0316]
在一实施例中，所述抗原结合结构域1是scfv并且所述scfv的所述vh区和所述vl区通过包括seq id no：29的连接子区连接。在另一实施例中，所述抗原结合结构域2是scfv并且所述scfv的所述vh区和所述vl区通过包括seq id no：29的连接子区连接。
[0317]
在特定实施例中，所述连接子位于所述scfv的所述vh区与所述vl区之间。在更特定实施例中，所述vh与所述vl之间的所述连接子包括序列seq id no：29。在一实施例中，当本发明的所述car的所述scfv是scfv1时，所述scfv包括结构vl-连接子-vh或vh-连接子-vl。在特定实施例中，当本发明的所述car的所述scfv是scfv1时，所述scfv包括结构vl-连接子-vh。在另一实施例中，当本发明的所述car的所述抗原结合结构域1或2是scfv时，所述scfv可以具有结构vh-连接子-vl或vl-连接子-vh。在特定实施例中，所述连接子相对于所述vl区位于c末端并且相对于所述vh区位于n末端，即vl-连接子-vh。
[0318]
术语“柔性多肽连接子”或“连接子”是指由如甘氨酸和/或丝氨酸残基等单独或组合使用的氨基酸构成的肽连接子，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起；或者连接本发明的car的任何或区。
[0319]
连接肽可以具有多个氨基酸序列中的任一个。蛋白质可以通过通常具有柔性性质的间隔肽连接，但不排除其它化学键。连接子可以是长度介于约6个与约40个氨基酸之间，或长度介于约6个与约25个氨基酸之间的肽。这些连接子可以通过使用合成的、编码连接子的寡核苷酸来偶联蛋白质而产生。可以使用具有一定柔性的肽连接子。连接肽实际上可以具有任何氨基酸序列，记住：合适的连接子将具有产生一般柔性肽的序列。使用如甘氨酸和丙氨酸等小型氨基酸在产生柔性肽方面是有用的。这种序列的产生对于本领域技术人员来说是常规的。
[0320]
合适的连接子可以容易地选择，并且可以是具有任何合适的不同长度，如1个氨基酸(例如，gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包含4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸或7个氨基酸。
[0321]
示例性柔性连接子包含具有序列tgstsgsgkpgsgegs(seq id no：29)的连接子。合适的连接子包含甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包含例如(gs)n、gsggs n(seq id no：117)和gggs n(seq id no：118)，其中n是至少为一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性连接子。在特定实施例中，连接子包括式(g4s)3的甘氨酸聚合物。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是所关注的，因为这些氨基酸中的两个氨基酸都是相对非结构化的，并且因此可以充当组分之间的中性系链。甘氨酸聚合物特别受关注，因为甘氨酸比甚至丙氨酸获得显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基的限制要少得多。示例性柔性连接子包含但不限于ggsg(seq id no：119)、ggsgg(seq id no：120)、gsgsg(seq id no：121)、gsggg(seq id no：122)、gggsg(seq id no：123)、gsssg(seq id no：124)等。普通技术人员将认识到，与上文所描述的任何要素缀合的肽的设计可以包含完全或部分柔性连接子，使得所述连接子可以包含柔性连接子以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分。
[0322]
在另一实施例中，本发明的car进一步包括抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。
[0323]
如本文所使用的，“铰链结构域”、“铰链区”或“间隔子”是指允许结合部分和t细胞膜的分离和柔性的氨基酸区。柔性铰链的长度也允许与相对不可接近的表位更好地结合，例如，较长的铰链结构域允许最佳结合。本领域技术人员将能够确定给定car靶标的适当的铰链。
[0324]
在一些情况下，根据本发明的car的第一多肽包括铰链结构域，其中所述铰链结构域插入在抗原结合结构域与跨膜结构域之间。在一些情况下，铰链结构域是免疫球蛋白重链铰链结构域。在一些情况下，铰链结构域是源自受体的结构域区多肽(例如，cd8源性铰链结构域)。
[0325]
铰链结构域的长度可以为约10个氨基酸至约200个氨基酸，优选地50至150个氨基酸，更优选地75至125个氨基酸。
[0326]
示例性间隔子包含甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包含例如(gs)n、(gsggs)n(seq id no：125)和(gggs)n(seq id no：126)，其中n是至少为一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性连接子。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；gly和ser两者是相对非结构化的，并且因此可以充当组分之间的中性系链。可以使用甘氨酸聚合物，甘氨酸比甚至丙氨酸获得显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基的限制要少得多。示例性间隔子可以包括氨基酸序列，包含但不限于ggsg(seq id no：127)、ggsgg(seq id no：128)、gsgsg(seq id no：129)、gsggg(seq id no：130)、gggsg(seq id no：131)、gsssg(seq id no：132)等。
[0327]
在特定实施例中，连接子包括氨基酸序列gqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdisvewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
(seq id no：116)。
[0328]
在一些情况下，根据本发明的car的第一多肽中的铰链结构域包含至少一个半胱氨酸。例如，在一些情况下，铰链结构域可以包含序列cys-pro-pro-cys(seq id no：133)。如果存在，第一car的铰链结构域中的半胱氨酸可用于与第二car中的铰链结构域形成二硫键。
[0329]
免疫球蛋白铰链结构域氨基酸序列是本领域已知的；参见例如tan等人(1990)《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》87：162；和huck等人(1986)《核酸研究》14：1779。作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链结构域可以包含下列氨基酸序列之一：dktht(seq id no：134)；cppc(seq id no：133)；cpepkscdtpppcpr(seq id no：136)(参见例如glaser等人(2005)《生物化学杂志(j.biol.chem.)》280：41494)；elktplgdttht(seq id no：137)；kscdkthtcp(seq id no：138)；kccvdcp(seq id no：139)；kygppcp(seq id no：140)；epkscdkthtcppcp(seq id no：141)(人igg1铰链)；erkccvecppcp(seq id no：142)(人igg2铰链)；elktplgdtthtcprcp(seq id no：143)(人igg3铰链)；spnmvphahhaq(seq id no：144)(人igg4铰链)；等。
[0330]
铰链结构域可以包括人igg1、igg2、igg3或igg4、铰链结构域的氨基酸序列。与野生型(天然存在的)铰链结构域相比，铰链结构域可以包含一种或多种氨基酸取代和/或插入和/或缺失。例如，人igg1铰链的his 229可以被tyr取代，因此铰链结构域包括序列epkscdktytcppcp(seq id no：145)；(参见例如yan等人(2012)《生物化学杂志》287：5891。
[0331]
铰链结构域可以包括源自人cd8的氨基酸序列；例如，铰链结构域可以包括氨基酸序列：
[0332]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no：146)或其变体。
[0333]
在特定实施例中，铰链结构域是所述cd8铰链结构域。
[0334]
在另一实施例中，本发明的car从n末端到c末端包含：抗p95her2轻链可变结构域、连接子结构域、抗p95her2重链可变结构域、cd8、铰链结构域、cd28跨膜结构域、cd28细胞内共刺激信号传导结构域，随后是cd3ζ细胞内信号传导结构域。
[0335]
在特定实施例中，铰链结构域是所述cd8铰链结构域，所述跨膜结构域是所述cd28跨膜结构域，并且所述细胞内信号传导结构域是cd28共刺激结构域。
[0336]
在特定实施例中，本发明的car包括cd8铰链结构域、cd28跨膜结构域和cd3ζ细胞内信号传导结构域和cd28共刺激结构域。
[0337]
与本发明的car有关的核酸和宿主细胞
[0338]
在第二方面，本发明涉及一种核酸，其编码本发明的所述car。
[0339]
本公开提供了包括编码本发明的任何car的核苷酸序列的核酸。
[0340]
术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)和其聚合物。除非确切地限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸的已知类似物具有与参考核酸的结合能力类似的结合能力并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，特定的核酸序列还意味着经保守修饰的变体(例如，用简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列，以及以直接形式指示的序列。具体地，用简并密码子的取代可以通过产生一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置由具有混合碱基和/或脱氧肌苷残基的残基替代的序列获得。
[0341]
在一些情况下，主题核酸提供例如在哺乳动物细胞中产生本公开的car。在其它情况下，主题核酸提供编码car的核酸的扩增。
[0342]
编码本发明的任何car的核苷酸序列可以与转录控制元件，例如启动子和增强子等可操作地连接。
[0343]
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包含但不限于laci、lacz、t3、t7、gpt、λp和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包含但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期sv40启动子；存在于逆转录病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-i启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。
[0344]
合适的可逆启动子，包含可逆诱导型启动子是本领域已知的。此类可逆启动子可以分离自和源自许多生物体例如真核生物和原核生物中。对源自第一生物体的可逆启动子进行修饰以用于第二生物，例如第一原核生物和第二真核生物、第一真核生物和第二原核生物等，是本领域众所周知的。此类可逆启动子和基于此类可逆启动子但还包括另外的控制蛋白的系统包含但不限于醇调节的启动子(例如，醇脱氢酶i(alca)基因启动子、对醇反式激活蛋白(alcr)具有应答性的启动子等)、四环素调节启动子(例如，包含tetactivators、teton、tetoff等的启动子系统)、类固醇调节启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调节启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)、发病机制相关的调节启动子(例如，水杨酸调节启动子、乙烯调节启动子、苯并噻二唑调控启动子等)、温度调节启动子(例如，热休克诱导型启动子(例如，hsp-70、hsp-90、大豆热休克启动子等)、光调节启动子、合成诱导型启动子等。
[0345]
在一些情况下，通过诱导型系统的诱导，含有合适启动子的基因座或构建体或转基因被不可逆地切换。用于诱导不可逆切换的合适系统是本领域众所周知的，例如，诱导不可逆切换可以利用cre-lox介导的重组。本领域已知的重组酶、核酸内切酶、连接酶、重组位点等的任何合适的组合可以用于产生不可逆可切换启动子。本文其它地方描述的用于进行位点特异性重组的方法、机制和要求可以用于产生不可逆切换的启动子并且是本领域众所周知的。
[0346]
在一些情况下，启动子是cd8细胞特异性启动子、cd4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子或nk特异性启动子。例如，可以使用cd4基因启动子。作为另一实例，可以使用cd8基因启动子。nk细胞特异性表达可以通过使用ncr1(p46)启动子来实现；参见例如，eckelhart等人(2011)《血液》117：1565。
[0347]
在一些实施例中，例如，为了在酵母细胞中表达，合适的启动子是组成型启动子，如adh1启动子、pgk1启动子、eno启动子、pyk1启动子等；或可调节启动子，如gal1启动子、gal10启动子、adh2启动子、pho5启动子、cupl启动子、gal7启动子、met25启动子、met3启动子、cyc1启动子、his3启动子、adh1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、adc1启动子、trp1启动子、ura3启动子、leu2启动子和eno启动子、tp1启动子和aox1(例如，用于毕赤酵母(pichia))。适当的载体和启动子的选择完全在本领域的普通技术人员的水平之内。
[0348]
用于原核宿主细胞的合适的启动子包含但不限于噬菌体t7 rna聚合酶启动子；
trp启动子；lac操纵子启动子；杂交启动子，例如lac/tac杂交启动子、tac/trc杂交启动子和trp/lac启动子、t7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；arabad启动子；体内调节的启动子，如ssag启动子或相关启动子、pagc启动子、nirb启动子等；σ70启动子，例如共有σ70发起子；固定相启动子，例如dps启动子、spv启动子等；源自致病岛spi-2的启动子；acta启动子；rpsm启动子；tet启动子；sp6启动子；等。用于如大肠杆菌等原核生物的合适的强启动子包含但不限于trc、tac、t5、t7和pλ。用于细菌宿主细胞的操纵子的非限制性实例包含乳糖启动子操纵子(laci阻遏蛋白在与乳糖接触时改变构象，从而防止laci阻遏蛋白与操纵子结合)，色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸复合时，trpr阻遏蛋白具有与操纵子结合的构象；在没有色氨酸的情况下，trpr阻遏蛋白具有不与操纵子结合的构象)和tac启动子操纵子。
[0349]
在特定实施例中，编码本发明的car的核酸进一步包括编码前导序列的序列，所述前导序列在核酸表达之后产生相对于car位于n末端的信号序列。
[0350]
如本文所指的术语“前导肽”根据其在本领域中的普通含义使用并且是指长度为约5-30个氨基酸的肽。前导肽存在于形成分泌途径的一部分的新合成的蛋白质的n末端。分泌途径的蛋白质包含但不限于驻留在某些细胞器(内质网、高尔基体(golgi)或核内体)内部、从细胞分泌或插入细胞膜中的蛋白质。在一些实施例中，前导肽形成蛋白质的跨膜结构域的一部分。
[0351]
在一些实施例中，分离的核酸编码从n末端到c末端的蛋白质：前导肽存在于形成分泌途径的一部分的新合成的蛋白质的n末端。分泌途径的蛋白质包含但不限于驻留在某些细胞器(内质网、高尔基体或核内体)内部、从细胞分泌或插入细胞膜中的蛋白质。在一些实施例中，前导肽形成蛋白质的跨膜结构域的一部分。
[0352]
在一些实施例中，分离的核酸从n末端到c编码蛋白质：前导肽、抗p95her2轻链可变结构域、连接子结构域、抗p95her2重链可变结构域、cd8、铰链结构域、cd28跨膜结构域、cd28细胞内共刺激信号传导结构域，随后是cd3ζ细胞内信号传导结构域。
[0353]
在另一实施例中，所述前导序列是cd8前导序列。在特定实施例中，所述前导肽包括序列seq id no：147(malpvtalllplalllhaarp)。
[0354]
在第三方面，本发明涉及一种表达载体，其包括本发明的所述核酸。
[0355]
如本文所使用的，“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是宿主转化和表达引入序列(例如，转录和翻译)的媒剂，意指多核苷酸序列(例如，外源基因)可以引入宿主细胞以促进载体的媒剂，所述载体包含质粒、噬菌体、病毒等。
[0356]
编码本发明的任何car的核苷酸序列可以存在于表达载体和/或克隆载体中。表达载体可以包含选择标志物、复制起点和提供对载体的复制和/或维持的其它特征。合适的表达载体包含例如质粒、病毒载体等。
[0357]
大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；许多是商业上可获得的，用于产生主题重组构建体。通过举例提供了以下载体。细菌：pbs、phagescript、psix174、pbluescript sk、pbs ks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(美国加利福尼亚州拉荷亚市的斯特拉特基因公司(stratagene，la jolla，calif.，usa))；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540和prit5(瑞典乌普萨拉的法玛西亚公司(pharmacia，uppsala，sweden))。真核：pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(斯特拉特基因公司)、psvk3、pbpv、pmsg和psvl(法玛西亚公司)。
[0358]
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中有效的选择性标志物。合适的表达载体包含但不限于：病毒载体，例如基于牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒；腺相关病毒；sv40；单纯性疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒；逆转录病毒载体(例如，鼠类白血病病毒、脾坏死病毒、以及源自于如劳斯肉瘤病毒、哈威肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓及外骨髓增殖的肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒等逆转录病毒的载体)的病毒载体等。
[0359]
如上所述，在一些实施例中，包括本发明的任何car的核酸在一些实施例中将是rna，例如体外合成的rna。用于体外合成rna的方法是本领域已知的；任何已知的方法可以用于合成包括编码本公开的异二聚体、条件活性car的第一和/或第二多肽的核苷酸序列的rna。用于将rna引入宿主细胞中的方法是本领域已知的。将包括编码本公开的异二聚体、条件活性car的第一和/或第二多肽的核苷酸序列的rna引入宿主细胞可以体外或离体或体内进行。例如，宿主细胞(例如，nk细胞、细胞毒性t淋巴细胞等)可以体外或离体用包括编码本公开的异二聚体、条件活性car的第一和/或第二多肽的核苷酸序列的rna进行电穿孔。
[0360]
为了评估car多肽或其部分的表达，要引入到细胞中的表达载体也可以含有选择性标志物基因或报告基因或两者以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴别和选择表达细胞；在其它方面，可选择标志物可以携带在单独的dna片段上并在共转染程序中使用。可选择标志物和报告基因两者均可以侧接适当的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选标志物包含例如抗生素抗性基因，如neo等。报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评价调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物或组织中或不由受体生物或组织表达并且编码对其表达表现为通过一些易于检测到的性质(例如，酶促活性)的多肽的基因。在已经将dna引入到受体细胞中后的适合时间处测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包含编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因。适合的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，将具有最小5
′
侧翼区并示出最高水平的报告基因表达的构建体鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
[0361]
在第十四方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包括本发明的所述核酸或本发明的所述表达载体。
[0362]
术语“宿主细胞”或“工程化细胞”是指通过添加或修饰基因、dna或rna序列、或蛋白质或多肽而被修饰、转化或操作的任何生物体的任何细胞。其也指此类细胞的后代。本发明的宿主细胞或基因工程化细胞包含分离的免疫细胞，如t、nk或nkt细胞，所述细胞含有编码嵌合抗原受体或嵌合抗原受体复合物的dna或rna序列并在细胞表面上表达嵌合受体。分离的宿主细胞和工程化细胞可以用于例如增强nk或nkt细胞活性或t淋巴细胞活性、治疗癌症和治疗感染性疾病。
[0363]
在一实施例中，细胞包括本文所描述的任何car多肽；或编码本文所描述的任何car多肽的核酸是哺乳动物细胞。
[0364]
合适的哺乳动物细胞包含原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包含人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包含但不限于hela细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(atcc)编号ccl-2)、cho细
胞(例如，atcc编号crl9618、ccl61、crl9096)、293细胞(例如，atcc编号crl-1573)、vero细胞、nih 3t3细胞(例如，atcc编号crl-1658)、huh-7细胞、bhk细胞(例如，atcc编号ccl10)、pc12细胞(atcc编号crl1721)、cos细胞、cos-7细胞(atcc编号crl1651)、rat1细胞、小鼠l细胞(atcc编号ccli.3)、人胚胎肾(hek)细胞(atcc编号crl1573)、hlhepg2细胞、hut-78、jurkat、hl-60、nk细胞系(例如，nkl、nk92和yts)等。
[0365]
在一个实施例中，哺乳动物细胞包括本文所描述的任何car多肽。哺乳动物细胞或组织可以源自人、灵长类、仓鼠、兔子、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫，但是可以使用任何其它哺乳动物细胞。在任何方面的优选实施例中，哺乳动物细胞是人。
[0366]
在一些情况下，细胞不是永生化细胞系，而是从个体获得的细胞(例如，原代细胞)。例如，在一些情况下，细胞是从个体获得的免疫细胞。
[0367]
工程化细胞可以从外周血、脐带血、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴结组织或胸腺组织获得。宿主细胞可以包含胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。细胞可以从人、猴子、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种获得。细胞可以从已建立的细胞系获得。
[0368]
上述细胞可以通过任何已知的方法获得。对于工程化细胞的受体，细胞可以是自体、同基因、同种异体或异种。术语“自体”是指源自同一个体的任何材料，所述材料随后将被重新引入到所述个体中。
[0369]
术语“同种异体”是指源自与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不同时，两个或更多个个体被认为是彼此同种异体的。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体材料可能在遗传上完全不同，从而与抗原同类物相互作用。
[0370]
术语“异种”是指源自不同物种的动物的移植物。
[0371]
术语“同基因”是指特别是在抗原或免疫反应方面极其接近的遗传类似性或同一性。同基因系统包含例如器官和细胞(例如癌细胞及其非癌对应物)来自同一个体的模型，和/或器官和细胞来自同一近交系的不同个体动物的模型。
[0372]
在一个实施例中，宿主细胞免疫细胞。
[0373]
如本文所使用的，“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞属于造血细胞并且包含：淋巴细胞，如b细胞和t细胞；自然杀伤细胞；髓样细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和颗粒细胞。在一些实施例中，细胞是t细胞；nk细胞；nkt细胞；淋巴细胞，如b细胞和t细胞；以及髓样细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和颗粒细胞。
[0374]
免疫细胞可以从患有或被诊断患有癌症、浆细胞疾病或自身免疫性疾病或病症的受试者获得。例如，免疫细胞可以从患有癌症的受试者获得，例如多发性骨髓瘤、阴燃性骨髓瘤或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom
′
s macroglobulenemia)。在一些实施例中，免疫细胞从对抗bcma疗法具有抗性的受试者中获得。免疫细胞也可以从同种异体供体获得，所述同种异体供体是与细胞的预期受体相同物种的非遗传相同的个体。
[0375]
可以用于本发明的免疫细胞(例如，人免疫细胞)包含自体细胞，其在离体修饰和扩增之后从稍后将施用所述细胞的受试者获得。例如，免疫细胞可以从患有或被诊断患有癌症、浆细胞疾病或自身免疫性疾病或病症的个体获得。免疫细胞也可以从同种异体供体
获得，所述同种异体供体是与细胞的预期受体相同物种的非遗传相同的个体。用于本发明的免疫细胞包含t细胞和nk细胞。
[0376]
在另一实施例中，宿主细胞是t细胞、自然杀伤(nk)细胞或nkt细胞。
[0377]
术语“t细胞”和“t淋巴细胞”是可互换的并且在本文中可互换使用。实例包含但不限于原初t细胞、中央记忆t细胞、效应子记忆t细胞或其组合。
[0378]
自然杀伤细胞或“nk细胞”是本领域众所周知的。在一个实施例中，自然杀伤细胞包含如nk-92细胞等细胞系。nk细胞系的另外的实例包含nkg、yt、nk-ys、hank-1、yts细胞和nkl细胞。nk细胞可以通过如人类的cd16、cd56和cd8等特异性表面标志物检测。nk细胞不表达t细胞抗原受体、泛t标志物cd3或表面免疫球蛋白b细胞受体。
[0379]
nk细胞在没有gvhd(移植物抗宿主病)的风险下介导抗肿瘤作用，并且相对于t细胞而言寿命较短。因此，nk细胞将在破坏癌细胞之后不久耗尽，减少了对car构建体上可以消融修饰细胞的诱导型自杀基因的需要。
[0380]
自然杀伤t(nkt)细胞共享t细胞和自然杀伤细胞两者的性质的异质t细胞群组。因此，nkt细胞是共表达αβt细胞受体的t细胞亚群，但也表达如nk1等通常与nk细胞相关的各种分子标志物。这些细胞中的许多细胞识别非多态性cd1d分子，所述分子是结合自身和外来脂质和糖脂的抗原呈递分子。所述分子仅占所有外周血t细胞的大约v.1％。自然杀伤t细胞不应与自然杀伤细胞混淆。
[0381]
在某些实施例中，t、nk和nkt细胞源自人外周血单核细胞(pbmc)、白细胞去除术产物(pbsc)、人胚胎干细胞(hesc)、诱导型多能干细胞(ipsc)、骨髓或脐带。
[0382]
在一实施例中，可以用于本发明的免疫细胞(例如，人免疫细胞)包含自体细胞，其在离体修饰和扩增之后从稍后将施用所述细胞的受试者获得。例如，免疫细胞可以从患有或被诊断患有癌症个体获得。免疫细胞也可以从同种异体供体获得，所述同种异体供体是与细胞的预期受体相同物种的非遗传相同的个体。用于本发明的免疫细胞包含t、nk和nkt细胞。
[0383]
用于获得t、nk和nkt细胞的方法是本领域已知的并且可以用于本文所描述的工程化免疫细胞。t、nk和nkt细胞通常从外周血获得，所述外周血通过例如静脉穿刺或通过植入的端口或导管抽取而从受试者收集。任选地，可以通过包含白细胞去除术的方法获得血液，其中从受试者的血液获得白细胞，同时将其它血液成分返回到受试者。使用本领域已知的方法处理血液或白细胞去除术产物(新鲜的或冷冻保存的)以富集t、nk或nkt细胞。例如，可以进行密度梯度离心(使用例如ficoll)和/或逆流离心淘析以富集单核细胞(包含t、nk或nkt细胞)。在一个实例中，对于t细胞，可以进一步进行采用例如涂覆在磁珠上的cd3/cd28抗体或表达例如细胞表面结合的抗cd3和抗cd28抗体片段(参见下文)的人工抗原呈递细胞(aapc)的t细胞刺激步骤，以刺激t细胞并耗尽其它细胞，例如b细胞。富集的t细胞制剂的t细胞然后可以进行基因修饰。
[0384]
作为外周血的替代品，包含骨髓、淋巴结、脾和肿瘤的组织可以用作t细胞和nk细胞的来源。t细胞和nk细胞可以源自人、灵长类、仓鼠、兔子、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫，但是可以使用任何其它哺乳动物细胞。在任何方面的某个实施例中，t或nk细胞是人。
[0385]
如t细胞、nk细胞或nkt细胞等免疫细胞可以从多种来源获得：外周血单核细胞、骨
髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。也可以使用本领域中可用的任何数量的细胞系(例如免疫细胞系，如t细胞系)。
[0386]
在一实施例中，使用如ficoll
tm
分离等本领域已知的任何合适的技术从血液单位获得免疫细胞(例如t、nk或nkt细胞)，所述血液单位从受试者收集。在另一实施例中，通过单采血液成分术获得来自受试者的循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包含t、nk或nkt细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。应当理解，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并且将细胞置于适合的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。例如，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。可替代地，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在没有钙的情况下，初始的活化步骤可能导致活化放大。洗涤步骤可以通过本领域的人员已知的方法来完成，如根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，cobe 2991细胞处理器，巴克斯特公司cytomate(baxter cytomate)或haemonetics公司细胞保存器5(haemonetics cell saver 5))。在洗涤之后，可以将细胞重新悬浮于多种生物相容性缓冲液中，例如，无ca无mg pbs、勃脉力a(plasmalyte a)或具有或不具有缓冲液的其它盐水溶液中。可替代地，可以去除单采血液成分术样品的不期望组分并且将细胞直接重新悬浮于培养基中。
[0387]
在一实施例中，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞，例如，通过percolltm梯度离心或逆流离心淘析从外周血淋巴细胞分离t细胞。特定t细胞亚群，如cd3 、cd28 、cd4 、cd8 、cd45ra 和cd45ro t细胞可以通过本领域已知的阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，可以通过与抗cd3/抗cd28(例如，3
×
28)缀合珠，如m-450cd3/cd28 t温育足以对期望t细胞进行阳性选择的时间段来分离t细胞。另外地或可替代地，可以通过阴性选择来富集t细胞群体，例如通过针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合。可以使用通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择。
[0388]
应当理解，源自要修饰以表达本发明的car的受试者的细胞可以在其使用之前储存一段时间(参见例如下文的治疗方法)。例如，可以冷冻细胞，任选地在洗涤所述细胞之后，或者可以在合适的条件下温育所述细胞以维持所述细胞存活直到需要为止(例如在2-10℃或室温下的旋转器上)。通过这种方式，可以储存细胞直到可能需要所述细胞的此类时间为止。所述细胞可以以未经修饰的状态(即其中所述细胞不表达本发明的car)或以经修饰的状态(即其中所述细胞已经被修饰以表达本发明的car)储存。在用于下文进一步描述的治疗应用之前，通常可以使用本领域已知的方法活化和扩增细胞。例如，t细胞的群体可以通过与和刺激cd3/tcr复合物相关信号的药剂和刺激t细胞的表面上共刺激分子的配体附接的表面接触来扩增。具体地，t细胞群体可以如本文所描述被刺激，如通过与抗cd3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗cd2抗体接触或通过与和钙离子载体结合的蛋白激酶c活化剂(例如苔藓抑素)接触。为了在t细胞的表面上共刺激辅助分子，使用与辅助分子结合的配体。例如，在适合刺激t细胞的增殖的条件下，可以使t细胞群体与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。抗cd28抗体的实例包含可以用作本领域通常已知的其它方法的9.3、b-t3、xr-cd28(法国贝桑松市的diaclone公司(diaclone，besancon，france))。
[0389]
暴露于不同刺激时间的t细胞可能展现出不同的特性。例如，典型的血液或去脂的外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制性t细胞群体(tc，cd8 )大的辅助性t细胞群体(th，cd4 )。通过刺激cd3和cd28受体使t细胞离体扩增产生t细胞群体，所述群体在约8-9天
之前主要由th细胞构成，而在约8-9天之后，t细胞群体包括越来越多的tc细胞群体。因此，根据治疗目的，向受试者输注主要包括th细胞的t细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离出tc细胞的抗原特异性亚群，则在更大程度上扩增该亚群可能是有益的。
[0390]
在特定实施例中，所述t细胞是cd8 t细胞。
[0391]
具体地，本发明的宿主细胞可以在用本发明的多核苷酸或载体转导之前进行扩增。
[0392]
在本发明的另外的方面，t细胞是在给受试者留下功能性t细胞的治疗之后立即从患者获得的。在这方面，注意到在一些癌症治疗，特别是用损害免疫系统的药物进行治疗之后，在患者应该正常从治疗中恢复期间的治疗之后不久，获得的t细胞的质量可能是最佳的或相对于其离体再现能力有所改善。此外，在使用本文所描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的条件，以增强移植和体内繁殖。因此，结合本发明，提供了在该恢复阶段期间产生血细胞，包含t细胞、树突状细胞或造血系的其它细胞。另外，在一些方面，动员模式(例如，使用gm-csf的动员)和特定条件的建立可以用于在受试者中创建条件，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或再现是有利的，尤其是在疗法之后的某个时间窗内。说明性的细胞类型包含t细胞、b细胞、树突状细胞和免疫系统的其它细胞。
[0393]
本公开的工程化细胞还可以包含自杀系统。自杀系统提供了机制，如上文所描述的，由此工程化细胞可以被失活或破坏。此类特征允许对使用工程化细胞的任何治疗进行精确的治疗控制。如本文所使用的，自杀系统提供了机制，通过所述机制，具有自杀系统的细胞可以被失活或破坏。自杀系统是本领域众所周知的。
[0394]
在一个实施例中，自杀系统包含可以被药理学活化以根据需要消除内含细胞的基因。在具体方面，自杀基因对含有多核苷酸或细胞的宿主不产生免疫性。在一个实例中，自杀系统包含导致cd20在工程化细胞的细胞表面上表达的基因。因此，利妥昔单抗(rituximab)的施用可以用于破坏含有所述基因的工程化细胞。
[0395]
在一些实施例中，自杀系统包含表位标签。表位标签的实例包含c-myc标签、cd52链霉亲和素结合肽(sbp)和截短的egfr基因(egfrt)。在该实施例中，表位标签在工程化细胞中表达。因此，针对表位标签的抗体的施用可以用于破坏含有所述基因的工程化细胞。
[0396]
在另一实施例中，自杀系统包含导致截短的表皮生长因子受体在工程化细胞的表面上表达的基因。因此，西妥昔单抗(cetuximab)的施用可以用于破坏含有所述基因的工程化细胞。
[0397]
在另一实施例中，自杀系统包含在工程化细胞的表面上表达的cd52。因此，抗52单克隆抗体(campath，阿仑单抗(alemtuzumab))的施用可以用于破坏含有所述基因的工程化细胞。
[0398]
在另一实施例中，自杀系统包含campath(阿仑单抗)。因此，抗52单克隆抗体(campath)的施用可以在不表达标签或基因的情况下用于破坏工程化细胞，因为car t细胞或t细胞高度表达cd52。
[0399]
在另一实施例中，自杀基因可以包含胱天蛋白酶8基因、胱天蛋白酶9基因、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶(cd)或细胞色素p450。
[0400]
将基因引入细胞中并进行表达的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或
昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
[0401]
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包含磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。
[0402]
用于将所关注多核苷酸引入到宿主细胞中的生物方法包含使用dna和rna载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体已成为用于将基因插入到哺乳动物，例如，人类细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。
[0403]
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包含胶态分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠以及包含水包油乳剂、微团、混合胶束和脂质体的基于脂质的系统。用作体外和体内递送媒剂的示范性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒剂是脂质体。考虑使用脂质调配物将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可以与脂质缔合。可以将与脂质缔合的核酸包封在脂质体的含水内部、散布在脂质体的脂质双层、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子与脂质体连接、捕获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为脂质中的悬浮液而含有、含有微团或与微团复合、或以其它方式与脂质缔合。与脂质、脂质/dna或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何具体结构。例如，所述组合物可以按以下存在：双层结构、微团、“塌陷”结构。所述组合物还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或性状并不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂质或合成脂质的脂肪物质。例如，脂质包含在细胞质中天然存在的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃的化合物及其衍生物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇、和醛的类别。
[0404]
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“dmpc”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司(sigma，st.louis，mo)获得；磷酸二鲸蜡脂(“dcp”)可以从k&k实验室(k&k laboratories)(纽约州普莱恩维尤(plainview,ny))获得；胆固醇(“choi”)可以从calbiochem-behring公司(calbiochem-behring)获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“dmpg”)和其它脂质可以从avanti极性脂质公司(avanti polar lipids，inc.)(阿拉巴马州伯明翰(birmingham，al))获得。脂质于氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。
[0405]“脂质体”是涵盖由封闭的脂质双层或聚集体的生成而形成的各种单层和多层脂质媒剂的通用术语。脂质体可以表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，磷脂会自发形成。脂质成分在形成封闭结构之前进行自我重排，并且在脂质双层之间截留水和溶解的溶质。然而，还涵盖在溶液中具有不同于正常囊泡结构的结构的组合物。例如，脂质可能呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
[0406]
在本公开的一些实施例中，本文公开的任何工程化细胞可通过两种载体引入，每种载体携带不同的car。
[0407]
无论用于将外源多核苷酸引入宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本公开的多核苷酸的方法如何，为了证实重组dna序列存在于宿主细胞中，可以进行多种测定。此类
测定包含例如本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定，如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定，如例如通过免疫学方法(elisa和蛋白质印迹)或通过本文所描述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本公开的范围内的药剂。
[0408]
本发明的scfv、抗原结合结构域和抗体
[0409]
在第五方面，本发明涉及一种scfv，其特征在于：
[0410]-vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：1、2和3的序列或其功能等效变体或seq id no：1、174和3的序列或其功能等效变体，并且
[0411]-vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：4、5和6的序列或其功能等效变体或seq id no：175、5和6的序列或其功能等效变体。
[0412]
在特定实施例中，本发明的所述scfv的所述vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：152、153、154和155的序列或其功能等效变体，并且本发明的所述scfv或抗原结合结构域的所述vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：156、157、158和159的序列或其功能等效变体。
[0413]
在另一实施例中，本发明的所述scfv的所述vh区的fri、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：152、153、154和155、seq id no：19、20、21和22或seq id no：163、164、165和166的序列或其功能等效变体，并且所述vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：156、157、158和159、seq id no：23、24、25和26或seq id no：167、168、169或170的序列或其功能等效变体。
[0414]
在另一实施例中，本发明的所述scfv的所述vl包括seq id no：160或193的序列或其功能等效变体，并且本发明的所述scfv的所述vh包括序列seq id no：161或194或其功能等效变体。
[0415]
在另一实施例中，本发明的所述scfv的所述vl包括seq id no：160、193、27、171或180的序列或其功能等效变体，并且所述vh包括seq id no：161、194、28、172或181的序列或其功能等效变体。
[0416]
在特定实施例中，本发明所述scfv的所述vh区和所述vl区通过包括seq id no：29的连接子区连接。
[0417]
在特定实施例中，所述连接子位于所述抗原结合结构域的所述vh区与所述vl区之间。在一实施例中，所述scfv可以具有结构vh-连接子-vl或vl-连接子-vh。在特定实施例中，所述连接子相对于所述vl区位于c末端并且相对于所述vh区位于n末端，即vl-连接子-vh。
[0418]
在另外的实施例中，本发明的所述scfv包括序列seq id no：162或195或其功能等效变体。
[0419]
在另一实施例中，本发明的所述scfv包括seq id no：162、195、30、173或182的序列或其功能等效变体。
[0420]
在本发明的car的上下文中给出的定义同样适用于本发明的scfv。以类似的方式，本文提供的形成本发明的scfv一部分的cdr的可能的功能等效变体先前已经定义并且同样应用于本发明的情况。
[0421]
在第六方面，本发明涉及一种抗原结合结构域，其特征在于：
[0422]-其具有至少一个vh区和至少一个vl区，
[0423]-所述至少一个vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：7、8和9的序列或其功能等效变体，并且
[0424]-所述至少一个vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：10、11和12的序列或其功能等效变体。
[0425]
在特定实施例中，所述抗原结合结构域的所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：31、32、33和34的序列或其功能等效变体，并且所述抗原结合结构域1的所述至少一个vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：35、36、37和38的序列或其功能等效变体。
[0426]
在另一实施例中，本发明的所述抗原结合结构域的所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：31、32、33和34、seq id no：65、66、67和68或seq id no：73、74、75和76的序列或其功能等效变体，并且本发明的所述抗原结合结构域的所述至少一个vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：35、36、37和38、seq id no：69、70、71、72或seq id no：77、78、79和80的序列或其功能等效变体。
[0427]
在另一实施例中，本发明的所述抗原结合结构域的所述至少一个vl包括序列seq id no：39或其功能等效变体，并且本发明的所述scfv的所述至少一个vh包括序列seq id no：40或其功能等效变体。
[0428]
在另一实施例中，本发明的所述抗原结合结构域的所述至少一个vl包括seq id no：39、54和56的序列或其功能等效变体，并且所述至少一个vh区包括seq id no：40、53和55的序列或其功能等效变体。
[0429]
在特定实施例中，当所述抗原结合结构域是scfv时，则所述vh区和所述vl区通过包括seq id no：29的连接子区连接。
[0430]
在特定实施例中，当所述抗原结合结构域是scfv时，所述连接子位于所述vh区与所述vl区之间。在一实施例中，当所述抗原结合结构域1是scfv时，所述scfv可以具有结构vh-连接子-vl或vl-连接子-vh。在特定实施例中，当所述抗原结合结构域是scfv时，所述连接子相对于所述vl区位于c末端并且相对于所述vh区位于n末端，即vl-连接子-vh。
[0431]
在另外的实施例中，所述抗原结合结构域包括序列seq id no：41或其功能等效变体。
[0432]
在另一实施例中，本发明的所述抗原结合结构域包括seq id no：41、187、188或189的序列或其功能等效变体。
[0433]
在本发明的car的上下文中给出的定义同样适用于本发明的所述抗原结合结构域。以类似的方式，本文提供的形成本发明的所述抗原结合结构域的一部分的cdr的可能的功能等效变体先前已经定义并且同样适用于本发明的情况。
[0434]
在第七方面，本发明涉及一种抗体或其抗体片段，其特征在于：
[0435]-其具有至少一个vh区和至少一个vl区，
[0436]-所述至少一个vh区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：13、14和15的序列或其功能等效变体，并且
[0437]-所述至少一个vl区的cdr1、cdr2和cdr3分别包括seq id no：16、17和18的序列或其功能等效变体或seq id no：179、17和18的序列或其功能等效变体。
[0438]
在特定实施例中，所述抗体或其抗体片段的所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和
fr4分别包括seq id no：42、43、44和45的序列或其功能等效变体，并且所述抗体或其抗体片段的所述至少一个vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：46、47、48和49的序列或其功能等效变体。
[0439]
在另一实施例中，本发明的所述抗体或其抗体片段的所述至少一个vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：42、43、44和45、seq id no：89、90、91和92或seq id no：97、98、99和100的序列或其功能等效变体，并且本发明的所述抗体或其抗体片段的所述至少一个vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括seq id no：46、47、48和49、seq id no：93、94、95和96或seq id no：101、102、103和104的序列或其功能等效变体。
[0440]
在另一实施例中，所述抗体或其抗体片段的所述至少一个vl包括序列seq id no：50或184或其功能等效变体，并且所述抗体或其抗体片段的所述至少一个vh包括序列seq id no：51或其功能等效变体。
[0441]
在另一实施例中，其抗体片段的所述抗体的所述至少一个vl区包括seq id no：50或184、60或62的序列或其功能等效变体，并且所述抗体或其抗体片段的所述至少一个vh区包括序列seq id no：51、59和61的序列和或其功能等效变体。
[0442]
在特定实施例中，当所述抗体或其抗体片段是scfv时，则所述抗体或其抗体片段的所述至少一个vh区和vl区通过包括seq id no：29的连接子区连接。
[0443]
在特定实施例中，当所述抗体或其抗体片段是scfv时，所述连接子位于所述vh区与所述vl区之间。在一实施例中，当所述抗体或其抗体片段是scfv时，所述scfv可以具有结构vh-连接子-vl或vl-连接子-vh。在特定实施例中，当所述抗体或其抗体片段是scfv时，所述连接子相对于所述vl区位于c末端并且相对于所述vh区位于n末端，即vl-连接子-vh。
[0444]
在另外的实施例中，所述抗体或其抗体片段包括序列seq id no：52或186或其功能等效变体。
[0445]
在另一实施例中，其抗体片段的所述抗体包括seq id no：52、186、190或191的序列或其功能等效变体。
[0446]
如本文所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或根据本发明的一些实施例，是指具有与分子的表位(“抗原”)特异性结合的能力的免疫球蛋白分子的片段。天然存在的抗体通常包括四聚体，所述四聚体通常由至少两条重链(h)和至少两条轻链(l)构成。每条重链由重链可变结构域(在本文中缩写为vh)和重链恒定结构域构成，通常由三个结构域(ch1、ch2和ch3)构成。重链可以是任何同种型，包含igg(lgg1、lgg2、lgg3和1gg4亚型)。每条轻链由轻链可变结构域(在本文中缩写为vl)和轻链恒定结构域(cl)构成。轻链包含k链和λ链。重链可变区和轻链可变区通常负责抗原识别，而重链恒定区和轻链恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(c1 q)。vh结构域和vl结构域可以进一步细分为被称为“互补决定区”的高变结构域，所述高变结构域散布有更保守的被称为“框架区”(fr)的序列的结构域。每个vh和vl由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个cdr结构域和四个fr结构域构成：fri-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。重链和轻链的可变结构域含有与抗原相互作用的结合结构域。特别相关的是抗体及其表位结合片段，其已经被“分离”，以便存在于不同于其在自然界中可能存在的物理环境中，或已经被修饰，以便在氨基酸序列上与天然存在的抗体不同。
[0447]
术语“抗体”包括保留一个或多个cdr区的完整单克隆抗体或多克隆抗体或其片段，并且包含人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和非人来源的抗体。
[0448]“单克隆抗体”是针对单个位点或抗原“决定簇”的同质、高度特异性抗体群体。“多克隆抗体”包含针对不同抗原决定簇的异质抗体群体。
[0449]
在具体实施例中，本发明的抗体是非人来源的抗体，优选地为鼠类来源的抗体。在优选实施例中，本发明的抗体是单克隆抗体。
[0450]
众所周知，抗体的基本结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，所述两对相同的多肽链中的每一对多肽链由轻链(25kda)和重链(50-75kda)构成。每条链的氨基末端区包含涉及抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端区包括介导效应子功能的恒定区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。轻链被分类为k或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ和ε，并且其分别将抗体的同种型定义为lgg、lgm、iga、lgd或lge。
[0451]
每对轻链和重链的可变区形成抗体的结合位点。所述结合位点的特征在于相同的一般结构，所述一般结构由被称为框架(fr)的相对保守的区构成，所述框架通过被称为互补决定区(cdr)的三个高变区连接，如在本发明的car的细胞外结构域或抗原结合结构域的上下文中所定义的。
[0452]
本文考虑了定义本发明的抗体或抗原结合结构域的特异性的cdr序列和fr序列的功能等效变体。因此，定义本发明的抗体的cdr和fr的序列的功能等同变体的定义，以及关于在本发明的范围内的所述序列的百分比同一性已经在本发明的car的抗原结合结构域的上下文中定义并且同样适用于本发明的抗体。
[0453]
本领域技术人员将理解，本发明的抗体或抗体片段共享本发明的car的抗原结合结构域2的所有特征，因为其涉及其与特异性抗原，即p95her2肽结合的能力。因此，与p95her2肽的结合有关的本发明的car的抗原结合结构域2的所有细节适用于本文所描述的抗体或抗体片段(因为其指的是其可变区)。
[0454]
如本文所使用的，本发明的抗体不仅涵盖全长抗体(例如，igg)，还涵盖其抗原结合片段，例如fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv片段、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、非人来源的抗体、重组抗体和源自通过基因工程技术生产的免疫球蛋白的多肽，例如单链fv(scfv)、双抗体、重链或其片段、轻链或其片段、vh或其二聚体、vl或其二聚体、通过二硫键(dsfv)稳定的fv片段、具有单链可变区结构域(ab)的分子、小抗体、scfv-fc、vl结构域和vh结构域以及包括抗体的融合蛋白或包括所需特异性抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。本发明的抗体也可以是双特异性抗体。抗体片段可以指抗原结合片段。
[0455]
在特定实施例中，抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、f(ab)、f(ab
′
)、fv、scfv和微型抗体。
[0456]
如本文所使用的，“重组抗体”是包括源自两种不同物种或两种不同来源的氨基酸序列的抗体，并且包含合成分子，例如，包括非人cdr和人框架或恒定区的抗体。在某些实施例中，本发明的重组抗体由重组dna分子产生或合成。
[0457]
本领域技术人员将理解，本发明抗体的氨基酸序列可以包含一个或多个氨基酸取代，使得即使多肽的一级序列被改变，抗体与p95her抗原结合的能力也得以维持。所述取代可以是保守取代，并且通常应用于指示用具有类似性质的另一氨基酸取代一个氨基酸(例
如，用天冬氨酸取代谷氨酸(带负电荷的氨基酸)将是保守的氨基酸取代)。
[0458]
考虑了本文所描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物性质。抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸改变引入编码核酸的抗体中或通过肽合成来制备。此类修饰包含例如抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，其限制条件为最终构建体具有所期望的特性。氨基酸变化还可以改变蛋白质的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置。
[0459]
氨基酸序列插入包含长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包含具有n末端甲硫氨酰残基的肽或与细胞毒性多肽融合的抗体多肽链。分子的其它插入变体包含与延长其血清半衰期的酶或多肽的n末端或c末端的融合。
[0460]
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体的分子中的至少一个氨基酸残基由不同残基替代。最关注抗体的取代诱变的位点包含高变。
[0461]
在特定实施例中，scfv、抗原结合结构域和抗体或其抗体片段是人源化的。
[0462]
术语人源化的在本发明的car的上下文中已经定义并且同样应用于本发明的情况。类似地，本发明的抗原结合结构域和抗体或抗体片段(因为其指的是其可变区并且因此分别等同于抗原结合结构域1和抗原结合结构域2)的合适的人源化序列先前已经在本发明的car的上下文中定义并且同样应用于抗原结合结构域或抗体或其抗体片段。以类似的方式，本发明的scfv可以是人源化的。因此，在特定实施例中，scfv是人源化的，并且更具体地，scfv的vh区和/或vl区是人源化的。
[0463]
在特定实施例中，所述scfv的所述vl区包括选自seq id no：27、171和180的人源化序列或其功能等效变体，并且所述vh包括选自seq id no：28、172和181的人源化序列或其功能等效变体。
[0464]
在另一实施例中，所述scfv包括选自seq id no：30、173和182的人源化序列。
[0465]
在另一实施例中，所述scfv的所述vh区和所述vl区包括人源化fr1、fr2、fr3和fr4区，其中所述vh区的fri、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：19、20、21和22或其功能等效变体，并且所述vl区的fri、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：23、24、25和26或其功能等效变体。
[0466]
在另一实施例中，所述scfv的所述vh区和所述vl区包括人源化fr1、fr2、fr3和fr4区，其中所述vh区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：163、164、165和166或其功能等效变体，并且所述vl区的fr1、fr2、fr3和fr4分别包括序列seq id no：167、168、169和170或其功能等效变体。
[0467]
在另一实施例中，所述scfv的所述vh区包括至少一个人源化fr区、至少2个人源化fr区、至少3个人源化fr区或至少4个人源化fr区。在其它实施例中，人源化fr1、fr2、fr3和fr4区选自fri的seq id no：19或163、fr2的seq id no：20或164、fr3的seq id no：21或165和fr4的seq id no：22和166或任何上述的功能等效变体。
[0468]
在另一实施例中，所述scfv的所述vl区包括至少一个人源化fr区、至少2个人源化fr区、至少3个人源化fr区或至少4个人源化fr区。在其它实施例中，人源化fr1、fr2、fr3和fr4区选自fr1的seq id no：23或167、fr2的seq id no：24或168、fr3的seq id no：25或169
和fr4的seq id no：26和170或任何上述的功能等效变体。
[0469]
本发明还提供了本文公开的scfv、抗原结合结构域或抗体的衍生物。衍生的scfv、抗原结合结构域或抗体可以包括提供靶向性质的任何分子或材料，例如，在某些用途中延长scfv、抗原结合结构域的半衰期。衍生的scfv、抗原结合结构域或抗体可以包括可检测(或标记)残基(例如：与放射性、比色、抗原或酶分子结合的分子、可检测珠(例如：磁性或电子致密(例如：金)珠)或其它分子(例如：生物素或链霉亲和素))，治疗性或诊断性残基(例如：放射性、细胞毒性或药物活性残基)，或增加scfv、抗原结合结构域或抗体对特殊用途的适用性的分子(例如，向施用受试者，例如人类受试者或其它体内或体外用途)。用于衍生scfv、抗原结合结构域或抗体的分子的实例是白蛋白(例如：人血清白蛋白)和聚乙二醇(peg)。scfv、抗原结合结构域或抗体的白蛋白连接的和聚乙二醇化的衍生物可以通过使用本领域广泛已知的技术制备。
[0470]
在一些实施例中，scfv、抗原结合结构域或抗体可以包括标记中的一种或多种。“标记”意指任何可检测材料。对于适当的标记基团的实例，包含但不限于放射性同位素或放射性核素(例如：3h、14c、15n、35s、90y、99tc、1251、131i)、荧光基团(例如：fitc、罗丹明、镧系荧光物质)、酶基团(例如，辣根过氧化物酶、b-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、或由二级报告子识别的某些多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施例中，标记基团通过不同长度的间隔臂与抗体偶联，以减少潜在的空间位阻。标记蛋白质的各种方法是本领域已知的，并且本领域技术人员将为特定目的选择适当的标记和合适的方法。
[0471]
通常，标记可以根据检测方法进行分类：a)放射性或同位素标记；b)磁性标记(例如：磁粉)；c)氧化还原活性残基；d)光学染料；酶基团(例如，辣根过氧化物酶、b-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素基团；和f)或由二级报告子识别的某些多肽表位(例如：亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施例中，标记基团通过不同长度的间隔臂与scfv、抗原结合结构域或抗体偶联，以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的。
[0472]
在一个实施例中，标记包括光学染料，所述光学染料包括但不限于发色团、磷光体和荧光物质。荧光物质可以是小分子荧光材料或蛋白质荧光材料。
[0473]“荧光标记”意指通过材料所具有的荧光性质来检测的任何分子。对于荧光标记的实例，包含但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、茋、荧光黄、瀑布蓝j、德克萨斯红、iaedans、edans、bodipy fl、lc红640、cy 5、cy 5.5、lc红705、俄勒冈绿、alexa-fluor染料(alexa-fluor 350、alexa-fluor 430、alexa-fluor 488、alexa-fluor 546、alexa-fluor 568、alexa-fluor 594、alexa-fluor 633、alexa-fluor 647、alexa-fluor 660、alexa-fluor 680)、瀑布蓝、瀑布黄和r-藻红蛋白(pe)、fitc、cy5、cy5.5和cy7等。
[0474]
蛋白质荧光标记物质包含绿色荧光蛋白，包含但不限于gfp、egfp的海肾(renilla)、ptilosarcus或多管水母属(aequorea)物种(克隆技术实验室公司(clontech labs.，inc.)，基因库登录号u55762)、蓝色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白、b半乳糖苷酶。
[0475]
在第八方面，本发明涉及一种核酸，其编码根据本发明的所述第五方面、所述第六方面和所述第七方面的所述scfv、所述抗原结合结构域或所述抗体。
[0476]
在第九方面，本发明涉及一种表达载体，其包括本发明的所述第八方面的所述核酸。
[0477]
在第十方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包括本发明的所述第八方面的所述核酸或本发明的所述第九方面的所述表达载体。
[0478]
关于与本发明的scfv有关的核酸、表达载体和宿主细胞的定义和特殊性与在本发明的car的上下文中定义的定义和特殊性相同。
[0479]
诊断方法
[0480]
在第十一方面，本发明涉及一种针对患者的癌症诊断方法，所述癌症诊断方法包括：
[0481]
(i)使含有肿瘤细胞的所述患者的样品与本发明的所述scfv1、所述抗原结合1结构域或所述抗体接触；以及
[0482]
(ii)检测所述样品中所述scfv、所述抗原结合结构域或所述抗体与细胞的结合，
[0483]
其中结合的存在指示所述患者患有癌症。
[0484]
如本文所使用的术语“癌症”或“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指涉及不受调节的细胞生长的一大类疾病并且也被称为恶性肿瘤。所述术语通常应用于疾病，其特征在于不受控制的细胞分裂(或存活或凋亡抗性增加)和所述细胞侵袭其它邻近组织(侵袭)并通过淋巴和血管扩散到细胞通常不位于的身体的其它区域(转移)的能力，通过血流循环，并且然后侵袭身体的其它地方的正常组织。根据肿瘤是否可以通过侵袭和转移扩散，肿瘤被分类为良性或恶性：良性肿瘤是不能通过侵袭或转移扩散的肿瘤，即其只在局部生长；而恶性肿瘤是能够通过侵袭和转移扩散的肿瘤。已知与癌症有关的生物过程包含血管生成、免疫细胞浸润、细胞迁移和转移。癌症通常具有以下一些特性：维持增殖信号、逃避生长抑制剂、抵抗细胞死亡、能够复制永生、诱导血管生成和活化侵袭以及最终转移。癌症侵袭身体附近的部位并且也可能通过淋巴系统或血流扩散到身体更远的部位。根据肿瘤细胞相似的细胞类型对癌症进行分类，因此推测这是肿瘤的起源。
[0485]
癌症或肿瘤的实例包含但不限于乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头、颈、卵巢、前列腺、脑、直肠、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、肝胆和肝脏肿瘤。具体地，肿瘤/癌症可以选自以下的组：腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮瘤、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝胆癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、畸胎瘤、肢端雀斑样痣性黑色素瘤、光化性角化腺癌、腺样囊性癌、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞肿瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、支气管腺癌、癌肉瘤、胆管癌、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜肉瘤、swing肉瘤、局灶性结节增生、生殖细胞瘤、胰高血糖素瘤、血管母细胞瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、胰岛素瘤、上皮内瘤形成、上皮间鳞状细胞瘤、侵袭性鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤、髓上皮瘤、粘液表皮样癌、神经上皮腺癌、结节性黑色素瘤、乳头状浆液性腺癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、浆液性癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌瘤、鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑色素瘤、疣状癌、舒血管肠肽瘤、维耳姆斯瘤(wilm
′
s tumor)。
[0486]
在特定实施例中，癌症是乳腺癌。在优选实施例中，癌症是p95her2阳性癌症。
[0487]
术语“p95her2”和her2已经在本发明的car的上下文中定义并且所述定义同样应用于本诊断方法。
[0488]“p95her2阳性的癌症”是指如通过免疫组织化学(ihc)、蛋白质印迹或测定(monogram生物科学公司(monogram biosciences))所确定的其中至少一部分癌细胞含有p95her2的癌症。在一些实施例中，通过ihc确定癌症为p95her2阳性。在一些此类实施例中，使用在sperinde等人，《临床癌症研究(clin.canc.res.)》，2010，16(16)：4226-4235中描述的方法，如使用veratag测定中的抗p95抗体克隆d9的方法确定癌症为p95her2阳性。在一些实施例中，使用美国专利第8,389,227b2号中描述的方法，如使用由以登录号dsm acc2904或dsm acc2980保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(deutschland sammlung von mikroorganismen and zellen)的杂交瘤细胞系产生的抗体的方法确定癌症为p95her2阳性。在一些实施例中，根据测定制造商或测定实验室的指南确定癌症为p95her2阳性。p95her2是指羧基末端her2片段的集合，在一些实施例中，所述片段可以分为95至100kda片段和100至115kda片段。参见例如arribas等人，《癌症研究(cancer res.)》，2011，71：1515-1519。在一些实施例中，p95her2阳性的癌症含有her2的100至115kda片段。
[0489]
术语“检测”、“诊断(diagnosing)”、“诊断(diagnosis)”或这些词的派生词在本文中不加区分地使用并且是指对病理病状的存在或特性的鉴定。所述鉴定既指试图确定和/或鉴定受试者的可能的疾病的过程，即诊断程序，也指通过该过程得出的意见，即诊断意见。如此，所述鉴定也可以被视为尝试，将个体的病状分类为单独和不同的类别，以便做出关于治疗和预后的医疗决定。如本领域技术人员将理解的，此类诊断对于100％待诊断的受试者可能不是正确的，尽管其是优选的。然而，在本发明的上下文中，所述术语要求受试者的统计学上显著的部分可以被鉴定为患有癌症。本领域技术人员可以使用众所周知的不同统计评估工具，例如通过确定置信度区间、p值确定、斯图登氏测试(student
′
s-test)、曼-惠特尼(mann-whitney)等确定一方是否具有统计学上的显著性。优选置信度区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。p值优选地为0.015、0.001、0.0005或更小。
[0490]
通常，所述方法包含获得疑似表达p95her2抗原的样品，并在有效允许形成免疫复合物的条件下，使样品与能够与p95her2抗原选择性结合或对其进行检测的scfv、抗原结合结构域或抗体接触。
[0491]
样品可以是疑似含有p95her2抗原的任何样品，例如组织切片或样本、匀浆组织提取物、细胞、细胞器、分离和/或纯化形式的任何上述含抗原组合物，或任何生物流体，包含血液、血清和血浆。在优选实施例中，样品是肿瘤样品。样品优选地为“肿瘤样品”，其是源自或包括来自患者肿瘤的肿瘤细胞的样品。本文中的肿瘤样品的实例包含但不限于肿瘤活检、循环肿瘤细胞、循环血浆蛋白、腹水、源自肿瘤或表现出肿瘤样性质的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，如福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻肿瘤样品。
[0492]
在合适且有效的条件下使所选生物样品与本发明的抗体接触并且持续足以允许形成免疫复合物的时间段通常只需将本发明的scfv1、抗原结合结构域1或抗体添加到样品中并将混合物温育足够长的时间段使抗体形成免疫复合物。
[0493]
有效条件优选地包含用如bsa、牛丙种球蛋白(bgg)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)/tween等溶液稀释本发明的样品和/或scfv1、抗原结合结构域1或抗体。这些添加的药剂也
有助于减少非特异性背景。
[0494]“合适的”或“充分的”条件还意味着温育的温度或时间段足以使其有效结合。温育步骤通常为约1小时至2小时至4小时左右，温度优选地为约25℃至27℃，或者可以在约4℃左右过夜。
[0495]
可以用多种方法来确定形成的复合物的量。在优选实施例中，抗体被标记，并直接确定结合。例如，这可以通过将p95her2抗原蛋白附着到固相载体上，添加标记的scfv、抗原结合结构域或抗体(例如荧光标记)，洗去多余的药剂，并确定标记是否存在于固相载体上来完成。如本领域已知的，可以利用各种封闭和洗涤步骤。
[0496]
通常，对免疫复合物形成的检测是本领域众所周知的并且可以通过应用许多方法来实现。这些方法通常基于对如那些放射性、荧光、生物和酶标签中的任何一种等标记或标志物的检测。当然，如本领域已知的，可以通过使用如第二抗体和/或生物素/亲和素配体结合布置等次级结合配体发现另外的优势。
[0497]
在特定实施例中，本发明的scfv1、抗原结合结构域1或抗体布置在固相载体上。
[0498]
如其它抗原结合结构域或抗体等scfv或其它多肽可以被固定在各种固相载体上用于测定。可以用于固定特异性结合成员的固相包含在固相结合测定中开发和/或用作固相的那些固相。合适的固相的实例包含膜过滤器、基于纤维素的纸、珠(包含聚合物、乳胶和顺磁性颗粒)、玻璃、硅片、微粒、纳米颗粒、tentagel、agrogel、pega凝胶、spocc凝胶和多孔板。可以通过将scfv、抗原结合结构域或抗体或其多个以阵列的形式涂覆在固相载体上来制备测定条。然后可以将该条浸入测试样品中，并且然后通过洗涤和检测步骤快速处理，以产生如色斑等可测量信号。如其它抗原结合结构域或抗体等scfv或其它多肽可以通过与测定装置表面直接缀合或通过与测定装置表面间接结合而与到测定装置的特定区域结合。
[0499]
如本领域技术人员将理解的，有多种可以用于本发明的常规测定，其使用未标记的本发明的scfvl、抗原结合结构域1或抗体(一级抗体)和标记的本发明抗体(二级抗体)；这些技术包含蛋白质印迹或免疫印迹、elisa(酶联免疫吸附测定)、ria(放射免疫测定)、竞争性eia(竞争性酶免疫测定法)、das-elisa(双抗体夹心-elisa)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、流式细胞术或基于使用包含本发明的scfv1、抗原结合结构域1或抗体的蛋白质微球、生物芯片或微阵列的多重检测技术。使用本发明的抗体检测和定量p95her2抗原的其它方法包含亲和色谱法技术、配体结合测定或凝集素结合测定。
[0500]
还应当理解，未标记的scfv、抗原结合结构域或抗体需要用另外的药剂，例如，标记的二级抗体检测，其将被标记。这对于提高检测方法的灵敏度特别有用，因为其允许信号被放大。
[0501]
另外，也可以通过检测样品中物理性质的变化来进行抗体的检测，所述物理性质的变化是抗体与其同源抗原结合的结果。这些测定包含确定样品中的透射相关参数，这是本领域已知的。如本文所使用的术语“透射相关参数”涉及指示样品的透射光与入射光的比率或与其相关的参数，或者涉及由此得出的参数。
[0502]
在一实施例中，通过比浊法或浊度法确定透射相关参数。
[0503]
在另一实施例中，可以通过表面等离子共振(spr)检测scfv、抗原结合结构域或抗体与其同源抗原的结合。
[0504]
如本文所使用的，spr是指当激光束照射到金属薄膜时，反射光的强度在特定入射
角(即，共振角)急剧降低的现象。spr是基于上文所描述的现象的测量方法并且能够以高灵敏度测定吸附在作为传感器的金属薄膜的表面上的物质。根据本发明，例如，然后可以通过预先将一种或多种根据本发明的scfv、抗原结合结构域或抗体固定在金属薄膜的表面上，允许样品通过金属薄膜的表面，并且检测在样品通过之前和之后由于scfv、抗原结合结构域或抗体与靶抗原的结合而在金属薄膜的表面上吸附的物质的量的差异来检测样品中的靶物质。
[0505]
在一实施例中，通过任何上述相关技术或本领域已知的任何其它技术测量的结合的存在指示患者患有癌症。
[0506]
在另一实施例中，本发明的诊断方法包括将在研究中的受试者中获得的水平与参考值进行比较，由此，p95her2水平相对于参考值的增加指示患者患有癌症。
[0507]
相对于p95her2水平的术语“增加”涉及使用根据本发明的scfvl、抗原结合结构域1或抗体在样品中检测到的低于参考值的任何p95her2表达水平。因此，当p95her2表达水平比其参考至低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更高时，认为所述表达水平降低或低于其参考值。
[0508]
如本文所使用的术语“参考值”涉及用作用于评估从受试者收集的样品获得的值或数据的参考的预定标准。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列值；平均值；中值；均值；或与特定对照或基线值相比的值。参考值可以基于单个样品值，例如，从被测试受试者的样品获得的值，但在较早的时间点。参考值可以基于大量样品，如来自时间年龄匹配组的受试者群体，或者基于包含或不包含待测试样品的样品池。在一个实施例中，参考值与在健康受试者中确定的p95her2表达水平相对应，由此健康受试者被理解为在确定p95her2表达水平时没有表现出增殖性疾病，并且优选地没有表现出癌症史的受试者。
[0509]
在另一实施例中，参考值与根据从一组患者获得的样品池确定的p95her2表达的平均或均值水平相对应，所述患者从临床角度来看是有充分记录的，并且没有表现出疾病，尤其是没有患上癌症，尤其是没有患上p95her2阳性癌症。在所述样品中，可以确定表达水平，例如通过确定参考群体的平均表达水平。在确定参考值时，有必要考虑样品类型的一些特性，如年龄、性别、身体状态或患者的其它特性。例如，参考样品可以从相同数量的至少2个、至少10个、至少100个至超过1000个个体的组中获得，使得所述群体具有统计学上的显著性。
[0510]
如本文所使用的术语“表达”或“表达水平”是指蛋白质或抗原的可测量的量。如本领域技术人员所理解的，可以通过测量蛋白质或抗原来定量表达水平。因此，在本发明的情况下，通过确定p95her2抗原与本发明的scfv1、抗原结合结构域1或抗体之间形成的免疫复合物的量来测量p95her2的表达水平，并且可以通过上文相关的和技术人员已知的多种方式来进行。
[0511]
药物组合物
[0512]
在第十二方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的所述第四方面的所述宿主细胞和/或根据本发明的所述第五方面、所述第六方面和所述第七方面的scfv1、抗
原结合结构域1或抗体中的任何一种以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0513]
术语“药物组合物”是这样的形式，即允许包含在其中的活性成分的生物活性有效并且对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性。指不含另外的成分的调配物。
[0514]“药学上可接受的载体”是指药物组合物的除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包含但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0515]
在特定实施例中，药物组合物包括本发明的宿主细胞，更具体地，免疫细胞(例如t、nk或nkt细胞)，所述免疫细胞已经被基因工程化以表达本发明的任何car，即包括scfv1、抗原结合结构域1、抗原结合结构域2或其任何组合的car。在另一实施例中，本发明的药物组合物包括本发明的scfv1、抗原结合结构域1或抗体。在另一实施例中，药物组合物包括宿主细胞和本发明的scfv1、抗原结合结构域1或抗体两者。
[0516]
可以通过将具有期望的纯度的活性成分与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合以冻干调配物或水溶液的形式制备如本文所描述的药物组合物和调配物(《雷明顿氏药物科学(remington
′
s pharmaceutical sciences)》第22版，2012)。药学上可接受的载体通常在所采用剂量和浓度下对受体无毒，并且包含但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和包含葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化合物；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；金属复合物，例如zn-蛋白质复合物；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(peg)。本文的示范性药学上可接受的载剂进一步包含间质性药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuph20(百特国际公司(baxter international，inc.))。
[0517]
治疗方法
[0518]
本发明提供了用于免疫疗法的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的scfv1、抗原结合结构域1、抗体或免疫细胞。在一个实施例中，通过转移引起免疫应答的免疫细胞群体来治疗医学疾病或病症。
[0519]
因此，在第十三方面，本发明涉及本发明的所述第四方面的所述宿主和/或本发明的所述第五方面、所述第六方面和所述第七方面的所述scfv1、所述抗原结合结构域1或所述抗体中的任何一种，其用于医学中。
[0520]
在最后一个方面，本发明涉及本发明的所述第四方面的所述宿主细胞和/或本发明的所述第五方面、所述第六方面和所述第七方面的所述scfv1、抗原结合片段1或所述抗体中的任何一种，其在预防或治疗癌症的方法中使用。
[0521]
在特定实施例中，癌症是乳腺癌。在优选实施例中，癌症为p95her2阳性的。
[0522]
如本文所使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗”或“改善(amelioration)”。所述术语是指治疗性治疗，其目的是逆转、减轻、抑制、延迟或停止与疾病或病症相关的病状的进展或严重程度。术语“治疗”包含减轻或缓解病状的至少一种副作用或病状，如癌症、疾病或病症。当减轻了一种或多种症状或临床标志物时，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果延迟或停止了疾病进展，则治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包含改善症状或标志物，还包含中断指示在没有治疗的情况下预期的症状的进展或恶化的至少一种病状。无论是否可检测，有益或期望的临床结果是一种或多种症状的减轻、疾病程度的减轻、疾病的稳定病状(即，未恶化)、疾病。这些包含但不限于进展延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻以及缓解(部分或全部)。疾病的术语“治疗”还包含缓解疾病的症状或副作用(包含对症治疗)。在一些实施例中，治疗癌症包含减少肿瘤体积、减少癌细胞数量、抑制癌症转移、延长寿命、减少癌细胞生长、减少细胞存活或减少癌症状态。其涉及各种生理症状的改善。
[0523]
在本公开的某些实施例中，将免疫细胞递送到有需要的个体，如患有癌症的个体。然后，所述细胞增强个体的免疫系统，以攻击相应癌症细胞。在一些情况下，为个体提供一个或多个剂量的免疫细胞。在为个体提供两个或更多个剂量的免疫细胞的情况下，施用之间的持续时间应足以允许在个体中进行繁殖的时间，并且在具体实施例中，剂量之间的持续时间为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天。
[0524]
在一些实施例中，可以在免疫细胞疗法之前向受试者施用非清髓性淋巴细胞清除化学疗法。非清髓性淋巴细胞清除化学疗法可以是可以通过任何合适的途径施用的任何合适的此类疗法。例如，非清髓性淋巴细胞清除化学疗法可以包括环磷酰胺和氟达拉滨的施用，尤其是如果癌症是可能是转移性的黑色素瘤。环磷酰胺和氟达拉滨的示例性施用途径是静脉内施用。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面，施用约60mg/kg的环磷酰胺两天，之后施用约25mg/m2的氟达拉滨五天。
[0525]
在某些实施例中，促进免疫细胞生长和活化的生长因子与免疫细胞一起或随后向受试者施用免疫细胞。免疫细胞生长因子可以是促进免疫细胞生长和活化的任何合适的生长因子。合适的免疫细胞生长因子的实例包含白细胞介素(il)-2、il-7、il-15和il-12，其可以单独使用或以各种组合使用，如il-2和il-7、il-2和il-15、il-7和il-15、il-2、il-7和il-15、il-12和il-7、il-12和il-15或il-12和il2。
[0526]
治疗有效量的免疫细胞可以通过多种途径施用，包含肠胃外施用，例如静脉内、腹腔内、肌肉内、胸骨内或关节内注射或输注。
[0527]
免疫细胞群体可以以与疾病一致的治疗方案施用，例如在一天至几天内单次或几次剂量以改善疾病状态，或在延长的时间内周期性剂量以抑制疾病进展并防止疾病复发。调配物中要采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重度，并且应根据实践者的判断和每个患者的情况来决定。免疫细胞的治疗有效数量将取决于所治疗的受试者、患病的严重程度和类型以及施用的方式。在一些实施例中，免疫细胞的治疗有效数量可以为约5
×
106个细胞/kg体重至约7.5
×
108个细胞/kg体重，如约2
×
107个细胞至约5
×
108个细胞/kg体重或约5
×
107个细胞至约2
×
108个细胞/kg体重。本领域技术人员可以很容易基于受试者的年龄、体重、性别和生理条件来确定免疫细胞的确切数量。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-应答曲线外推出有效剂量。
[0528]
在某些实施例中，本实施例的组合物和方法涉及免疫细胞群体或scfv与至少一种另外的疗法的组合。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、dna疗法、病毒疗法、rna疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以呈辅助或新辅助疗法的形式。
[0529]
在一些实施例中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施例中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如旨在减少治疗副作用的发生和/或严重程度的药剂，如抗恶心剂等)。在一些实施例中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施例中，另外的疗法是手术。在一些实施例中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施例中，另外的疗法是γ放射。在一些实施例中，另外的疗法是靶向pbk/akt/mtor途径、hsp90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂的疗法。另外的疗法可以是本领域已知的化学治疗剂中的一种或多种。
[0530]
本发明的药物组合物或本发明的免疫细胞疗法可以相对于如免疫检查点疗法等另外的癌症疗法在之前、期间、之后或以各种组合施用。施用的时间间隔的范围可以为同时到几分钟到几天到几周。在其中免疫细胞疗法是与另外的治疗剂分开提供给患者的一些实施例中，通常会确保在每次递送之间不会超过显著的时间段，这样两种化合物仍将能够对患者发挥有利的组合作用。在此类情况下，经考虑，可以在彼此约12至24或72小时内并且更具体地在彼此约6-12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可以期望显著延长治疗时间段，其中在相应施用之间需要若干(2天、3天、4天、5天、6天或7天)天至若干(1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周)周的时间。
[0531]
可以采用各种组合。对于以下实例，本发明的药物组合物或免疫细胞疗法是“a”并且抗癌疗法是“b”：
[0532]
a/b/a b/a/b b/b/a a/a/b a/b/b b/a/a a/b/b/b b/a/b/b
[0533]
b/b/b/a b/b/a/b a/a/b/b a/b/a/b a/b/b/a b/b/a/a
[0534]
b/a/b/a b/a/a/b a/a/a/b b/a/a/a a/b/a/a a/a/b/a
[0535]
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本实施例的任何化合物或疗法将遵循施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施例中，存在监测归因于组合疗法的毒性的步骤。
[0536]
多种化学治疗剂可以与本发明的药物组合物或免疫细胞疗法组合使用。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据其在细胞内的活性模式进行分类，例如，其是否以及在什么阶段影响细胞周期。可替代地，可以基于药剂与dna直接交联、插入dna或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征药剂。
[0537]
化学治疗剂的实例包含烷化剂，如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲胺，包含六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番蒸枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包含合成的类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；cc-1065(包含其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(具体地是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包含合成类
似物kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosourea)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γii和卡奇霉素ωii)；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素a；二膦酸盐类(bisphosphonate)，如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包含吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)，如丝裂霉素c、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟脲嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostano1)、美雄烷(mepitiostane)和美雄烷(testolactone)；抗肾上腺类，如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百垂布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依落氟鸟氨酸(elformthine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；
羟基脲(1entinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；psk多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根瘤毒素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2
′
，2
″‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是t-2毒素、疣孢菌素a(verracurin a)、杆孢菌素a(roridina)和蛇形菌素(anguidine))；尿烷(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“ara-c”)；环磷酰胺；紫杉烷，例如，紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛吉西他滨(docetaxel gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂配位复合物，如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitroxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，cpt-11)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylomithine，dmfo)；维甲酸，如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴肼(procarbazine)、光辉霉素(plicamycin)、吉西他滨(gemcitabine)、诺维本(navelbine)、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)以及上述药物中的任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0538]
***
[0539]
将通过以下实例来描述本发明，所述实例仅被认为是说明性的，而不是对本发明范围的限制。
[0540]
实例
[0541]
方法
[0542]
car载体设计和产生
[0543]
合成编码p95her2 car的载体质粒(h32h2、214d8、h1 214d8、h2 214d8、h3 214d8、215c2、h1 215c2、h2 215c2)并将其克隆到pmsgv-1逆转录病毒载体(荷兰的金斯瑞公司(genscript，netherlands))中。然后，产生p95her2 car、her2 car和空(utd)car逆转录病毒的原种。简而言之，将0.7μg包膜质粒(rd-114)和1.5μg转移质粒(p95her2、her2、pmsgv-1中的空car)共转染到gp-293细胞(#631458，clontech公司(clontech))中。在2天和3天之后，收集含有逆转录病毒颗粒的细胞上清液并在-80℃下储存用于将来的转导。
[0544]
car t细胞的转导和扩增
[0545]
在转导之前，用10ng/ul的α-cd3(okt3)(#16-0037-85，赛默飞世尔公司(thermo-fisher))和300u/ml的il-2(#703892-4，诺华公司(novartis))刺激pbmc 48小时。然后，将含有逆转录病毒颗粒的细胞上清液解冻，并在纤维连接蛋白(#t100a，宝生物公司(takara))涂覆的6孔板中以2000g离心2小时。接下来，在顶部添加2
×
106个刺激的pbmc并
以400g离心10分钟。在5天之后，进行car表达和细胞毒性测定。用空car逆转录病毒转导未经转导的t细胞(utd)。
[0546]
car表达分析
[0547]
将0.2
×
106个car t用1xpbs洗涤两次并在1xpbs、2.5mm edta、1％bsa和5％马血清中重新悬浮20分钟。然后，将细胞用1/20生物素抗igg(#115-065-072，杰克逊免疫研究所实验室(jackson immunoresearch))染色30分钟并用1xpbs洗涤两次。添加1/150和1/300抗cd3-pe(#300408，百进生物公司(biolegend))的apc-链霉亲和素抗体(#405207，百进生物公司)30分钟。zombie aqua(#423101，百进生物公司)用作1：1000稀释度的活力标志物。在facscelesta(bd生物科学公司(bd bioscience))上测量car表达并用flowjo软件分析。
[0548]
car t细胞毒性测定
[0549]
将cfse标记的mcf10a p95her2/空细胞与car t细胞在96孔平底板中以所指示的e：car t比率共培养。在温育48小时之后，将细胞混合物用1xpbs洗涤并重新悬浮于1xpbs、2.5mm edta、1％bsa和5％马血清中20分钟。然后，将细胞用1∶1000稀释度的zombie aqua(#423101，百进生物公司)染色作为活力标志物。在lsr fortessa(bd生物科学公司)上计数cfse阳性细胞并用flowjo软件分析。
[0550]
体内模型
[0551]
用3
×
106个mcf7p95her2/亲代细胞原位注射nsg小鼠。一旦肿瘤体积达到300mm3，每7-10天用3
×
106个car t细胞对动物进行静脉内(i.v.)治疗，最多4次剂量。在mcf7p95her2细胞的情况下，将小鼠维持在饮用水中存在多西环素(1g/l)的条件下。
[0552]
结果
[0553]
实例1：人源化32h2 p95her2 car
[0554]
在公布为wo/2010/000565的pct申请中已经公开了抗p95her2抗体32h2。最初，抗p95her2抗体32h2的单链片段可变(scfv)用于产生32h2分裂的p95her2 car的两个版本。
[0555]
32h2 p95her2 car的两个版本在32h2抗体的单链片段可变(scfv)的轻可变区(vl)和重可变区(vh)的布置顺序方面不同(图2a)。两个32h2 p95her2 car含有在car序列的开头处的cd8前导序列(malpvtalllplalllhaarp seq id no：147)、可变区之间的连接子(tgstsgsgkpgsgegs seq id no：29)、cd8铰链结构域，cd28跨膜和共刺激结构域以及cd3ζ结构域。靶向全长her2的基于曲妥珠单抗的car用作阳性对照(图2a)。
[0556]
在细胞表面没有检测到产生的32h2 p95her2 car(图2b)。因此，两个32h2 p95her2 car t不起作用，表现为缺乏对表达p95her2的mcf10a细胞的杀伤(图2c)。
[0557]
32h2的scfv是人源化的，产生vh和vl的两种人源化版本，这取决于人源化等级(表1)。
[0558][0559][0560]
表1：不同的人源化32h2版本的重可变区和轻可变区的氨基酸序列h1：人源化版本1；h2：人源化版本2。
[0561]
产生了人源化32h2 p95her2 car的四个版本，其在轻可变区(vl)和重可变区(vh)的布置顺序以及使用的人源化版本(h1或h2)方面不同。四个人源化32h2 p95her2 car含有在car序列的开头处的cd8前导序列、可变区之间的连接子、cd8铰链结构域、cd28跨膜和共刺激结构域以及cd3ζ结构域。(图3a)。与其余人源化32h2 p95her2 car版本(图3b)相比，vl-vh h1 32h2 p95her2 car在细胞表面表达(图3b，4b)。因此，vl-vh h1 32h2 p95her2 car用于另外的实验并且被命名为人源化32h2(h32h2)p95her2 car。
[0562]
在另外的实验中，h32h2 p95her2可以在细胞表面以与基于曲妥珠单抗的car类似的水平表达(图4b)。此外，与表达p95her2的mcf10a细胞共培养的h32h2 p95her2 car t诱导了特异性细胞毒性效应(图4c)，尽管在靶细胞：car t细胞的高比率下效果明显。相比之下，h32h2 p95her2car t对mcf10a细胞没有任何影响(图4d)，表明其对p95her2具有特异性。
[0563]
实例2：214d8 p95her2 car
[0564]
214d8 p95her2 car由抗p95her2抗体214d8的scfv产生，所述抗体已经在公开为us2011/0135653的美国专利申请中公开，所述美国专利申请的内容通过引用整体并入本文。
[0565]
开发了214d8 p95her2 car的两个版本，其在214d8抗体的轻可变区(vl)和重可变区(vh)的布置顺序方面不同(表2，图5a)。两个214d8p95her2 car含有cd8前导序列、连接子、cd8铰链结构域、cd28跨膜和共刺激结构域以及cd3ζ结构域。
[0566]
两个214d8 p95her2 car在细胞表面表达，vl-vh 214d8 p95her2car表达水平更高(图5b)。与表达p95her2的mcf10a细胞共培养的vl-vh 214d8 p95her2 car t甚至以靶细胞：car t细胞的低比率诱导高细胞毒性效应(图5c)。
[0567][0568][0569]
表2：214d8抗p95her2抗体的重可变区和轻可变区的氨基酸序列。
[0570]
还已经获得214抗p95her2的重可变区和轻可变区的人源化版本，如表3所示。
[0571][0572]
表3：不同的人源化214抗p95her2版本的重可变区和轻可变区的氨基酸序列。
[0573]
人源化214抗p95her2 car版本在细胞表面表达(图6b)，并且至少h1214和h2214人源化car版本甚至以靶细胞：car t细胞的低比率诱导高细胞毒性效应(图6d)。另外，如图6c所示，人源化scfv版本的使用产生对p95her2更具特异性的car t，因为与非人源化版本相比，表达正常水平her2的细胞的杀伤减少。
[0574]
实例3：215c2 p95her2 car
[0575]
215c2 p95her2 car由抗p95her2抗体215c2的scfv产生。
[0576]
开发了215c2 p95her2 car的两个版本，其在215c2抗体的轻可变区(vl)和重可变区(vh)的布置顺序方面不同(表4，图7a)。两个215c2 p95her2 car含有cd8前导序列、连接子、cd8铰链结构域、cd28跨膜和共刺激结构域以及cd3ζ结构域。
[0577]
两个215c2 p95her2 car在细胞表面表达，vl-vh 215c2 p95her2 car表达水平更高(图7b)。此外，与表达p95her2的mcf10a细胞共培养的vl-vh 215c2 p95her2 car t以靶细胞：car t细胞的低比率诱导高细胞毒性效应(图7c)。
[0578]
[0579]
表4：215c2抗p95her2抗体的重可变区和轻可变区的氨基酸序列
[0580]
还已经获得215抗p95her2的重可变区和轻可变区的人源化版本，如
[0581]
表5所示。
[0582][0583]
表5：不同的人源化215抗p95her2版本的重可变区和轻可变区的氨基酸序列。
[0584]
人源化215抗p95her2 car版本h1和h2在细胞表面表达(图8b)，其也甚至以靶细胞：car t细胞的低比率诱导高细胞毒性效应(图8c)。另外，如图8d所示，人源化scfv版本的使用产生对p95her2更具特异性的car t，因为与非人源化版本相比，表达正常水平her2的细胞的杀伤减少。
[0585]
实例4：m215源性p95her2 car t对体内p95her2阳性肿瘤牛长的影响。
[0586]
用mcf7p95her2细胞原位植入nsg小鼠。当肿瘤达到大约300mm3时，用3
×
106个m215源性p95her2 car t细胞或utd t细胞处理动物。在三轮car t细胞治疗之后，实现了肿瘤的完全缓解(图9a)。此外，在三十五天的治疗之后检测到循环中的人cd3 细胞，这表明适当的car t持久性。
[0587]
实例5：h1 214源性p95her2 car t对体内p95her2阳性肿瘤和p95her2阴性肿瘤生长的影响。
[0588]
用mcf7p95her2细胞或mcf7细胞原位植入nsg小鼠。当肿瘤达到大约300mm3时，用3
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106个h1 214 p95her2 car t细胞或utd t细胞处理小鼠。当肿瘤表达p95her2时，在两轮h1 214 car t细胞治疗之后，肿瘤得到完全缓解(图10a)，这表明h1 214源性p95her2 car t细胞的高效性。另外，当肿瘤不表达p95her2但表达正常水平的her2时，未观察到对肿瘤生长的影响(图10d)，这表明h1214源性car t对p95her2具有非常高的特异性。此外，与utd组相比，仅当肿瘤表达p95her2时，第二剂量之后10天的循环人cd3 细胞水平增加(图10b)，而在mcf7肿瘤中没有增加(图10e)，这表明只有在存在同源抗原的情况下，car t才会适当且特异性地扩增(图10b)。该结果与肿瘤中人cd3 的水平相关，因为与对照组(utd)相比，仅在mcf7p95her2肿瘤中观察到cd3 细胞的浸润增加(图10c)，而在表达her2的正常mcf7肿瘤中未观察到(图10f)。